潘彥羽　代嫣然　王飛華　梁　威

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

隨著人口的增長以及經濟的快速發(fā)展, 大量氮磷等營養(yǎng)元素及有機污染物未經處理即匯入淡水生態(tài)系統[1], 致使其生態(tài)系統的生態(tài)服務功能日漸退化甚至消失。2015年《中國環(huán)境統計年報》顯示全國廢水中氨氮排放量2.3×109kg, 其中城鎮(zhèn)生活污水中氨氮排放量占氨氮排放總量的58.3%, 農業(yè)源氨氮排放量占排放總量的31.6%, 工業(yè)廢水氨氮排放量占氨氮排放總量的9.4%[2]。水體中氮素含量過高不僅會極大促進藻類的生長繁殖, 導致水體富營養(yǎng)化, 還會毒害其中的水生動物[3,4]。

氮循環(huán)具有復雜的變化過程, 并且與微生物多樣性和群落結構密切相關。這個過程包括： 固氮作用、氨化作用、硝化作用和反硝化作用[5]。其中氨氧化是硝化作用的第一步, 也是限速步驟[6]。長期以來, 氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing bacterial,AOB) 被認為是氨氧化作用的主要承擔者[7], 然而,近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展和研究的深入,新一類具有氨氧化能力的微生物——氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea, AOA) 從環(huán)境中被分離和鑒定出來。2005年Konneke等[8]從海洋沉積物中分離了一株氨氧化古菌。2006年Leininger等[9]在歐洲中性土壤中發(fā)現了AOA的廣泛存在, 并且amoA基因豐度大于AOB。氨氧化過程中兩個關鍵酶分別是氨單加氧酶和羥胺氧化還原酶。氨單加氧酶是由amoA、amoB、amoC三個基因編碼的α、β、γ三個亞基組成。目前, 編碼α亞基的amoA基因被廣泛用于生態(tài)系統中AOA和AOB的研究[10]。大量研究表明, AOA和AOB存在于很多生態(tài)系統中,如土壤[11]、海洋沉積物[12]、湖泊沉積物[13]和活性污泥[14]等, 但是AOA和AOB在淡水生態(tài)系統尤其是沉積物中的生態(tài)特征、功能差異及多樣化環(huán)境要素的影響機制仍需要進一步研究[15]。

本研究以典型城市湖泊——東湖為例, 通過監(jiān)測東湖表層沉積物的理化參數, 采用熒光定量PCR和高通量測序等分子生物學技術, 以功能基因amoA為分子標記, 對AOA和AOB進行定量和定性分析。探討在不同環(huán)境條件下表層沉積物中AOA和AOB的amoA基因的數量及多樣性, 分析底質和水質中各種理化因子對它的影響, 力求為湖泊氮循環(huán)研究提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　采樣地點

本研究選取東湖子湖——郭鄭湖作為研究對象, 設置3個采樣點(圖 1), 1號點(30°33′4.71″N 114°21′36.68″E); 2號點(30°33′49.02″N 114°23′3.52″E);3號點(30°33′6.20″N 114°23′31.73″E)。

1.2　樣品采集

分別于2016年1月、4月、7月和10月采集東湖表層沉積物樣品(12個樣品, 0—20 cm)。將沉積物樣品充分混勻后分兩份置于無菌塑料袋中密封,4℃保存運回實驗室, 一份自然風干過200目篩用于理化性質的測定, 另一份放于-20℃冰凍保存用于后續(xù)分子實驗。

1.3　理化指標測定

采用標準方法對樣品進行分析, 其中pH采用pH計(Mettler Toledo, Switzerland)測定; 氨氮(-N)、亞硝酸氮(-N)、硝酸鹽氮(-N)采用氯化鉀溶液提取-分光光度法測定; 底泥總氮(TN)、總磷(TP)測定按照《土壤農化分析》(第三版)所述方法進行[16]; 總有機碳(TOC)采用總有機碳分析儀(Elementar, Germany)測定。每個樣品設置3個平行。

1.4　沉積物中AOA和AOB豐度的測定

沉積物樣品DNA提取稱取0.3 g沉積物樣品, 采用PowerSoil DNA試劑盒(MO BIO Laboratories Inc., USA)進行樣品DNA提取, 提取產物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測。

圖 1　東湖采樣點Fig. 1　Sampling sites in Donghu Lake

絕對定量標準曲線制作參照He等[17]報道的方法, 將提取的土壤樣品的微生物全基因組DNA混合并作為PCR擴增的模板, 擴增引物和程序如表 1所示。擴增體系為： 10×PCR buffer (Mg2+)5 μL, dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL, 正反向引物(10 mmol/L)各1 μL, Taq酶(2.5U)0.25 μL, DNA模板2 μL, 加ddH2O補足至50 μL。使用Easy Pure QuickGel Extraction Kit (Trans)純化試劑盒對PCR擴增產物進行切膠純化, T載體與PCR回收產物連接后轉入JM109感受態(tài)細胞, 進行藍白斑篩選。選取白色克隆, 采用菌落PCR鑒定陽性克隆, 所用引物為載體通用引物M13F和M13R。將挑取出的重組質粒進行測序。測序結果經NCBI比對, AOA與泉古菌(JQ345886.1) amoA基因的同源性高達99%, AOB與亞硝化單胞菌(KC769053.1) amoA基因的同源性高達99%。因此, 可作為絕對熒光定量PCR分析的標準DNA。使用EasyPure Plasmid Miniprep Kit(Trans)提取重組質粒DNA, 經核酸定量儀(Nanodrop 2000, USA) 測定濃度, AOA的amoA基因重組質粒濃度為44.6 ng/μL, AOB的amoA基因重組質粒濃度為37.5 ng/μL。根據阿伏伽德羅常數計算出amoA基因的拷貝數, AOA為2.11×1010copies/μL,AOB為1.77×1010copies/μL。將AOA重組質粒按10倍梯度稀釋, 用于標準曲線繪制。

熒光定量PCR采用SYBR Green法進行熒光定量PCR, 所用引物參見表 1, 擴增體系為20 μL,其中, 2×Trans Start Tip Green qPCRSuperMix 10 μL,濃度為10 μmol/L的AOA、AOB正反向引物各0.4 μL,DNA模板1 μL, 用ddH2O補足至20 μL。采用Roche LightCycler? 480擴增儀進行定量, 其反應程序如表 1所示。實驗設置陰性對照, 并與稀釋好的6個標準樣品進行定量擴增, 得到標準曲線, 每個樣品設置3次重復。以基線(背景)熒光信號標準差的10倍作為閾值, 擴增效率＞80%, 溶解曲線為單一峰。

1.5　沉積物中AOA和AOB群落結構分析

HiSeq平臺高通量測序針對氨氧化微生物的功能基因amoA, 采用表 1中的引物進行擴增。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 引物擴增出來的AOA amoA基因片段長度在600—700 bp, AOB amoA基因片段長度在400—500 bp, 使用AxyPrep-DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物, TrisHCl洗脫; 2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果, 將PCR產物用QuantiFluoruantTM藍色熒光定量系統進行檢測定量, 之后按照每個樣本的測序量要求, 進行相應比例的混合。通過Hiseq 2500平臺(IlluminaSanDiego, USA)進行測序, 測序長度250 bp(凌恩生物, 上海)。

表 1　氨氧化微生物amoA基因PCR擴增引物及反應條件Tab. 1　Primers and PCR reaction conditions for amoA gene

AOA和AOB amoA基因多樣性分析利用Cluster及Mothur軟件對序列進行降噪, 并進行聚類,獲得不同序列之間的距離矩陣, 轉化為相似度, 將相似度超過80%的序列歸為一個操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU)。通過稀釋曲線比較不同樣品細菌群落多樣性差異。用Mothur計算微生物群落的多樣性和豐度指數, 包括Shannon指數、Simpson指數、ACE指數、Chao指數和文庫覆蓋率C[18]。

1.6　系統發(fā)育分析

挑選豐度最高的前40個OTUs的代表核酸序列與數據庫中已知序列進行比對。采用Neighbor-Joining建樹方法利用MEGA6.0軟件構建AOA和AOB的amoA基因系統發(fā)育樹, 建樹結果進行1000次Bootstrap檢驗。

1.7　數據分析

用SPSS 16.0統計分析軟件進行方差分析及多因素相關分析。amoA基因豐度進行了以10為底的對數轉換。氨氧化微生物群落結構與環(huán)境因子之間的關系采用Canoco軟件進行典范對應分析, 確定顯著影響AOA或AOB群落結構的環(huán)境因子, 顯著水平設置為P＜0.05和極其顯著P＜0.01。

2　結果

2.1　沉積物理化指標

東湖沉積物基本理化特征如表 2所示。溫度隨季節(jié)變化明顯, 其中夏季最高(28.6—29.3℃), 冬季溫度最低(6.91—7.14℃)。沉積物呈弱堿性(7.0—7.5), 1號位至3號位點, 沉積物pH呈現逐漸降低的趨勢。沉積物TN含量介于1.18—2.31 g/kg (干重), 其中冬季、夏季總氮含量較低, 春季、秋季TN含量較高。沉積物總磷含量介于0.58—1.15 g/kg(干重); 沉積物-N濃度介于26.8—60.9 mg/kg(干重);-N (-N+-N)濃度介于11.1—50.4 mg/kg (干重)。TOC濃度介于27.1—49.2 g/kg(干重), 其中2號點TP、-N及TOC含量均較高,表明2號位點污染最為嚴重, 可能是由于2013年對1號點區(qū)域進行了清淤使得1號點受污染程度有所好轉。

2.2　沉積物氨氧化微生物的豐度

AOA和AOB的定量分析結果顯示(圖 2), 所有樣品中均檢測到AOA和AOB的存在, 且AOA的豐度高于AOB, AOA與AOB的比值介于1.10—-73.6。AOA的豐度介于1.50×108—8.48×109拷貝/g沉積物(干重), 其中冬季AOA較多, 介于2.83×109—8.48×109拷貝/g沉積物(干重); 夏季最低為1.74×108—1.95×109拷貝/g沉積物(干重)。AOB的豐度介于4.87×107—2.40×109拷貝/g沉積物(干重),4個季節(jié)AOB豐度差異不顯著。

表 2　沉積物理化性質Tab. 2　Physical and chemical properties in sediments

將東湖AOA和AOB的amoA基因豐度與沉積物的理化因子做Pearson相關性分析(表 3), 結果表明AOA的豐度與溫度呈顯著負相關(P＜0.05), 沉積物溫度越高, AOA的豐度越少; AOB豐度與理化因子相關性不顯著(P＞0.05)。

2.3　沉積物氨氧化微生物多樣性

對Shannon指數、Simpson指數、OTU數目的Chao指數和ACE指數進行了分析, 具體結果見表4—6。利用Mothur進行數據的過濾分析, 12個沉積物樣品中共得到高質量的AOA amoA基因序列906010條, 平均每個樣品的序列條數為37750條。在所有的12個沉積物樣品中, 按照80%的序列相似度進行OTU劃分。東湖沉積物樣品的OTU數量介于5—16, Shannon指數介于0.03—0.05。比較東湖不同季節(jié)不同采樣的多樣性指數發(fā)現, 冬季樣品多樣性高于其他季節(jié), 2號位點多樣性最低。

圖 2　沉積物中AOA和AOB的豐度Fig. 2　The abundance of AOA and AOB in sediments

表 3　AOA和AOB豐度與沉積物理化指標相關性分析Tab. 3　Correlation analysis between the abundance of AOA and AOB and physical and chemical indicators in sediments

同時, 我們對沉積物AOB amoA基因進行測序(表 5), AOB的文庫覆蓋率均達到了較高的水平(＞99.9%), 這表明了所建立的amoA基因的文庫涵蓋了沉積物中幾乎所有的amoA基因類型。不同采樣點的樣品OTU數量差異顯著, 沉積物樣品AOB的OTU數量介于42—102。Shannon指數最高的是DSP1(1.99), 最低的是DAU2(1.34)。利用不同的指數來估算樣本中微生物多樣性時, 各指數反應的結果略有偏差, 本研究中DSP3 Chao指數最高, 但其Shannon指數為1.87, 最大為1.99。可能是各指數的計算方法不同, 并且群落多樣性受群落組成和群落分布情況的共同影響。

對氨氧化微生物的多樣性指標與沉積物的理化性質進行相關性分析(表 6), 結果發(fā)現東湖沉積物中AOA OTU數量與TOC呈極顯著負相關(P＜0.01), 而AOB OTU數量與pH呈顯著負相關(P＜0.05)。此外, AOA Shannon指數和AOB Shannon指數也與TOC呈極顯著負相關(P＜0.01), 說明沉積物TOC越高, 群落多樣性越低。2號位點相對于其他位點TOC含量最高, 所以AOA和AOB的多樣性均較低。

2.4　沉積物氨氧化微生物的群落結構分析

高通量測序解析氨氧化微生物群落的組成和多樣性結果如圖 3—5所示?？傮w來看東湖沉積物中AOA親緣關系較近的既有來自水體的, 也有來自土壤和沉積物的, AOA序列可以分為Nitrosopumilus、Nitrososphaera以及其他。各個季節(jié)各個采樣點之間AOA群落組成有一定的差異, 但是Nitrosopumilus均占絕對優(yōu)勢(99.8%), 僅在1號位點的冬季、春季及夏季檢測到了Nitrosospharea存在, 含量很低。AOB amoA基因序列分為來自土壤和淡水環(huán)境的Nitrosomonas, Nitrosospira以及相當一部分處于發(fā)育樹外枝的序列。在東湖不同季節(jié)不同采樣點采集的12個樣品中, Nitrosomonas占55.27%, 其他占44.70%, Nitrosospira含量僅占0.03%。

2.5　環(huán)境因子對AOA和AOB群落結構的典范對應分析

利用Canoco將AOA和AOB的優(yōu)勢種與環(huán)境因子進行典范對應(CCA)分析(圖 6)。東湖AOA群落結構與環(huán)境因子排序軸AX1和AX2的解釋度分別為80.6%和9.14%。TOC (-0.9999)、TP (-0.9872)與AX1的相關性較高;-N (0.6545)與AX2的相關性較高。AOB優(yōu)勢種與環(huán)境因子的結果表明, 排序軸AX1的解釋度為88.5%, 排序軸AX2的解釋度為2.70%。與AX1相關性高的環(huán)境因子有TP(-0.9984)、TN (-0.9798)、TOC (-0.9933), 與AX2軸相關性較高的環(huán)境因子為溫度(-0.9631)和pH (0.7244), 總體而言, TN是影響東湖沉積物AOA群落結構的主要因素, TOC和TP是影響AOB群落結構的主要因素。

表 4　沉積物中AOA的多樣性指數Tab. 4　Diversity index of AOA in sediments

表 5　沉積物中AOB的多樣性指數Tab. 5　Diversity index of AOB in Sediments

表 6　AOA和AOB的多樣性指數與沉積物理化指標相關性分析Tab. 6　Correlation analysis between the diversity index of AOA and AOB and physical and chemical indicators in sediments

3　討論

已有研究表明, AOA比AOB更適合厭氧或低氨氮濃度條件[19], 在海洋生態(tài)系統[20]和土壤環(huán)境中[21]AOA amoA基因比AOB的豐度高3個數量級。在淡水生態(tài)系統中, Hou等[22]分析了太湖和巢湖不同富營養(yǎng)程度點位中沉積物AOA與AOB豐度, 發(fā)現在中營養(yǎng)采樣點中AOA多于AOB; Yang等[23]發(fā)現在洱海的沉積物中, AOA數量多于AOB。這與本研究在東湖沉積物中AOA和AOB豐度的研究結果類似, 攜帶amoA基因的微生物并不足以說明其參與氨氧化過程, 因此無法僅僅以基因豐度含量高低確定AOA和AOB在氮循環(huán)中的具體貢獻, 但目前還沒有發(fā)現不能進行氨氧化過程的此類微生物[24],AOA可能在東湖生態(tài)系統氨氧化中占主要作用。

湖泊沉積物中的AOA和AOB受多種環(huán)境因子的影響, 現有研究發(fā)現AOA豐度受pH[25]、-N[26]、-N[27]、TN[26]、TP[27]及TOC[28]的影響,AOB的豐度受-N[29]、-N[26]、pH[26]的影響。在本研究中, 東湖沉積物AOA豐度在不同季節(jié)存在顯著差異, 其數量與溫度呈顯著負相關。Lu等[30]研究農業(yè)池塘沉積物AOA群落分布時, 也得到相似的結論。Hou等[31]研究了東湖不同富營養(yǎng)化程度子湖郭鄭湖和團湖AOA群落分布, 發(fā)現AOA豐度與沉積物中有機物的含量呈負相關, AOA豐度對環(huán)境因子變化敏感。本研究中考察了季節(jié)尺度, 方差分析表明不同季節(jié)之間TN、TP、-N均有顯著差異(P＜0.05), 使得溫度對AOA數量的影響更為明顯。pH[32]被認為是影響AOA和AOB amoA基因數量的一個重要環(huán)境因子, 但是在本研究中, pH對沉積物中AOA和AOB的amoA基因數量無顯著影響。這些不一致的研究結果表明AOA和AOB對于氨氧化過程中的貢獻與環(huán)境條件密切相關。

利用高通量測序分析了東湖沉積物AOA和AOB的群落結構, 在AOA和AOB中均檢測到部分序列(其他)與目前GenBank中已經探明的amoA序列相似性較低, 可能是未分離或培養(yǎng)的區(qū)別于已知菌種的新型氨氧化微生物。東湖沉積物AOA Shannon指數介于0.03—0.05, 東湖AOB Shannon指數介于1.34—1.99, 高于AOA, 在淡水濕地[33]、金山湖[27]及太湖[26]沉積物中AOB多樣性均較AOA高,AOA多樣性較AOB低, 使得優(yōu)勢屬的相對豐度和優(yōu)勢度更加明顯。李虎等[34]研究了浙江甌江沉積物中AOA及AOB組成, 發(fā)現AOA的shannon指數在2.64—2.89, AOB的shannon指數在2.83—3.56。多樣性顯著高于東湖, 推測是由于東湖是湖泊生態(tài)系統, 環(huán)境條件相對封閉單一, 因此生物多樣性也較低。河流生態(tài)系統具有流動性, 易受周邊環(huán)境影響,造成了較高的AOA、AOB多樣性。Bollmann等[28]研究了不同營養(yǎng)程度湖泊沉積物的AOA組成, 結果表明湖泊的營養(yǎng)程度是影響氨氧化微生物群落組成的重要因素, 富營養(yǎng)湖泊Erie沉積物AOA以Nitrososphaera為主, 寡營養(yǎng)湖泊Superior以Nitrosopumilus為主。東湖沉積物AOA主要為Nitrosopumilus (99.8%), 說明東湖郭鄭湖的污染程度相對較輕, 沉積物TN是影響東湖沉積物AOA群落結構的主要因素。對于AOB, Nitrosomonas青睞于低氨氮環(huán)境而Nitrosospira更適應高氨氮的污染環(huán)境[35], 東湖沉積物AOB主要為Nitrosomonas(55.3%),AOB群落結構主要受TOC和TP的影響, 與Yang等[23]在滇池的研究結論類似。有研究表明AOA和AOB的群落結構多樣性受總磷的影響[36], 但Liu等[33]在淡水濕地的研究發(fā)現AOA和AOB的群落結構多樣性和總磷沒有顯著相關性, AOA的多樣性和有效磷含量顯著正相關。到目前為止, AOA及AOB在含磷酸鹽生態(tài)位中的優(yōu)勢尚未確定。應進一步研究磷酸鹽水平與AOA和AOB的存在與活性之間的關系[37]。

圖 6　環(huán)境因子對AOA和AOB群落結構影響CCA分析Fig. 6　CCA analysis of the effects of environmental factors on AOA and AOB community structure

4　結論

在東湖沉積物中, AOA豐度比AOB高, 沉積物中氨氧化反應可能由AOA驅動。東湖沉積物樣品中AOA豐度與T呈顯著負相關, 但AOB豐度變化不明顯。沉積物中Nitrosopumilus為優(yōu)勢AOA菌, 沉積物TN是影響東湖沉積物AOA群落結構的主要因素; Nitrosomonas為優(yōu)勢AOB菌, 東湖沉積物AOB群落結構主要受TOC和TP的影響。

參考文獻：

[1]Fowler D, Coyle M, Skiba U, et al. The global nitrogen cycle in the twenty-first century [J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 2013, 368(1621)： 1—13

[2]Ministry of Environmental Protection. Annual Report on Environmental Statistics. 2015 [環(huán)保部. 2015年環(huán)境統計年報]

[3]Arauzo M. Harmful effects of un-ionised ammonia on the zooplankton community in a deep waste treatment pond[J]. Water Research, 2003, 37(5)： 1048—1054

[4]Pauer J J, Auer M T. Nitrification in the water column and sediment of a hypereutrophic lake and adjoining river system [J]. Water Research, 2000, 34(4)： 1247—1254

[5]Liu G H, Wu H B. Diversity of ammonia-oxidizing archaea in the surface sediments of the northern continental slope of the South China Sea [J]. Tropical Geography,2016, 36(1)： 108—113 [劉國輝, 吳后波. 南海北部陸坡表層沉積物氨氧化古菌多樣性初探. 熱帶地理, 2016,36(1)： 108—113]

[6]Ke X B, Angel R, Lu Y H, et al. Niche differentiation of ammonia oxidizers and nitrite oxidizers in rice paddy soil[J]. Environmental Microbiology, 2013, 15(8)： 2275—2292

[7]Chen Z B, Xia T Y, Wang D K, et al. Spatial and temporal differences of anammox bacterial distribution in Dianchi Lake sediments [J]. Acta Hydrobiologica Sinica,2016, 40(2)： 425—430 [陳澤斌, 夏體淵, 王定康, 等. 滇池沉積物中厭氧氨氧化細菌分布的時空差異. 水生生物學報, 2016, 40(2)： 425—430]

[8]Konneke M, Bernhard A, de la Torre J R, et al. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon [J].Nature, 2005, 437(22)： 543—546

[9]Leininger S, Urich T, Schloter M, et al. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils [J].Nature, 2006, 442(7104)： 806—809

[10]Petersen D G, Blazewicz S J, Firestone M, et al. Abundance of microbial genes associated with nitrogen cycling as indices of biogeochemical process rates across a vegetation gradient in Alaska [J]. Environmental Microbiology, 2012, 14(4)： 993—1008

[11]Han P, Li M, Gu J D. Biases in community structures of ammonia/ammonium-oxidizing microorganisms caused by insufficient DNA extractions from Baijiang soil revealed by comparative analysis of coastal wetland sediment and rice paddy soil [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(19)： 8741—8756

[12]Park S J, Ghai R, Martain-Cuadrado A B, et al. Genomes of two new ammonia-oxidizing archaea enriched from deep marine sediments [J]. PLoS One, 2014, 9(5)： e96449

[13]Zhang J Z, Yang Y Y, et al. Distribution of sediment bacterial and archaealcommunities in plateau freshwater [J].Environmental Biotechnology, 2015, 99(8)： 3291—3302

[14]Limpiyakorn T, Furhacker M, Haberl R, et al. amoA-encoding archaea in wastewater treatment plants： a review[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013,97(4)： 1425—1439

[15]Shen J P, Xu Z H, He J Z. Frontiers in the microbial processes of ammonia oxidation in soils and sediments [J].Journal of Soils and Sediments, 2014, 14(6)： 1023—1029

[16]Bao S D. Analysis of Soil Aggregation [M]. Beijing：China Agricultural Press. 2010, 123—142 [鮑士旦. 土壤農化分析. 北京： 中國農業(yè)出版社. 2010, 123—142]

[17]He J Z, Shen J P, Zhang L M, et al. Quantitative analyses of the abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria and ammonia-oxidizing archaea of a Chinese upland red soil under long-term fertilization practices [J].Environmental Microbiology, 2007, 9(9)： 2364—2374

[18]Zhuang L J, Xia C, Tian Q, et al. Community structure of anaerobic ammonia oxidation bacteria in subsurface soil from riparian zone to land in Baiyangdian Lake using high-throughput sequencing technology [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2017, 37(1)： 261—271 [莊林杰, 夏超,田晴, 等. 高通量測序技術研究典型湖泊岸邊陸向深層土壤中厭氧氨氧化細菌的群落結構. 環(huán)境科學學報,2017, 37(1)： 261—271]

[19]Liu Z H, Huang S B, Sun G P, et al. Diversity and abundance of ammonia-oxidizing archaea in the Dongjiang River [J]. Microbiological Research, 2011, 166(5)：337—345

[20]Zhong J J, Weng J H, Lin X G, et al. Microbial ecology of archaeal ammonia oxidation-a review [J]. Acta Microbiologica Sinca, 2010, 50(4)： 431—437 [賈仲君, 翁佳華,林先貴, 等. 氨氧化古菌的生態(tài)學研究進展. 微生物學報, 2010, 50(4)： 431—437]

[21]Leininger S, Urich T, Schloter M, et al. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils [J].Nature, 2006, 442(17)： 806—809

[22]Hou J, Song C L, Cao X Y, et al. Shifts between ammonia oxidizing bacteria and archaea in relation to nitrification potential across trophic gradients in two large Chinese lakes (Lake Taihuand Lake Chaohu) [J]. Water Research, 2013, 47(12)： 2285—2296

[23]Yang Y Y, Zhang J X, Zhao Q, et al. Sediment Ammonia-Oxidizing Microorganisms in two plateau freshwater lakes at different trophic states [J]. Microbiology of Aquatic Systems, 2016, 71(5)： 257—265

[24]Zhou L L, Zhu G B, Wang S Y, et al. Abundance, biodiversity and contribution to ammonia -oxidizing archaea in littoral sediments of Dongting Lake [J]. Acta Microbiologica Sinca, 2013, 33(6)： 1741—1747 [周磊榴, 祝貴兵,王衫允, 等. 洞庭湖岸邊帶沉積物氨氧化古菌的豐度、多樣性及對氨氧化的貢獻. 環(huán)境科學學報, 2013, 33(6)：1741—1747]

[25]Wang X Y, Wang C, Bao L L, et al. Abundance and community structure of ammonia-oxidizing microorganisms in reservoir sediment and adjacent soils [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(3)： 1883—1892

[26]Zhao D Y, Luo J, Zeng J, et al. Effects of submerged macrophytes on the abundance and community composition of ammonia-oxidizing prokaryotes in a eutrophic lake[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2014,21(8)： 389—398

[27]Liu B, Li Y M, Zhang J P, et al. Abundance and diversity of ammonia-oxidizing microorganisms in the sediments of Jinshan Lake [J]. Current Microbiology, 2014, 69(7)：751—757

[28]Wu Y C, Xiang Y, Wang J J, et al. Heterogeneity of archaeal and bacterial ammonia oxidizing communities in Lake Taihu, China [J]. Environmental Microbiology Reports, 2010, 2(33)： 569—576

[29]Bollmann A, Bullerjahn G S, Mckay R M. Abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in sediments of trophic end members of the Laurentian Great Lakes, Erie and Superior [J]. PLoS One, 2014, 9(5)：e97068

[30]Lu S M, Liao M J, Xie C X, et al. Seasonal dynamic of ammonia-oxidizing microorganisms in freshwater aquaculture ponds [J]. Annals of Microbiology, 2015,65(5)： 651—657

[31]Hou J, Cao X Y, Song C L, et al. Predominance of ammonia-oxidizing archaea and nirk-gene-bearing denitrifiers among ammonia-oxidizing and denitrifying populations in sediments of a large urban eutrophic lake(Lake Donghu [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2013,59(6)： 456—464

[32]Ying J Y, Li X X, Wang N, et al. Contrasting effects of nitrogen forms and soil pH on ammonia oxidizing microorganisms and their responses to long-term nitrogen fertilization in a typical steppe ecosystem [J]. Soil Biology & Biochemistry, 2017, 107(12)： 10—18

[33]Liu Y, Zhang J X, Zhang X L, et al. Depth-related changes of sediment ammonia-oxidizing microorganisms in a high-altitude freshwater wetland [J]. Environmental Biotechnology, 2014, 98(3)： 5697—5707

[34]Li H, Huang F Y, Su J Q, et al. Distribution and diversity of ammonium-oxidizing archaea and ammonium-oxidizing bacteria in surface sediments of Oujiang River [J].Environmental Science, 2015, 36(12)： 4459—4666 [李虎,黃福義, 蘇建強, 等. 浙江省甌江氨氧化古菌和氨氧化細菌分布及多樣性特征. 環(huán)境科學, 2015, 36(12)： 4459—4666]

[35]Wang Y F, Feng Y Y, Gu J D, et al. Seasonal dynamics of ammonia/ammonium-oxidizing prokaryotes in oxic and anoxic wetland sediments of subtropical coastal mangrove [J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2013, 97(3)： 7919—7934

[36]Wu Y C, Xiang Y, He J Z, et al. Heterogeneity of archaeal and bacterial ammonia oxidizing communities in Lake Taihu, China [J]. Environmental Microbiology Reports,2010, 2(4)： 569—576

[37]Erguder T H, Boon N, Wittebolle L, et al. Environmental factors shaping the ecological niches of ammonia-oxidizing archaea [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2009,33(5)： 855—869