李　純　陳　辰　趙　建　洪孝友　李　偉　朱新平

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510380;2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)的俗名為甲魚(yú)、水魚(yú), 隸屬于龜鱉目(Tesmdinata)鱉科(Trionychidae)鱉屬(Trionyx), 主要分布于越南、中國(guó)、韓國(guó)、日本等地區(qū)[1,2]。其味道鮮美, 具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,同時(shí)作為藥材和補(bǔ)品也十分受歡迎[3]。鱉類的養(yǎng)殖在21世紀(jì)初發(fā)展很快, 全國(guó)年產(chǎn)量從1996年的3.2×107kg增長(zhǎng)到2015年的3.42×108kg[4]。但是隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 養(yǎng)殖技術(shù)并沒(méi)有形成規(guī)范。中華鱉的養(yǎng)殖業(yè)正在面臨著種質(zhì)退化[5], 種苗缺乏的困境[6]。提升中華鱉選育工作的針對(duì)性和效率成為當(dāng)務(wù)之急。

生長(zhǎng)素(Ghrelin, GHRL)是一種來(lái)自胃的辛?；L(zhǎng)激素釋放肽, 具有調(diào)節(jié)食欲、胃腸功能、心血管系統(tǒng)和能量平衡等作用, 與生長(zhǎng)關(guān)系密切[7]。很多人進(jìn)行了GHRL基因的相關(guān)聯(lián)的研究： 方梅霞等[8]在鴨GHRL基因發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)C-792T的CT基因型雜合子優(yōu)勢(shì)明顯, 與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān); 王春曉等[9]在尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus) GHRL基因中發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNP位點(diǎn)均位于第一個(gè)內(nèi)含子當(dāng)中并完全連鎖, 其基因型與快長(zhǎng)性狀密切相關(guān); 羅開(kāi)鵬等[10]在山羊的GHRL基因外顯子4處發(fā)現(xiàn)一個(gè)同義SNP突變, 與貴州黑山羊(麥坪)群體的生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。 Seim等[11]通過(guò)對(duì)接受肥胖治療手術(shù)的女性的體細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析, 推測(cè)GHRL表達(dá)與肥胖存在一定關(guān)系。Tinoco等[12]通過(guò)對(duì)鮭魚(yú)GHRL基因表達(dá)量的檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)其與鮭魚(yú)攝食量和生長(zhǎng)相關(guān)。GHRL基因表達(dá)與生長(zhǎng)的正相關(guān)在很多研究中得到證明, 但是在中華鱉中該基因的研究依然是空白, GHRL基因多態(tài)性與中華鱉生長(zhǎng)的關(guān)聯(lián)性仍待證明。

單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Signal nucleotide polymorphisms, SNPs)是指在基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異引起的多態(tài)性[13]。SNPs的遺傳標(biāo)記有很多優(yōu)勢(shì)： 位點(diǎn)數(shù)量多[14], 多態(tài)性豐富[15], 遺傳性穩(wěn)定[16],能引起氨基酸突變, 分析簡(jiǎn)易[17]。將這種多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行連鎖分析, 選出具有優(yōu)良性狀的個(gè)體,是克服種質(zhì)衰退的有效方法之一。

本研究以GHRL為候選基因, 篩選SNP多態(tài)性位點(diǎn), 研究其與中華鱉生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性, 以期獲得與長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記, 為中華鱉分子標(biāo)記輔助育種提供指導(dǎo)與幫助, 進(jìn)而選育出快長(zhǎng)的中華鱉良種品系, 促進(jìn)中華鱉產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

1　材料與方法

1.1　材料

本實(shí)驗(yàn)中華鱉取自珠江水產(chǎn)研究所高要基地培育的同批繁殖同塘飼養(yǎng)的1冬齡健康中華鱉, 該批中華鱉為來(lái)自依托湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所的湖南中華鱉原種場(chǎng)繁殖的苗種, 基數(shù)群體為2000只,從中隨機(jī)挑選120只用于生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析, 并從這120只個(gè)體中挑選10只極大個(gè)體(重量大于350 g)和10只極小個(gè)體(重量小于130 g)用于SNP位點(diǎn)的篩選。

1.2　研究方法

樣本形態(tài)數(shù)據(jù)測(cè)量對(duì)120只中華鱉進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量并記錄。體重用電子天平稱量, 精確到0.1 g。形態(tài)用游標(biāo)卡尺測(cè)量, 測(cè)量每只中華鱉的背甲長(zhǎng)、背甲寬、體高和裙邊寬, 精確到0.1 mm。

基因組DNA的提取剪取所有樣本中華鱉的裙邊用于基因組DNA的提取及SNP分型。DNA提取試劑盒使用Omega MicroElute Genomic DNA Kit; 2×Taq PCR master mix購(gòu)自GeneSTAR生物工程有限公司(廣州); 參照DNA提取試劑盒提供的方法提取120只中華鱉的基因組DNA, 用無(wú)酶的去離子水溶解過(guò)柱, 對(duì)純度和濃度進(jìn)行檢測(cè), 放在-20℃保存待用。

GHRL基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)NCBI上中華鱉GHRL基因序列(GenBank登錄號(hào)： NW_005857883)設(shè)計(jì)引物, 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)5對(duì)引物(詳細(xì)序列和參數(shù)見(jiàn)表 1), 引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 分段擴(kuò)增GHRL基因。PCR反應(yīng)體系為50 μL, 含2×PCR MIX 25 μL (含1.25 UTaq 酶)、正反向引物各2 μL (10 μmol/L)、DNA模板2 μL (100 ng/μL)、ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性5min; 94℃變性45s, 退火60s,72℃延伸60s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果使用Vector NTI進(jìn)行比對(duì)找出SNP位點(diǎn)。

GHRL基因SNP分型根據(jù)極大個(gè)體群與極小個(gè)體群找出的SNP位點(diǎn)信息, 委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法[18]對(duì)120只中華鱉GHRL基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。

表 1　中華鱉GHRL基因擴(kuò)增引物Tab. 1　Primer information of Pelodiscus sinensis GHRL

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Popgene 32軟件計(jì)算觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和等位基因頻率等遺傳參數(shù)。使用PIC_CALC軟件計(jì)算群體的多態(tài)信息含量, 采用SPSS19軟件一般線性模型(General linear model, GLM)對(duì)分型結(jié)果和中華鱉的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)分析, 因變量有體重、背甲長(zhǎng)、背甲寬、體高和裙邊寬, 自變量為篩選到的SNP位點(diǎn)的不同基因型。其生物統(tǒng)計(jì)模型為： Yij=μ+Bi+eij, 其中Yij表示某性狀第i個(gè)標(biāo)記在第j個(gè)個(gè)體上的觀測(cè)值; μ表示實(shí)驗(yàn)觀測(cè)所有個(gè)體的平均值; Bi表示第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值; eij表示對(duì)應(yīng)個(gè)體觀測(cè)值的隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2　結(jié)果

2.1　GHRL擴(kuò)增及SNP突變位點(diǎn)的篩查

5對(duì)引物PCR擴(kuò)增分別獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)1050、1186、1209、1370和1319 bp, PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序和縱向?qū)Ρ群蠊舶l(fā)現(xiàn) 14個(gè)SNP突變點(diǎn)。其中5′-UTR有6個(gè), 分別命名為C289T、G501T、T738C、G776T、A841G、T885C; Intron-3有3個(gè)： 分別命名為T2960C、A2987T、G3390A; 3′-UTR有5個(gè), 分別命名為A3857C、G4718A、T4820C、A4850C、T4979C。

2.2　GHRL SNP遺傳多樣性分析

對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行處理后如表 2、表 3, 可以看到所有SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)。根據(jù)中度多態(tài)性原則0.25＜PIC＜0.50, 所有SNP位點(diǎn)均處于中度多態(tài)性水平。其中： G501T與A2987T處于連鎖狀態(tài), 命名為位點(diǎn)S1; T738C、G776T、A841G、T885C和A3857C位點(diǎn)均處于連鎖狀態(tài), 命名為位點(diǎn)S2; T4820C和A4850C也處于連鎖狀態(tài), 命名為位點(diǎn)S3。將所有連鎖狀態(tài)的SNP位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因命名為A, 另一個(gè)為B, 便于接下來(lái)的分析。

2.3　GHRL SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析

采用一般線性模型(General linear model, GLM)分析14個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型與體重、背甲長(zhǎng)、背甲寬、體高和裙邊寬的相關(guān)性(表 4)。C289T位點(diǎn)的CT、CC基因型的5項(xiàng)生長(zhǎng)數(shù)據(jù)均顯著高于TT基因型。S2位點(diǎn)的AB基因型的體重、背甲長(zhǎng)、背甲寬和裙邊寬4項(xiàng)數(shù)據(jù)均顯著高于AA基因型。G3390A位點(diǎn)的AG基因型的背甲長(zhǎng)、背甲寬2項(xiàng)數(shù)據(jù)顯著高于AA基因型。G4718A位點(diǎn)的AG基因型的背甲長(zhǎng)、背甲寬、裙邊寬3項(xiàng)數(shù)據(jù)顯著高于AA基因型(P＜0.05)。而其他6個(gè)SNP位點(diǎn)的不同基因型在5個(gè)生長(zhǎng)性狀上無(wú)顯著差異(P＞0.05)。顯著性分析結(jié)果在極大個(gè)體數(shù)(重量大于350 g)分布上也得到了體現(xiàn)： C289T位點(diǎn)的TT基因型沒(méi)有極大個(gè)體。S2位點(diǎn)的AB基因型有8只極大個(gè)體, 而AA基因型僅為1只。G3390A位點(diǎn)的AG基因型有8只極大個(gè)體, 而AA基因型僅1只。

表 2　中華鱉GHRL SNP位點(diǎn)的基因型及其等位基因頻率Tab. 2　Genotype and allele frequency of SNPs in Pelodiscus sinensis GHRL

表 3　中華鱉GHRL SNP 位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Tab. 3　The polymorphic parameters of SNPs in Pelodiscus sinensis GHRL

3　討論

生長(zhǎng)素在哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)類及兩爬類中廣泛存在, 它是一種來(lái)自胃的辛?；L(zhǎng)激素釋放肽, 其多肽物質(zhì)首先是在大鼠及人的胃中發(fā)現(xiàn)的,有人將之譯作生長(zhǎng)素[19]。它主要由胃腺或胃黏膜皺襞內(nèi)特定的內(nèi)分泌細(xì)胞分泌[20]。Ghrelin能夠刺激生物體生長(zhǎng)激素的釋放、增加其進(jìn)食量造成肥胖, 它還能影響多種激素釋放以及調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸[21], 因此具有調(diào)節(jié)食欲、胃腸功能、心血管系統(tǒng)和能量平衡等作用。

本研究以中華鱉極大極小2個(gè)群體作為SNP篩選的實(shí)驗(yàn)材料, 在保證遺傳背景一致的前提下增加了生長(zhǎng)相關(guān)SNP出現(xiàn)的幾率。檢測(cè)中華鱉GHRL基因序列長(zhǎng)度為5404 bp的SNP, 篩選到了14個(gè)SNP位點(diǎn), 相當(dāng)于每千個(gè)堿基中出現(xiàn)2.59個(gè)SNP位點(diǎn), 并且全部位于非編碼區(qū)和內(nèi)含子上, 這說(shuō)明GHRL基因在進(jìn)化中比較保守, 該類基因的突變往往會(huì)對(duì)功能產(chǎn)生較大的影響。

S1、S2、S3三組SNP位點(diǎn)各自的基因型頻率和等位基因頻率完全一致, 是三組連鎖的SNP位點(diǎn)。這種現(xiàn)象在其他基因的研究中也有報(bào)道, 如在大口黑鱸(Micropterus salmoides)的高密度脂蛋白結(jié)合蛋白(High density lipoprotein binding protein,HBP)基因篩了3個(gè)SNP位點(diǎn)分別是H1、H2、H3,其中H1和H2位點(diǎn)的基因型和基因頻率都一致, 單個(gè)位點(diǎn)基因型與生長(zhǎng)不相關(guān), 而二者組成的BB基因型與快長(zhǎng)密切相關(guān)并推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)之間連鎖,存在協(xié)同或拮抗作用[22]。

本研究將120只中華鱉GHRL基因單個(gè)SNP位點(diǎn)的不同基因型與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行GLM關(guān)聯(lián)分析, 發(fā)現(xiàn)在C289T位點(diǎn)、S2位點(diǎn)、G3390A位點(diǎn)和G4718A位點(diǎn), 優(yōu)勢(shì)基因型均為雜合, 這符合了育種學(xué)上的雜交優(yōu)勢(shì)原理, 因此在育種工作中應(yīng)將兩種純合群體進(jìn)行雜交, 以取得最優(yōu)生長(zhǎng)性狀。本實(shí)驗(yàn)在中華鱉GHRL基因上篩選到14個(gè)SNP位點(diǎn), 其中C289T位點(diǎn)的CT、CC基因型的的5項(xiàng)生長(zhǎng)數(shù)據(jù)均顯著高于TT基因型(P＜0.05)。S2位點(diǎn)的AB基因型的體重、背甲長(zhǎng)、背甲寬和裙邊寬4項(xiàng)數(shù)據(jù)均顯著高于AA基因型(P＜0.05)。G3390A位點(diǎn)的AG基因型的背甲長(zhǎng)、背甲寬2項(xiàng)數(shù)據(jù)顯著高于AA基因型(P＜0.05)。G4718A位點(diǎn)的AG基因型的背甲長(zhǎng)、背甲寬、裙邊寬3項(xiàng)數(shù)據(jù)顯著高于AA基因型(P＜0.05)。這8個(gè)SNP位點(diǎn)可能影響著中華鱉的生長(zhǎng)性狀或與之緊密連鎖。今后可以將這些SNP位點(diǎn)作為中華鱉分子輔助育種的參考, 并進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

續(xù)表 4

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