池秋蝶　董迎輝　姚韓韓　林志華

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 寧波 315211; 2. 浙江萬里學(xué)院, 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點實驗室, 寧波 315100)

Smad家族蛋白是細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,直接參與轉(zhuǎn)化生長因子-β (Transforming growth factor-β, TGF-β)超家族中成員如TGF-β、骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)、生長分化因子(Growth differentiation factor, GDF)、激活素(Activins)等多個信號的轉(zhuǎn)導(dǎo), 進而參與多種細胞的增殖、分化、遷移及凋亡等過程[1]。Smad家族蛋白主要負責(zé)將細胞膜上TGF-β信號從細胞外傳遞到細胞核內(nèi), 調(diào)控核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄[2]。Smad蛋白最初從果蠅(Drosophila melanogaster)[3,4]中發(fā)現(xiàn), 目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)至少有8個成員, 即Smad1-8[5]。Smad1、Smad5蛋白主要被BMP/GDF受體磷酸化,參與BMP/GDF信號通路的傳導(dǎo)[6]。目前, 有關(guān)Smad1、Smad5的功能研究已經(jīng)很多, 如人(Homo sapiens)[7]、小鼠(Mus musculus)[8]、家兔(Oryctolagus cuniculus)[9]等, 誘導(dǎo)軟骨和骨的形成及骨的修復(fù), 在胚胎發(fā)育中中胚層的形成和發(fā)育、各種其他器官系統(tǒng)的發(fā)育和成型方面是必需的。關(guān)于Smad1和Smad5基因在軟體動物的研究較少, 現(xiàn)有的研究表明： 貝類Smad1/5蛋白為高等動物Smad1和Smad5的同源蛋白, 具有脊椎動物Smad1和Smad5蛋白類似的功能[10,11]; 如Liu等[10]發(fā)現(xiàn)Smad1/5基因參與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)的背部化、胚層分層、貝殼發(fā)生等早期胚胎發(fā)育過程; 錢雪駿等[11]發(fā)現(xiàn)Smad1/5基因與泥蚶(Tegillarca granosa)的肌肉生長和幼蟲變態(tài)發(fā)育有關(guān); 郭慧慧[12]對櫛孔扇貝(Chlamys farreri)Smad家族基因的研究中發(fā)現(xiàn)了一個同源基因Smad1, 參與成體肌肉的生長過程及幼蟲發(fā)育、變態(tài)過程。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)是指在生物的基因組水平上, 由于單個核苷酸堿基發(fā)生變異引起DNA序列產(chǎn)生的多態(tài)性[13]。SNPs標(biāo)記主要通過與經(jīng)濟性狀緊密連鎖的標(biāo)記對經(jīng)濟性狀進行分子標(biāo)記輔助選擇, 能夠有效對復(fù)合性狀進行改良, 作為克服生長性狀衰退的有效方法之一[14]。文蛤(Meretrix meretrix)是我國沿海重要經(jīng)濟灘涂貝類之一, 開展文蛤生長相關(guān)功能基因的分子標(biāo)記研究, 對其基因資源的挖掘利用和分子輔助選擇育種具有重要意義。目前有關(guān)其功能基因與生長性狀相關(guān)的SNP位點的研究已有一些報道,在長鏈酯酰輔酶A合成酶(ACSL1)[15]、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK10)[15]、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FBA)[16]、生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)[17]、轉(zhuǎn)硫酶樣基因(SULT)[18]、組蛋白去乙?；? (HDAC1)[19]等基因中篩查出與生長相關(guān)的SNPs位點, 而文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因相關(guān)研究尚未見報道。本研究利用RACE技術(shù)克隆獲得Mm-Smad1/5基因的cDNA全長序列, 利用qRT-PCR技術(shù)對不同組織和發(fā)育時期表達差異分析, 初步探討其在文蛤生長發(fā)育過程中調(diào)控作用, 也為研究Smad1/5基因在其它貝類生長、發(fā)育過程中的調(diào)控作用提供參考; 采用直接測序法篩查了Mm-Smad1/5基因外顯子區(qū)域SNP位點, 并進行其與生長相關(guān)性分析, 為文蛤生長性狀相關(guān)標(biāo)記的開發(fā)和分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

實驗用文蛤取自浙江省寧波甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司, 隨機取4顆文蛤, 分別取閉殼肌、水管、外套膜、斧足、鰓、內(nèi)臟團6個組織樣品, 液氮速凍后, -80℃凍存?zhèn)溆?。?014年7—8月, 選取貝殼完整、健康有力和性腺飽滿的2齡文蛤作為親貝, 采用陰干-流水刺激法進行人工催產(chǎn), 通過隔離產(chǎn)卵和人工授精技術(shù)獲得同步發(fā)育的文蛤幼體, 經(jīng)鏡檢后取卵子、受精卵、2—4細胞、囊胚期、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點幼蟲和稚貝10個發(fā)育時期樣品, 液氮速凍后, -80℃凍存?zhèn)溆?。用于SNP分析的樣品, 是從山東東營文蛤群體移養(yǎng)到浙江繁殖第六代的群體, 同批同塘養(yǎng)殖至2齡, 隨機取樣100顆, 測量殼長、殼寬、殼高、總重生長性狀指標(biāo), 解剖取其斧足肌肉, 液氮速凍后,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　總RNA提取與cDNA第一鏈合成

分別取文蛤不同組織和發(fā)育時期的樣品, 采用Trizol法提取RNA, 用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Vue超微量分光光度計檢測其濃度和完整性; 選擇A260/A280在1.8—2.0、電泳檢測條帶完整性較好的RNA, 分別按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit (Clontech)、Reverse Transcription System (Promega)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈, -20℃保存?zhèn)溆? 用于后續(xù)RACE克隆、cDNA全長驗證和熒光定量PCR實驗。

1.3　cDNA全長克隆及其驗證

基于文蛤454轉(zhuǎn)錄組文庫, 利用NCBI的Blastx工具與其他物種比對分析, 獲得Mm-Smad1/5 基因的EST序列, 用Primer Premier 5軟件設(shè)計5′端、3′端RACE引物GSP1和GSP2(表1), 上述用于RACE克隆的cDNA為模板, 依照Advantage 2 Polymerase試劑盒(Clontech)說明進行5′端、3′端RACE克隆。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 選擇單一性、亮度高的條帶利用膠回收試劑盒進行純化后, 根據(jù)pEASY-T1 Cloning Kit試劑盒(Trans)說明進行連接轉(zhuǎn)化, 挑選陽性克隆送往華大基因公司測序確認。依據(jù)獲得Mm-Smad1/5基因的cDNA全長序列, 設(shè)計驗證特異性引物F1和R1(表1)對其cDNA全長進行驗證, 以消除不確定的堿基來確保獲得cDNA序列的正確性。

1.4　序列分析

用BlastX、DNAStar中的SeqMan程序?qū)y序結(jié)果進行與其他物種比對、刪除載體序列及拼接分析, ORF Finder查找ORF區(qū), DNAMAN軟件預(yù)測編碼氨基酸序列。利用ExPASy軟件預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)參數(shù), SignalP 4.0 Server和TMHMM Server v2.0預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽和跨膜區(qū)域, NetNGlyc 4.0 Server、NetOGlyc 1.0 Server程序預(yù)測N-糖基化、O-糖基化位點。用ExPASy、Swiss Model在線預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載其他物種的同源氨基酸序列, 用MEGA 6.0軟件進行同源氨基酸多序列比對, 采用鄰位連接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(Bootstrape=1000)。

表1　本實驗所用引物及其序列Tab. 1　Primers and their sequences

1.5　不同組織、不同發(fā)育時期差異表達分析

采用實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)對Mm-Smad1/5基因在不同組織和不同發(fā)育時期中表達量進行研究, 依據(jù)獲得的cDNA全長序列設(shè)計引物qRT-F和qRT-R(表1), 以18S rRNA基因為內(nèi)參, 以不同組織和不同發(fā)育時期的cDNA為模板, 每個樣品做4個平行, 用7500 Fast Real-Time PCR儀進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為SYBR?Green Supermix (Bio-rad) 10 μL、DEPC-H2O 7.2 μL、F 1 μL、R 1 μL、cDNA 0.8 μL, 共20 μL。PCR反應(yīng)程序為95℃ 20s; 95℃ 3s, 60℃ 15s, 72℃ 10s, 共40個循環(huán)。實時熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算, 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示, SPSS19.0軟件進行ANOVA單因素方差分析,P＜0.05為顯著性差異水平。

1.6　外顯子區(qū)域SNP位點篩查

根據(jù)獲得的Smad1/5基因cDNA全長設(shè)計篩選外顯子區(qū)域SNP位點3對特異性引物F2和R2、F3和R3、F4和R4(表1), 提取備用100顆文蛤RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 作為外顯子區(qū)域SNP位點篩選模板,PCR反應(yīng)體系為Taq MasterMix 25 μL、DEPC-H2O 17 μL、F 2 μL、R 2 μL、cDNA 2 μL, 共50 μL。PCR反應(yīng)程序為94℃ 5min; 94℃ 30s, Tm 30s, 72℃1min, 共35個循環(huán); 72℃ 10min。在擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后, 將目的片段大小的PCR產(chǎn)物直接送往華大基因公司測序。利用MEGA軟件對測序結(jié)果比對來查找SNP位點, 利用Chromas軟件查看測序圖譜來進行人工校對, 用SPSS19.0軟件對殼長、殼高、殼寬和總重等生長性狀與SNP位點基因型進行相關(guān)性分析。

2　結(jié)果

2.1　Mm-Smad1/5的cDNA全長及其序列分析

Mm-Smad1/5基因的cDNA全長為1832 bp(GenBank登錄號： KX257418), 包括5′端非編碼區(qū)162 bp, 開放閱讀框1380 bp, 編碼459個氨基酸, 3′端非編碼區(qū)290 bp。Mm-Smad1/5蛋白分子量為51.17 kD, 理論等電點pI是6.34, 其極性氨基酸所占比例為59.0%, 表現(xiàn)為親水性。SignalP、TMHMM在線預(yù)測顯示無明顯的信號肽序列和無明顯的跨膜區(qū)。NetNGlyc 4.1 Server、NetOGlyc 1.0 Server軟件預(yù)測有2個N-糖基化、19個O-糖基化的位點。

2.2　Mm-Smad1/5基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

ExPASy PROSITE結(jié)構(gòu)域軟件預(yù)測結(jié)果顯示,Mm-Smad1/5蛋白包括MH1結(jié)構(gòu)域(17—141 aa)和MH2結(jié)構(gòu)域(265—459 aa)。Swiss Model二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示, Mm-Smad1/5蛋白的二級結(jié)構(gòu)由15個α-螺旋、19個β-折疊、58個轉(zhuǎn)角和238個氫鍵組成。

2.3　Mm-Smad1/5基因的氨基酸比對及進化樹分析

氨基酸序列比對結(jié)果顯示, 文蛤Smad1/5蛋白與太平洋牡蠣Smad5、大西洋舟螺Smad1的同源性最高, 其一致性分別為83.7%和80.2%; 與果蠅Mad的一致性為69.3%, 同源性最低; 與非洲爪蟾、雞、豬、人等脊椎動物Smad1、Smad5基因的同源性也較高, 達到70.3%以上。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示, 用于分析的Smad成員分為BMP激活RSmad、TGF-β激活R-Smad、Co-Smad和I-Smad四支, 與Smad蛋白家族的分類相同。文蛤Smad1/5屬于BMP激活R-Smad支, 先與進化關(guān)系最近的大西洋舟螺的Smad1、櫛孔扇貝Smad5、泥蚶Smad1/5、太平洋牡蠣Smad5和合浦珠母貝Smad5聚成一類,再與人、鼠、雞、非洲鴕鳥、揚子鱷、中華鱉、大西洋鮭、斑馬魚Smad5聚成的亞支和人、鼠、雞、絨啄木鳥、非洲爪蟾、熱帶爪蟾、斑馬魚Smad1聚成的亞支聚在一起(圖1)。

2.4　Mm-Smad1/5基因在不同組織、發(fā)育時期的表達差異分析

Mm-Smad1/5基因在不同組織中表達分析顯示,在鰓、水管、內(nèi)臟團、閉殼肌、外套膜和斧足六個組織中均有表達, 其中鰓、水管、內(nèi)臟團和閉殼肌的相對表達量較低, 而外套膜和斧足的表達量顯著高于其他組織(P＜0.05), 其中斧足的表達量最高(圖2)。對Mm-Smad1/5基因在不同發(fā)育時期的表達進行分析, 發(fā)現(xiàn)從卵子、受精卵、2—4細胞期到囊胚期僅有微量表達, 從原腸胚期開始大量表達,到殼頂幼蟲期的表達量達到最高, 顯著高于其他發(fā)育時期(P＜0.05), 眼點幼蟲期表達量大量下降, 稚貝期又有所上升(圖3)。

圖1　采用MEGA6.0軟件NJ法構(gòu)建的進化樹Fig. 1　The phylogenetic tree, constructed by MEGA6.0 software using the NJ method

圖2　Mm-Smad1/5在文蛤不同組織中表達差異分析(n=4)Fig. 2　Analysis of Mm-Smad1/5 gene expression in different tissues (n=4)

2.5　Mm-Smad1/5外顯子區(qū)中SNP位點篩選與生長相關(guān)性分析

從100顆文蛤中剔除測序失敗的個體后, 將剩余個體經(jīng)序列比對分析, 發(fā)現(xiàn)在Mm-Smad1/5基因外顯子區(qū)域共篩查出9個SNP位點, 根據(jù)相對于起始密碼子(ATG)位置分別命名為123 A＞G、262 C＞T、551 C＞T、919 C＞T、936 G＞T、996 G＞T、999 C＞T、1281 A＞G和1403 G＞T(表2), 其中位點936 G＞T的GG型的殼長、殼高、殼寬和總重生長指標(biāo)均顯著高于GT型(P＜0.05), 而其他8個位點的不同基因型之間與生長性狀的相關(guān)性均無顯著性差異(P＞0.05)。在9個SNP位點中, 其中7個(123 A＞G、262 C＞T、919 C＞T、936 G＞T、996 G＞T、999 C＞T和1281 A＞G)屬于外顯子上的同義突變, 1403 G＞T位點屬于3′UTR區(qū)的突變, 這些突變并未導(dǎo)致編碼氨基酸的改變; 551 C＞T為外顯子上的非同義突變位點, 其編碼的氨基酸由亮氨酸(GCC)變成纈氨酸(GTC), 雖然該位點與生長相關(guān)性沒有達到顯著性水平(P＞0.05), 但其CC型個體在殼長、殼高、殼寬和總重總體上要高于其他基因型。

3　討論

Mm-Smad1/5基因在文蛤斧足、外套膜、鰓、閉殼肌等成體6個組織中均有表達, 這說明其參與多種組織細胞的生物學(xué)活性。Eva等[20]發(fā)現(xiàn)Smad1、Smad5蛋白介導(dǎo)BMP2信號通路能夠激活生肌負調(diào)控因子Id1、Id3、Dlx2和Hey1的表達, 來抑制C2C12細胞系的成肌分化; Ono等[21]發(fā)現(xiàn)通過敲除Smad4、Smad5基因或Dorsomorphin阻斷Smad1和Smad5磷酸化后, 都能導(dǎo)致肌衛(wèi)星細胞的過早向成肌方向分化, 由此推斷Smad1、Smad5蛋白在肌肉生長、分化過程中起到抑制作用。Mm-Smad1/5基因在斧足中表達最高, 這與泥蚶[11]、櫛孔扇貝[12]的同源基因在肌肉組織中高表達具有一致性, 文蛤的斧足為重要運動器官, 主要由肌肉組織組成[22], 推測其在文蛤肌肉生長過程中起到重要作用。Mm-Smad1/5基因在外套膜的表達量顯著高于除足之外的其他組織, 可能由于外套膜為軟體動物貝殼形成的重要組織[23], 作為BMP-Smad信號通路下游效應(yīng)分子, 發(fā)揮類似高等動物骨、軟骨等硬組織形成的功能, 可能參與貝殼形成、礦化過程[23]。

圖3　Mm-Smad1/5在文蛤不同發(fā)育時期中表達差異分析(n＞500)Fig. 3　Analysis of Mm-Smad1/5 gene expression in different developmental stages (n＞500)

在文蛤卵子中檢測到Mm-Smad1/5微量水平的表達, 可能為母源效應(yīng)基因。在脊椎動物的胚胎發(fā)育早期, Smad1、Smad5蛋白參與了胚胎的背側(cè)化和決定胚胎形態(tài)模式[24], Mm-Smad1/5基因可能在文蛤胚胎發(fā)育早期發(fā)揮著類似功能。在原腸胚期中的表達量顯著上升(P＜0.05), 這與太平洋牡蠣[10]、櫛孔扇貝[12]相似, 可能也參與了原腸胚期中三胚層的形成與分化。Smad1、Smad5作為BMP信號通路下游轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白, 二者在貝類貝殼形成、礦化時期發(fā)揮重要作用, 如歐洲帽貝(Patella vulgata) BMP2/4基因在貝殼形成組織的邊緣高水平表達, 參與殼原基的形態(tài)構(gòu)建、貝殼形成及殼發(fā)生速度的調(diào)控[25];靜水錐實螺(Lymnaea stagnalis) BMP2/4參與貝殼螺旋形成、外套膜的生長、貝殼礦化的過程[26,27]。在本研究中, Mm-Smad1/5基因在文蛤擔(dān)輪幼蟲至殼頂幼蟲期中高水平表達, 推測其在貝殼形成和礦化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

目前有關(guān)Smad1、Smad5基因與生長相關(guān)SNP位點的報道很少, 在櫛孔扇貝Smad1基因中并未發(fā)現(xiàn)與生長性狀相關(guān)的SNP位點[12], 而泥蚶的Smad1/5編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了6個突變頻率較低的SNP位點[11]。本研究在Mm-Smad1/5基因的外顯子區(qū)域共篩查出9個候選SNP位點, 其突變頻率高于泥蚶, 提示Mm-Smad1/5基因多態(tài)性更豐富。在文蛤的外顯子篩查出的9個SNP位點, 大多數(shù)的SNP位點為同義突變, 未導(dǎo)致編碼氨基酸的改變; 只有551 C＞T為非同義突變, 與生長相關(guān)性并未達到顯著性水平(P＞0.05); 與文蛤生長顯著性相關(guān)的位點936 G＞T(P＜0.05)雖未導(dǎo)致氨基酸的改變, 可能通過影響mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性或影響核糖體通過mRNA的速度來影響蛋白翻譯[28], 進而影響Mm-Smad1/5調(diào)控核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄, 可能使得在文蛤殼長、殼高、殼寬和總重等生長性狀上, 純合GG型個體顯著高于雜合GT型個體。本研究僅在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個與生長性狀相關(guān)的SNP位點, 需要進一步對Mm-Smad1/5基因的內(nèi)含子和啟動子生長相關(guān)的SNP位點進行篩查, 以期為文蛤的良種選育提供更多有用的分子標(biāo)記。

表2　Mm-Smad1/5基因外顯子區(qū)中SNPs的不同基因型與生長性狀相關(guān)性分析Tab. 2　Correlation analysis of the different genotypes of SNPs in the exon of Mm-Smad1/5 with growth traits

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