宋國慶 ，曹 禹 ，李 輝 ，馬 克 ，趙雪瑩 ，鄒凱南 ，周懷谷

（1.復旦大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，上海 200032；2.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083；3.上海市刑事科學技術研究院，上海 200083）

微生物無處不在，生態(tài)環(huán)境中的微生物在地球化學循環(huán)中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用，在人體內的微生物更是廣泛參與免疫、消化、代謝等生理過程。早期的微生物研究主要依靠純培養(yǎng)分離的方法，1998年，HANDELSMAN等[1]在研究土壤微生物時將環(huán)境中的全部微生物基因組當作研究對象并提出“宏基因組學”的概念，有別于傳統(tǒng)的微生物研究，宏基因組學無須分離純培養(yǎng)微生物，克服了傳統(tǒng)研究中大多數(shù)微生物不能被大量培養(yǎng)、無法被測序的缺陷，更拓展了微生物的研究方法，可以從群落水平上揭示微生物及其相互之間的作用機理[2]。細菌是微生物的主要類群之一，在細菌中，主要存在 3種核糖體 RNA（5S、16S、23S），其中16S rRNA是細菌核糖體RNA的小亞基，該亞基的編碼基因為16S rDNA，由于DNA容易提取并相對穩(wěn)定，所以一般進行細菌群落結構或功能分析時均選取16S rDNA。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，特別是高通量測序（high-throughput sequencing，HTS），又稱大規(guī)模平行測序技術（massively parallel sequencing，MPS）的出現(xiàn)，生命科學領域掀起了新的技術革命[3-4]，16S rDNA的研究也進入了新的發(fā)展階段。微生物16S rDNA作為種群分類的系統(tǒng)發(fā)育標記，使得非培養(yǎng)微生物的發(fā)現(xiàn)和研究成為可能，同時極大程度地促進了微生物學的發(fā)展[5]。

16S rDNA分子大小適中，由于功能上高度保守，而序列不同位置的變異速率不同，其進化具有良好的時鐘特性，所以16S rDNA作為分子標記被廣泛應用于細菌物種分類學的研究中[6]。16S rDNA由9個高變區(qū)和10個保守區(qū)構成，保守區(qū)反映細菌物種間的親緣關系，可根據其序列設計細菌的通用擴增引物，而高變區(qū)則反映細菌物種間的差異，可根據其序列設計通用引物對細菌進行鑒定分類，雖然高變區(qū)無法準確地將所有細菌分類到種屬水平，但依靠某些高變區(qū)仍可在特定的分類水平上預測細菌。例如：V3區(qū)在鑒定檢測病原體的種屬方面效果最佳；V4區(qū)為半保守高變區(qū)，在門類鑒定水平與完整16S rDNA序列的分辨率相近；V6區(qū)在鑒定炭疽病菌方面最為準確[7-8]。由于法庭科學領域更關注個體間的分類特征差異與檢測鑒定時效的特點，無須過多關注基因功能相關的編碼區(qū)序列，因此，16S rDNA在法醫(yī)學檢測中有很強的應用價值?；?6S rDNA保守區(qū)設計測序引物，建立各個可變區(qū)的復合擴增體系，利用HTS和生物信息學分析方法檢測出生物檢材中微生物群落的結構特征，是目前法醫(yī)學領域研究的新熱點。雖然多數(shù)工作還在實驗階段，但16S rDNA基因測序分析輔助偵查已經開始初步應用于法醫(yī)實踐工作[9]。早在20世紀，就有人提出尸體附近土壤微生物演替可以預測死亡時間[10]，發(fā)展至今，微生物學已經在死亡時間推測、死后毒（藥）物分析、個體識別以及藥物濫用等方面都展現(xiàn)出巨大的應用潛力和價值[9，11-14]。本文闡述了16S rDNA基因測序應用于法醫(yī)學領域的研究方法和相關測序技術，綜述了其測序在法醫(yī)學領域的研究進展，探討了16S rDNA在法醫(yī)學中的應用價值和潛力。

1 16S rRNA的相關測序技術

1.1 第一代測序技術

以Sanger提出的雙脫氧核苷酸鏈終止法和Maxam提出的化學降解法為代表的第一代測序技術在1977年完成第一個基因組序列（噬菌體X174）[15]，VAINIO等[16]研究活性淤泥中的培養(yǎng)樣本和未培養(yǎng)樣本，從多個菌落中提取16S rDNA并通過Sanger測序法來檢測微生物種群結構差異，發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)的樣本中絕大部分16S rDNA序列是未知的，但當時基因數(shù)據庫并沒有這些序列信息，只能推斷可能是變形桿菌的某種亞型，無法準確鑒別。其他一些對16S rDNA測序的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，但受限于當時的技術條件和數(shù)據庫信息，無法做進一步研究[17-18]。第一代測序技術結果精確并且操作簡單，促進了微生物在核酸序列檢測上的發(fā)展，但由于其通量所限，無法滿足微生物基因組學的測序需求[19]。

1.2 HTS技術

相比于第一代測序技術，HTS更適合微生物基因組學的研究，其通量更高，且無須進行微生物培養(yǎng)就可同時對樣本中所有微生物進行檢測，這使得對微生物群落進行細致分類和功能預測成為可能，HTS已迅速成為微生物基因組學的主要檢測方法。454測序平臺作為早期的HTS平臺，通量和準確率遠超于當時基于Sanger測序法的毛細管電泳[20]，同時有學者開始將微生物學與法醫(yī)學鑒定結合[21-22]。KAKIZAKI等[23]利用454測序平臺對溺水死者體內器官微生物16S rDNA位點的V7和V8兩個高變區(qū)進行特異性擴增和測序，這也是首次使用HTS技術來進行溺水死亡的法醫(yī)學鑒定。BENBOW等[24]通過454測序平臺對16S rDNA基因擴增測序，發(fā)現(xiàn)水中腐敗尸體表面的細菌在夏季和冬季有著明顯的差異。近年來，其他通量更高、成本更低的測序技術平臺迅速發(fā)展，454測序平臺被逐漸淘汰到市場邊緣，目前主流的微生物基因組測序平臺有Illumina測序平臺（美國Illumina公司）和Ion TorrentTM測序平臺（美國Thermo Fisher Scientific公司），在16S rDNA的研究中均有所應用[25-26]。

Illumina測序平臺的主要測序原理是邊測序邊合成（sequencing by synthesis，SBS）技術和可逆終止反應，這種方法很大程度上避免了同聚物測序時的相關錯誤和遺漏，在短時間內可以獲得海量測序數(shù)據[27]。根據不同的研究目的，可選擇最初的HiSeq及之后推出的 MiSeq、NextSeq、MiniSeq 和 NovaSeq 等測序平臺。除了這些常規(guī)通用的平臺外，美國Illumina公司還推出了專門適用于法醫(yī)遺傳學應用的MiSeq FGx測序平臺。Illumina測序平臺高精確度的數(shù)據和簡化的工作流程非常適合法醫(yī)微生物學的研究，基于該平臺的Nextera XT DNA文庫制備試劑盒縮短了文庫制備過程，靶向擴增16S rDNA的V3和V4高變區(qū)并針對擴增子優(yōu)化，得到微生物的系統(tǒng)發(fā)育分類信息。HABTOM等[28]比較了目前實驗室常見土壤微生物分析技術的有效性和可靠性，靶向擴增16S rDNA的V4高變區(qū)，結果表明，在土壤微生物研究中，MiSeq測序平臺的表現(xiàn)優(yōu)于Ion PGMTM&Ion ProtonTM快速高通量測序（美國Thermo Fisher Scientific公司）和Roche 454超高能量測序（美國Roche公司），但得出準確結論仍然需要系統(tǒng)的多因素分析。

Ion TorrentTM測序平臺進入HTS市場較晚，這一平臺擯棄了主流測序儀器的光學系統(tǒng)而采用半導體測序，將化學信號轉換為電信號，這種基于電化學檢測的半導體測序平臺憑借其測序效率和價格優(yōu)勢迅速成為主流HTS平臺之一。至今為止，共發(fā)布了四種Ion TorrentTM測序平臺，分別是Ion PGM（2010年）、Ion Proton（2012 年）、Ion S5（2015 年）和 Ion S5XL（2015年）。IonTorrentTM測序平臺半導體測序技術簡化了16S rDNA的研究過程，縮短了研究時間，其成本也是目前市場主流測序平臺中最低的，為實驗室提供了一種經濟高效的選擇[29-30]?；谠撈脚_的宏基因組試劑盒Ion 16STMMetagenomics試劑盒可以多重擴增細菌16S rDNA七個高變區(qū)（V2～V9），從種屬水平上獲得微生物群落的信息。JUNEMANN等[31]最早在Ion TorrentTM測序平臺上進行微生物學研究，通過靶向擴增16S rDNA的V6來比較兩種不同治療方案對慢性牙周炎患者齦下菌群差異和變化，從側面驗證了微生物學在疾病治療評價中的重要性。YOUNG等[32]利用Ion PGMTM測序系統(tǒng)比較了針對不同靶基因的四種分子標記的重復性和辨識度，并設置了空白對照組，以區(qū)分不同地點的土壤樣品。

1.3 16S rDNA的分析方法

16S rDNA作為目前法醫(yī)微生物學的主要研究對象，其基本研究流程包括微生物DNA的提取、16S rDNA高變區(qū)的PCR模板、文庫構建、模板制備、上機測序和測序數(shù)據的生物信息學分析。而數(shù)據分析流程主要包括：（1）測序數(shù)據的預處理。由于測序過程中各種影響因素會導致測序錯誤的發(fā)生，所以需要在分析之前排除或過濾這些數(shù)據，包括接頭、引物及標簽序列的去除，低質量序列過濾，序列去噪，嵌合體去除和數(shù)據均一化處理。（2）操作性分類單元（operational taxonomic unit，OTU）表的建立。OTU是指通過一定的距離度量方法計算兩兩不同序列之間的相似性，繼而設置特定的分類閾值，進行聚類操作，形成不同的分類單元，在進行微生物多樣性分析的時候，通常需要引入OTU，序列之間的相似水平大于97%[33]則劃分為同一種微生物。通過將OUT的代表序列與相應的微生物數(shù)據庫比對，進行物種注釋并建立OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹。（3）后續(xù)分析。包括Alpha多樣性（樣本內）、Beta多樣性（樣本間）、物種豐度及群落結構等分析，從而得到微生物群落內和群落之間的相互聯(lián)系和代謝特征等數(shù)據信息[34]。

2 16S rDNA測序在法醫(yī)學中的研究進展

2.1 生物檢材鑒定

判斷犯罪現(xiàn)場遺留的生物檢材類型和來源不僅是法醫(yī)物證學的重要內容，更是重建犯罪現(xiàn)場的重要依據。實際檢案中，人體生物性物質來源鑒定對作案過程的重建具有重要意義。傳統(tǒng)上，生物檢材的檢測主要依靠免疫反應或酶學試劑盒等方法，但存在假陽性和假陰性的干擾。生物檢材，如唾液、糞便及陰道分泌液等，含有大量的微生物，通過分析體液樣本中微生物群落的種屬、構成和豐度可以達到區(qū)分、鑒別不同體液的目的，所以，微生物檢測有望成為常規(guī)技術的補充[35]。GIAMPAOLI等[36]基于各種生物檢材的微生物特征，先通過16S rDNA鑒定某幾種細菌的存在，然后通過實時定量PCR（real time PCR，RT-PCR）對微生物群落中某些基因進行特異性擴增并檢測特定微生物信號，測定不同體液中這幾種細菌的濃度，以達到體液鑒定的目的，其研究成功分辨出唾液和糞便中的陰道分泌液。隨后，研究團隊將這項成果商業(yè)化，形成ForFLUID試劑盒。經八個國家的八個不同實驗室對5個樣品（其中1個為陰性對照）進行盲測，均可對陰道分泌液樣本準確識別，各實驗室還使用自己的樣本（包括唾液、糞便及陰道分泌液）進行驗證，除了2個糞便樣本外，其他樣本均可判斷是否含有陰道分泌液，證明了其穩(wěn)定性和準確性[37]。HANSSEN等[38]通過HTS對6種相互對照的實驗模型（純凈唾液、唾液+棉簽拭子、唾液+膠條、皮膚唾液+棉簽拭子、皮膚唾液+膠條、皮膚稀釋唾液+膠條）、144個來自口腔和皮膚的微生物樣本的16S rDNA基因進行測序并分析，以探索個體唾液微生物的穩(wěn)定性和特異性，結果顯示，微生物群落較好地區(qū)分了唾液和皮膚，而不同個體的唾液微生物具有特異性，交叉驗證的準確率為94%。ZOU等[39-40]使用通用引物對陰道分泌液、唾液、糞便、鼻腔分泌液中的微生物進行擴增，發(fā)現(xiàn)陰道分泌液中可能存在特異性細菌，而后又基于16S rDNA測序技術分析了73份來自漢族人群的唾液、陰道分泌液和糞便樣本，進一步證實了陰道分泌液中存在特異性細菌，這種細菌有望成為陰道分泌液鑒別的特異性指標。NAKANISHI等[41]使用PCR擴增檢測口腔唾液中的唾液鏈球菌和變異鏈球菌，在20份唾液樣品中均檢測到唾液鏈球菌和變異鏈球菌，而在精液、尿液、陰道分泌液中或皮膚表面上未檢測到此兩種細菌，說明這兩種鏈球菌可成為唾液鑒定的新的微生物標記。16S rDNA作為生物檢材鑒定的生物標記仍有一定的缺陷，BRENIG等[42]認為，相比全基因組測序，16S rDNA減少了可被發(fā)現(xiàn)的微生物范圍，而且對于微量檢材效果較差。

2.2 個體識別鑒定

個體識別是法醫(yī)物證學的兩大主要任務之一，對案件偵查和嫌疑人排除有著重大意義。目前，個體識別主要依賴STR和SNP等DNA指紋技術，有研究[12，43-44]表明，“定居”人體的微生物作為人體的“第二基因組”，其群落結構特征在一定的時間內穩(wěn)定存在，而不同的個體由于生活環(huán)境、飲食習慣等差異，導致個體所擁有的微生物群落特征各不相同，雖然某些微生物標記會隨著時間逐漸丟失，但在一定程度上仍可以將微生物作為個體識別的生物學標記。STAHRINGER等[45]分析了264份唾液樣品，發(fā)現(xiàn)個體間唾液微生物群落特征存在差異，而LEAKE等[46]的研究表明，通過唾液微生物可作為個體識別的一種補充，特別是同卵雙生子的鑒別。SCHMEDES等[47]通過人工智能中監(jiān)督學習的方法，在兩年半內選取三個時間點分別對12名健康個體皮膚位點的微生物進行取樣，而后通過16S rDNA基因測序鑒定其皮膚微生物群落特征，結果表明，14個皮膚取樣位點中，3個位點的個體識別準確率高達100%。此后，該研究團隊又分析了來自8名健康個體中3個皮膚位點微生物群落的分支特異性標記物，可判斷、分類身體部位，準確率達94%。這種用于鑒定個體皮膚微生物群落的靶向分析新型方法，能準確地辨識出個體的皮膚微生物，可為個體識別提供一種新的研究思路[48]。

2.3 土壤檢材鑒定

確定特定土壤檢材的來源是法醫(yī)實踐工作的重要組成部分，通過分析轉移到個體表面的土壤組成和特性，可輔助推斷犯罪現(xiàn)場、提供嫌疑人線索等[49-50]。土壤中微生物種類繁多且數(shù)量龐大，對土壤微生物群落結構特征的分析有助于區(qū)分不同來源的土壤[9]。SENSABAUGH[51]提出土壤微生物群落分析用于法醫(yī)學需要解決三個問題：（1）證明不同地方微生物群落的構成方式各不相同；（2）分析方法要將分辨性、穩(wěn)定性和可靠性結合起來；（3）統(tǒng)計方法必須客觀評估樣本間的相似性和非相似性。XU等[52]采集了33份土壤樣本，比較分析草地、森林土壤、北極圈土壤、紅樹林沉積土壤中的微生物群落多樣性信息，揭示了在不同類型的土壤中微生物存的豐度和組成有一定的規(guī)律：在門水平，變形菌門在紅樹林沉積土壤中主要微生物（豐度＞2%的微生物）中占90%以上，而在沙漠土壤中只有30%；在科水平，外硫紅螺旋菌科在紅樹林沉積土壤主要微生物為35%，但在其他幾種草地中都不到5%。YOUNG等[32]針對土壤微生物不同類別進行分類擴增，分別擴增了 16S rDNA（細菌）、18S rDNA（真核生物）、轉錄間隔區(qū)序列（internally transcribed spacer sequence，ITS，真菌）以及植物葉綠體基因trnL的內含子片段，比較四種擴增子測序結果對不同地區(qū)土壤的分辨度，研究結果顯示，16S rDNA、18S rDNA、ITS對于不同地區(qū)來源土壤均有一定分辨度，其中非細菌群落中的真菌，對不同地區(qū)的土壤區(qū)分度最高。YOUNG等[53]進一步評估了兩種土壤剖面技術：真核生物（包括特定細菌，真菌和植物）18S rRNA測序技術和中紅外（mid-infrared，MIR）光譜技術，對比六個法醫(yī)模擬現(xiàn)場和七個參考地點的土壤檢材，發(fā)現(xiàn)HTS技術補充了傳統(tǒng)的MIR光譜土壤剖面圖，能夠提供統(tǒng)計學上更好的區(qū)分能力，表明了微生物學16S rDNA在法醫(yī)學分析中的潛在應用。

2.4 死亡時間推斷

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷是法醫(yī)病理學研究中的難題，傳統(tǒng)方法主要依靠尸體現(xiàn)象或尸體內源性指標，影響因素較多。死亡后，微生物參與了尸體的腐敗過程，早期研究[54-56]證實，真菌群落的組成分布與尸體腐敗有關，尸體周圍微生物群落隨時間不斷演替，其變化參數(shù)可作為法醫(yī)學死亡時間推斷的輔助工具。OLAKANYE等[57]比較了動物尸體附近土壤和草地土壤，并設置陰性對照（只有土壤），通過16S rDNA基因測序鑒定細菌群落的構成，分析計算群落的香農指數(shù)和辛普森指數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，動物尸體附近土壤的pH值在一定時間內（180d）持續(xù)降低，而尸體細菌群落豐度和多樣性在30 d內持續(xù)增高，并明顯高于草地土壤和對照組，180 d后趨于草地土壤的構成，一定程度上證實了通過土壤微生物16S rDNA測序推斷死亡時間的可能性。KAKIZAKI等[23]對溺水尸體血液、器官中微生物和尸體附近水域水體微生物進行16S rDNA位點基因測序，發(fā)現(xiàn)二者的微生物種類差異較小，這種新的分子生物學方法可為溺水死亡的確定提供證據支持。HYDE等[58]研究發(fā)現(xiàn)，尸體腫脹期前后兩個時間點微生物群落從需氧菌為主轉變?yōu)閰捬蹙鸀橹?，尸體腐敗過程中微生物群落結構在不停地演替變化。PECHAL等[59]的研究也證實了以上結論，在尸體腐敗的各個階段都有各自主要的微生物群落，隨著時間演替，某些種屬的細菌豐度和積溫（某一時間內溫度的總和）呈明顯的負線性關系，并建立了相關數(shù)學模型推斷死亡時間，結果表明，在科水平，彎曲桿菌科、腸球菌科和普雷沃氏菌科等17科細菌的豐度總和可以預測96%的死亡時間，但仍需要綜合更多的樣本量、地理因素和季節(jié)因素進行分析。

2.5 毒品成癮機制

毒品成癮是一種長期反復、持續(xù)地以強制性自我給藥為特征的慢性復發(fā)性腦疾病，患者往往表現(xiàn)出對毒品的高度渴求和依賴。受經濟全球化和社會信息化的影響，毒品成癮已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。毒品成癮的機制十分復雜，法醫(yī)學者研究毒品的主要方向包括毒品的快速鑒定和成癮機制等。研究[60]表明，腸道微生物和大腦之間通過“腸-腦軸（gut-brain axis）”在免疫、內分泌、營養(yǎng)吸收等方面有著千絲萬縷的聯(lián)系。腸道微生物在神經遞質水平影響著個體大腦，與多種神經疾病相關，包括帕金森病、阿爾茨海默病、精神疾病和藥物依賴等。VOLPE等[61]比較了可卡因使用者和非可卡因使用者人群的腸道菌群組成，發(fā)現(xiàn)可卡因使用者腸道微生物比非使用者的擬桿菌豐度更高，但厚壁菌的豐度更低。心理因素，尤其心理壓力，是多種藥物成癮發(fā)展的關鍵性風險因素，而腸道微生物群落的改變可能導致個體心理應激反應和行為改變。從治療的角度來看，腸道微生物群落的恢復可以促進個體精神疾病的康復[62-64]。KIRALY等[65]通過小鼠實驗，給實驗組的小鼠飲用的水源含有腸道無法吸收的抗生素，使其腸道細菌大大減少，結果發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠大腦核團發(fā)生了改變，表現(xiàn)出對可卡因的敏感性顯著增強。NING等[13]使用條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）模型研究甲基苯丙胺對大鼠行為的影響，通過收集糞便樣本，對16S rDNA的V3～V4區(qū)進行HTS，結果顯示，注射了甲基苯丙胺的大鼠腸道微生物群落的多樣性和相對豐度更大，但厚壁菌顯著減少，除此之外還發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌屬和分枝桿菌屬被甲基苯丙胺抑制。近年來，腸道微生物群、大腦功能和個體行為之間的相互作用正逐步被證實[66]，而毒品成癮機制和人體微生物的關系需要進一步探索。

3 展 望

目前，微生物基因組學已是法醫(yī)學研究中的前沿熱點，其“微生物指紋”在個體識別和體液鑒定中有著自己獨特的優(yōu)勢，而其演替過程可以輔助推斷土壤檢材來源和死亡時間，也為毒品成癮機制的研究提供新的思路。但16S rDNA基因測序在實際應用中仍存在一些不足和限制，宏基因組學是以整體微生物群落為研究對象，包括細菌、真菌、古細菌等，而16S rDNA基因測序僅分析了細菌群落的結構。此外，由于微生物容易受環(huán)境因素及研究過程中各種干擾因素的影響，研究方法的穩(wěn)定性還有待提高，相關的生物信息學分析和統(tǒng)計方法尚不完善，其特異性和可靠性需進一步考證。不過，我們相信隨著測序技術與生物信息技術的進一步發(fā)展與完善，系統(tǒng)的研究方法和有效的質量控制進一步成熟，微生物鑒定將有望成為法醫(yī)學發(fā)展的一個新動力。