歐陽聰， 孫寧遠(yuǎn)， 薛 璐

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)研究所， 武漢 430074)

1 Plac8蛋白的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.1 plac8蛋白的發(fā)現(xiàn)

2000年，Tetsuya等用12.5 d的小鼠胚胎和小鼠子宮，通過cDNA微陣列技術(shù)，篩選出了15 264個小鼠發(fā)育相關(guān)的cDNA[1]。通過對這些cDNA的表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，最開始這些基因在胎盤和胚胎中的表達(dá)相似，12.5 d以后，高達(dá)720個基因在胚胎和胎盤中的表達(dá)開始呈現(xiàn)出顯著差異，289個基因在胎盤中高表達(dá)，且其中有61個基因是胎盤特異表達(dá)的基因[1]。進(jìn)一步地，Galaviz-hernandez等從這61個基因中挑選出3個基因，分別是plac1、plac8和plac9，并對plac8進(jìn)行了進(jìn)一步的研究[2]。白云等根據(jù)生物信息學(xué)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，plac8的氨基酸序列在不同物種之間的差異較大。在高等動物之間，plac8的同源性很高，高達(dá)87.8%，但是在兩棲動物和低等動物之間，plac8的同源性就很低只有20%～40%。這個現(xiàn)象說明在進(jìn)化早期，plac8的進(jìn)化并不穩(wěn)定[3]。

1.2 plac8蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Plac8在人類基因組上定位于4q13-4q21，含有5個外顯子，其mRNA全長829 bp，開放閱讀框翻譯112個氨基酸，所編碼的蛋白分子質(zhì)量為12.4 ku[2]。進(jìn)一步生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，plac8蛋白其氨基酸序列中10%以上的都是半胱氨酸，沒有信號肽[4]。在人類plac8的112個氨基酸中有15個是半胱氨酸，在小鼠的plac8的115個氨基酸中有16個是半胱氨酸。大多數(shù)半胱氨酸都來自于CXXC的結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)包含了3～4個分子內(nèi)的二硫鍵，該結(jié)構(gòu)是結(jié)合其底物的特殊位點(diǎn)[3]。這種兩邊是半胱氨酸的結(jié)構(gòu)一般與氧化還原相關(guān)蛋白的形成、異構(gòu)化和二硫鍵的減少相關(guān)[5]。哺乳動物中，沒有其他基因與plac8相似，但在植物中有一組基因叫FWL，它們的基因結(jié)構(gòu)都類似西紅柿基因FW2.2，并且它們的蛋白有跟plac8一樣的結(jié)構(gòu)域，都有一段序列富含半胱氨酸。實(shí)驗(yàn)證明FW2.2基因與西紅柿果實(shí)的數(shù)量跟大小緊密相關(guān)[6]。

2 Plac8的表達(dá)

2.1 plac8在胚胎中的表達(dá)

Plac8最先在8.5～12.5 d懷孕老鼠的胎盤中被發(fā)現(xiàn)，Northern印記實(shí)驗(yàn)證明它在胎盤中的表達(dá)量比在中期胚胎中的表達(dá)量多10倍以上。在胚胎進(jìn)入子宮之前，plac8只在滋養(yǎng)層中表達(dá)，在隨后的發(fā)育中，在滋養(yǎng)巨細(xì)胞和成膠質(zhì)細(xì)胞層中表達(dá)[2,7]。還有研究對plac8 mRNA在人類不同發(fā)育階段的早期胚胎的表達(dá)進(jìn)行了單胚胎定量分析。在卵母細(xì)胞、2-細(xì)胞期胚胎、4-細(xì)胞期胚胎、8-細(xì)胞期胚胎、異常受精桑葚胚中，未檢測到plac8 mRNA的表達(dá)，正常受精桑葚胚plac8 mRNA的檢出率為33%，囊胚檢出率為100%[7]。Plac8蛋白在所有人類卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段的早期植入前胚胎均有表達(dá)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。Plac8在斑馬魚早期胚胎表達(dá)量很高，并且在小鼠胚胎早期跟牛胚胎早期都有表達(dá)[7]。進(jìn)一步地，Rissoan等的實(shí)驗(yàn)證明，plac8在人類漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞中高表達(dá)，這表明plac8并不只是限制在子宮和胚胎中表達(dá)[4]。

2.2 plac8在各種組織中的表達(dá)

近來有很多文獻(xiàn)均表明，plac8在真菌、藻類、高等植物以及動物中都有表達(dá)[8]。Ledford等研究表明，plac8在心臟和大腦中不表達(dá)，在外周血白細(xì)胞、肝臟、闌尾和胸腺中低表達(dá)，在一些免疫細(xì)胞如吞噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中高表達(dá)，并且對這些免疫細(xì)胞對細(xì)菌的殺傷效果有著重要作用[9]。Maria等發(fā)現(xiàn)plac8在白色和棕色脂肪細(xì)胞的網(wǎng)膜和皮下高表達(dá)[10]。

2.3 plac8在各種癌癥中的表達(dá)

Plac8在一些癌癥中也有表達(dá)，如plac8在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且表達(dá)在胰腺癌細(xì)胞的質(zhì)膜內(nèi)側(cè)[11]，但在正常的胰腺細(xì)胞中沒有表達(dá)[11]。除了胰腺癌，plac8在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中表達(dá)水平降低，低表達(dá)水平的plac8伴隨著肝癌患者，其存活率降低。再通過構(gòu)建肝癌小鼠模型，過表達(dá)plac8的小鼠肝腫瘤體積明顯小于對照組[12]。除了胰腺癌和肝癌，plac8還在前列腺癌中有表達(dá)，Uehara等發(fā)現(xiàn)plac8與前列腺癌細(xì)胞的生長有關(guān)[13]。除此之外，Matia等在結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有plac8的表達(dá)，并且通過敲除plac8可以使結(jié)腸癌腫塊減小[10]。

3 Plac8的生物學(xué)功能

3.1 plac8與細(xì)胞增殖的關(guān)系

一般來說蛋白在體內(nèi)的分布跟其功能息息相關(guān)。Uehara等用人類胰腺癌細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)證明plac8與胰腺癌細(xì)胞的增殖有關(guān)[13]。Kaistha等發(fā)現(xiàn)，plac8在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)量很高，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲除胰腺癌細(xì)胞中的plac8基因，胰腺癌細(xì)胞的增殖顯著增加，這一結(jié)果顯示plac8蛋白是胰腺癌腫瘤形成的中心調(diào)節(jié)因子[11]。除此之外，也有文章證明plac8與RAS及p53等原癌基因相結(jié)合，并在胰腺癌的增殖中扮演著重要的角色[14]。Zou 等通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明不論在體外還是體內(nèi)，下調(diào)plac8可以激發(fā)肝癌細(xì)胞的活力，促進(jìn)增殖以及肝癌細(xì)胞的形成。并且他們還發(fā)現(xiàn)plac8的表達(dá)量下降會激活PI3K/Akt/GSK3β/Wnt/β-catenin等通路從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖[15]。

3.2 plac8與細(xì)胞分化的關(guān)系

Plac8是棕色脂肪細(xì)胞分化必需有的蛋白，它的失活會導(dǎo)致寒冷耐受不良癥，遲發(fā)性肥胖和棕色脂肪細(xì)胞功能受損[16]。Plac8的過表達(dá)會激活C/EBPβ和 Prdm16這兩個信號通路，隨后plac8和C/EBPβ相關(guān)的誘導(dǎo)因子一起促進(jìn)翻譯。綜上所述，plac8是棕色脂肪細(xì)胞分化和功能非常重要的上游調(diào)控因子[16]。另外一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)plac8在白色脂肪細(xì)胞中也有表達(dá)，并且在plac8敲除的小鼠中，胚胎成纖維細(xì)胞不能誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞。在體外，plac8的缺失導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的腫大從而增加了白色脂肪但是脂肪細(xì)胞的總數(shù)減少。在體外，plac8是脂肪合成所需的C/EBPβ的上游調(diào)節(jié)因子。在體內(nèi)，plac8對于白色脂肪細(xì)胞的分化的調(diào)節(jié)作用不是必須，但需要它調(diào)節(jié)白色脂肪細(xì)胞的數(shù)量[10]。Wu等發(fā)現(xiàn)plac8作用于PKCe-ERK2信號通路從而可以抑制急性髓系白血病細(xì)胞系的分化過程[17]。

3.3 plac8與細(xì)胞免疫之間的關(guān)系

Plac8廣泛存在于各種免疫細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，這提示我們plac8可能在免疫過程中發(fā)揮著重要作用[18]。Mourtada-Maarabouni等發(fā)現(xiàn)缺失plac8基因的胚胎可以發(fā)育成個體，但是會出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的缺失[19]。如果Plac8基因是在成熟的個體上被敲除，吞噬細(xì)胞的吞噬效率會降低，但是不會影響其吞噬作用[9]。在小鼠體內(nèi)敲除plac8基因后，相比于正常小鼠更容易感染肺炎桿菌，也更易于得腹膜炎。Johnson等研究發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)閜lac8基因敲除小鼠體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞不能完全清除生殖道的感染[20]。然而，通過之前的研究可知，plac8蛋白沒有抑菌和殺菌的作用，也與表皮細(xì)胞的穿孔途徑?jīng)]有關(guān)系。所以，plac8可能與生物體免疫消除過程中的非細(xì)胞溶解機(jī)制有關(guān)[21]。

Plac8除了跟免疫清除(機(jī)體通過免疫應(yīng)答更有效地清除進(jìn)入體內(nèi)的抗原異物)有關(guān)，還跟超敏反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)。當(dāng)皮膚暴露于過敏源的時候，就會激活淋巴結(jié)，它會激活CD4+T細(xì)胞，同時產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)。引流淋巴結(jié)的活化伴隨著一系列基因的急劇增加，其中就有plac8基因[22]。一些研究表明，plac8通過巨噬細(xì)胞，不僅介導(dǎo)了CXCL1(趨化因子1)的分泌，還調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-6的分泌[23]。Plac8的缺失可以抑制中性粒細(xì)胞的補(bǔ)充和IL-6的分泌，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)顯著減弱[24]。

3.4 plac8與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系

Rogulski等發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)plac8基因的兔子的纖維母細(xì)胞中，通過阻滯G2/M期，而抑制了細(xì)胞的凋亡，還促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。他們進(jìn)一步分析其潛在的分子機(jī)理，結(jié)果顯示plac8基因是c-Myc的靶基因。在c-Myc-p53通路中，plac8正是通過和Akt1或Mdm2的相互作用，從而調(diào)控了細(xì)胞的存活和增殖[25]。也有實(shí)驗(yàn)室通過酵母雙雜交和免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)plac8能夠和調(diào)控細(xì)胞凋亡的磷脂拼接酶(PLSCRI)共定位。RNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)plac8基因作為一個負(fù)調(diào)控基因，它處于PLSCR1的下游，在分子水平上抑制細(xì)胞凋亡[26]。Mourtada-Maarabouni等證明plac8基因在2種人類黏附細(xì)胞系(人類胚胎腎細(xì)胞系HEK293t和人白血病細(xì)胞株CEMC7)中有抗凋亡的作用，并首次證明plac8的產(chǎn)物可以促進(jìn)人類淋巴細(xì)胞的凋亡[19]，從而證實(shí)了plac8在不同細(xì)胞系中可以發(fā)揮完全相反的作用。

3.5 plac8與腫瘤之間的關(guān)系

Plac8在幾種常見的癌癥中如胰腺癌，前列腺癌，結(jié)腸癌和肝癌等有重要作用[11,13-15,27-29]。除了在體外證實(shí)了plac8與胰腺癌細(xì)胞的增殖有關(guān)之外，Kaistha[11,30]等在胰腺癌模型老鼠上敲除plac8基因，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長更迅速，從而證實(shí)在胰腺癌中，plac8蛋白可以抑制腫瘤的生長。還有研究表明plac8基因的激活對胰腺癌的成長很重要，在細(xì)胞系中沉默plac8基因，可以通過阻斷自噬來阻斷腫瘤的信息。并且plac8基因的沉默還會導(dǎo)致PDA(胰腺導(dǎo)管腺癌)模型小鼠的遺傳失活。綜上所述，plac8基因是自噬機(jī)制重要的調(diào)節(jié)因子，定位于溶酶體，能促進(jìn)溶酶體和自噬體的融合。因此，在PDA的發(fā)展過程中，plac8可以提供致癌基因的突變和自噬誘導(dǎo)之間的機(jī)械性聯(lián)系[14]。除了胰腺癌，Li等報(bào)道在結(jié)腸癌的老鼠模型中敲除內(nèi)源基因plac8，腫塊會比較小，也會減少浸染，降低ERK2的磷酸化[30]，UEHARA等發(fā)現(xiàn)plac8與前列腺癌細(xì)胞的生長有關(guān)，plac8的上調(diào)以維持前列腺癌細(xì)胞的生長[13]。McMurray等發(fā)現(xiàn)plac8的表達(dá)會影響p53的突變，還影響了Ras的活性，并且通過RNA干擾下調(diào)plac8，能完全降低小鼠結(jié)腸癌形成，這對癌癥的治療有一定的意義[27]。Plac8在肝癌中也有作用，Zou等通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，證明不論在體外還是體內(nèi)，下調(diào)plac8可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的活力，增殖以及肝癌細(xì)胞的形成[15]。通過對肝癌病人的組織切片觀察和q-PCR結(jié)果分析可知，plac8在肝癌發(fā)生過程中是降低的，并且低水平的plac8導(dǎo)致了肝癌病人存活率的下降[12]。Plac8的表達(dá)可以作為肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)記，但是在胰腺和結(jié)腸癌中卻是相反的情況。在肝臟中，plac8的低表達(dá)跟癌癥形成有關(guān)[28]。

3.6 plac8與細(xì)胞自噬的關(guān)系

Kinsey[14,31]等證明plac8蛋白是一個重要的自噬體調(diào)節(jié)因子，它位于溶酶體腔中，促進(jìn)溶酶體和自噬體的融合。有文獻(xiàn)報(bào)道，plac8可以誘導(dǎo)原癌基因的突變，這個過程對自噬的形成還是惡性腫瘤的形成都很重要，并且，plac8成了原癌基因跟自噬之間的聯(lián)系。Balakrishnan等進(jìn)一步研究可知在溶酶體跟自噬體融合的時候，plac8維持著溶酶體的完整性并且保持著溶酶體腔的活性[32]。

4 結(jié)語

Plac8的氨基酸序列在不同的物種中不盡相同，但都含有大量的半胱氨酸，這在一定程度上提示了它在有機(jī)體生理活動中所扮演的角色。近年來大量的研究均證明plac8在細(xì)胞水平上參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、自噬等一系列生理活動。考慮到在不同的細(xì)胞中，plac8會通過結(jié)合不同的靶蛋白，調(diào)控不同的信號通路來行使功能，這也許能部分解釋為什么在不同的細(xì)胞中plac8的調(diào)控模式并不相同甚至相反。除了在細(xì)胞水平上參與了一系列生理活動之外，plac8蛋白的表達(dá)也與一些腫瘤的產(chǎn)生、增殖、遷移、轉(zhuǎn)化相關(guān)，但其相關(guān)的分子機(jī)制尚未闡述清楚，還需要通過大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步地研究。