陳淑珍

(廈門(mén)醫(yī)學(xué)院 病原生物與免疫學(xué)教研室， 廈門(mén) 361023)

炎癥小體是由感受分子、接頭蛋白和效應(yīng)分子組成的多蛋白復(fù)合物，是機(jī)體抵抗病原體侵害和識(shí)別自身危險(xiǎn)信號(hào)的重要分子結(jié)構(gòu)。其中，感受分子包括多種NOD樣受體分子(NOD-like receptors, NLRs)，如NLRP3、NLRC4，以及AIM2、IFI16、RIG-I等；接頭蛋白為ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)；效應(yīng)分子主要包括半胱天冬蛋白酶前體Pro-Caspase-1和Pro-Caspase-11。當(dāng)細(xì)胞受到病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或者危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)刺激時(shí)，促進(jìn)炎癥小體組裝活化，剪切Pro-Caspase-1，使白細(xì)胞介素1β (interleukin 1β, IL-1β)和IL-18等促炎細(xì)胞因子成熟釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，參與固有免疫防御[1]。

1 NLRP3炎癥小體

目前研究已發(fā)現(xiàn)10余種炎癥小體，包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRP12、NLRC4、NLRC5、RIG-I、AIM2及IFI16等。其中，NLRP3炎癥小體可被多種病毒、細(xì)菌、代謝產(chǎn)物等激活，研究最為深入。目前已知細(xì)胞死亡后釋放的ATP、核酸等體內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)分子能激活NLRP3炎癥小體，具有晶體特征的鋁佐劑、硅石、木棉以及體內(nèi)產(chǎn)生的膽固醇晶體、尿酸鹽晶體(monosodium urate, MSU)和β-淀粉樣蛋白，還有某些病毒(如流感病毒)和胞內(nèi)菌(如李斯特菌)也能激活NLRP3炎癥小體。病原體產(chǎn)生的毒素分子，如尼日利亞菌素(nigericin)和刺尾魚(yú)毒素(maitotoxin, MTX)也能通過(guò)NLRP3發(fā)揮毒性作用。此外，NLRP3基因突變可導(dǎo)致家族性冷因性自體發(fā)炎癥候群、家族冷性蕁麻疹、穆-韋二氏綜合征等多種自身免疫疾病，而II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、痛風(fēng)等疾病近年也被證實(shí)與NLRP3炎癥小體密切相關(guān)[1-3]。

2 NLRP3炎癥小體激活機(jī)制

NLRP3 炎癥小體活化分泌促炎因子需要雙重信號(hào)：信號(hào)1——啟動(dòng)信號(hào)，如通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)等激活Toll樣受體 (Toll-like receptors, TLRs)信號(hào)通路，活化核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)和MAPK，誘導(dǎo)NLRP3及 Pro-IL-1β 和 Pro-IL-18表達(dá)；信號(hào)2——激活信號(hào)，ATP等激動(dòng)劑通過(guò)使鉀離子外流等作用，促進(jìn)炎癥小體復(fù)合物組裝，進(jìn)而剪切Pro-Caspase-1形成活化的Caspase-1，后者將Pro-IL-1β和Pro-IL-18剪切為成熟形式釋放至胞外[1-2]。

NLRP3炎癥小體能被多種PAMPs或DAMPs激活，其激活機(jī)制的研究近年來(lái)取得較大進(jìn)展但仍不明確。以往研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體活化主要有以下幾種分子機(jī)制：1)溶酶體損傷。許多顆粒性物質(zhì)如MSU、硅石等經(jīng)內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，形成吞噬體后與溶酶體融合，引起溶酶體損傷促使蛋白酶釋放到胞漿而激活NLRP3炎癥小體。2)鉀離子外流。某些病原體可通過(guò)破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性誘導(dǎo)鉀離子外流激活NLRP3炎癥小體。胞外ATP結(jié)合細(xì)胞表面P2X7受體，導(dǎo)致胞內(nèi)鉀離子濃度降低，還可通過(guò)在細(xì)胞膜打孔，使胞外激活物經(jīng)膜小孔入胞激活NLRP3炎癥小體。3)活性氧(reactive oxygen species, ROS)。大多數(shù)NLRP3激活劑能誘導(dǎo)ROS生成，后者主要來(lái)源于線(xiàn)粒體，運(yùn)用ROS抑制劑或清除劑能阻止激活劑活化NLRP3炎癥小體。4)線(xiàn)粒體損傷。NLRP3炎癥小體活化時(shí)，NLPR3和ASC遷移至線(xiàn)粒體外周，造成線(xiàn)粒體損傷產(chǎn)生大量ROS，釋放線(xiàn)粒體DNA及脂類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入胞漿，激活NLRP3炎癥小體。5)鈣離子信號(hào)。與鉀離子相反，胞漿中鈣離子濃度升高能活化NLRP3炎癥小體。誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子或提高培養(yǎng)液中鈣離子濃度均可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化。6)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。ERS通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)依賴(lài)或非依賴(lài)途徑活化NLRP3炎癥小體。多種ERS誘導(dǎo)劑通過(guò)刺激NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)Pro-IL-1β表達(dá)或升高胞內(nèi)ROS水平、鈣離子濃度或促進(jìn)線(xiàn)粒體損傷等方式活化NLRP3炎癥小體。此外，隨著研究深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不少新機(jī)制，如絲蘇氨酸激酶Nek7可以直接結(jié)合NLRP3促進(jìn)炎癥小體組裝和活化；BRCC3去泛素化酶可將NLRP3去泛素化提高其蛋白水平從而激活NLRP3炎癥小體等[1-4]。

3 NLRP3炎癥小體負(fù)調(diào)控機(jī)制

NLRP3炎癥小體激活需要精確調(diào)控，在正常生理情況下，適度激活有利于清除病原體或有害物質(zhì)，同時(shí)機(jī)體啟動(dòng)負(fù)調(diào)控通路，維持免疫反應(yīng)平衡；若異常地持續(xù)活化則可導(dǎo)致慢性炎癥或自身免疫疾病等。以下將重點(diǎn)綜述NLRP3炎癥小體負(fù)調(diào)控的研究進(jìn)展。

3.1 miRNA

微小RNA (microRNA, miRNA)在細(xì)胞中表達(dá)豐富，行使多種生物學(xué)功能，近期研究表明參與炎癥小體負(fù)調(diào)控。如miR-223 可通過(guò)特異性結(jié)合NLRP3 mRNA的 3′-非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)，抑制其轉(zhuǎn)錄與翻譯。某些病毒利用miRNA在不同物種間的高度保守性，侵染時(shí)產(chǎn)生miRNA抑制炎癥小體活化以避免誘發(fā)宿主機(jī)體免疫反應(yīng)。如EB病毒 (Epstein-Barr virus, EBV)模擬miR-223編碼產(chǎn)生miR-BART15，可特異性結(jié)合到NLRP3 3′-UTR的相同位點(diǎn)以抑制NLRP3轉(zhuǎn)錄[1,3]。隨后，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不少miRNA參與負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體。miR-146a缺失可增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞活化，在miR-146a缺失的小鼠糖尿病模型中巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β 和 IL-18表達(dá)量均上升[5]。而在佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的滑膜細(xì)胞中，miR-20a特異性靶向TXNIP(thioredoxin interaction protein)mRNA的3′-UTR，通過(guò)抑制TXNIP表達(dá)進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體活化[6]。Wang等報(bào)道m(xù)iR-9通過(guò)抑制JAK1 (Janus kinase 1)/STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1)信號(hào)通路抑制NLRP3炎癥小體活化并減輕動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥[7]。

3.2 泛素化與TRIM家族蛋白

泛素化是指泛素分子在泛素相關(guān)酶E1、E2、E3作用下，對(duì)目標(biāo)蛋白賴(lài)氨酸位點(diǎn)進(jìn)行泛素修飾，降解目標(biāo)蛋白的過(guò)程，是蛋白降解的一種途徑。目前多項(xiàng)研究表明泛素化可調(diào)控NLRP3 炎癥小體。Bednash等報(bào)道A20通過(guò)抑制NF-κB通路負(fù)調(diào)控NLRP3 轉(zhuǎn)錄;隨后發(fā)現(xiàn)A20還能抑制 IL-1β第133位賴(lài)氨酸泛素化，該位點(diǎn)的泛素化被認(rèn)為是IL-1β成熟分泌所需的，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體；在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中，A20缺失，小鼠細(xì)胞因子分泌增加，Caspase-1活化增強(qiáng)，病情顯著加劇[8]。

TRIM家族蛋白(tripartite-motif protein)由于具有3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域而得名，這3個(gè)結(jié)構(gòu)域從氨基端到羧基端依次為鋅指結(jié)構(gòu)域、B-box結(jié)構(gòu)域和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。目前發(fā)現(xiàn)的TRIM家族蛋白很多被證明具有泛素E3連接酶活性而參與細(xì)胞分化、凋亡、抗病毒免疫等過(guò)程。新近證據(jù)表明其廣泛參與調(diào)節(jié)炎癥小體活化。TRIM20 (也稱(chēng)為pyrin或MEFV)是最早發(fā)現(xiàn)與NLRP3炎癥小體相關(guān)的TRIM蛋白，其羧基端無(wú)義突變導(dǎo)致家族性地中海熱，小鼠TRIM20異常可提高Caspase-1活性和機(jī)體對(duì)內(nèi)毒素的易感性。TRIM20中PYD結(jié)構(gòu)域可與ASC中PYD結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合，阻止ASC招募其他分子而抑制炎癥小體形成。TRIM30作為跨膜接頭蛋白，既能夠通過(guò)降解TLR信號(hào)通路中TAB2/3 (TAK1-associated binding protein 2/3)負(fù)調(diào)控NF-κB活化，也能抑制NLRP3對(duì)多種配體的應(yīng)答。TLR激活后可誘導(dǎo)TRIM30表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到ATP、二氧化硅、MSU等刺激時(shí)，TRIM30通過(guò)抑制ROS產(chǎn)生而負(fù)調(diào)控NLRP3活化[1]。最近，Song等報(bào)道TRIM31可直接與NLRP3結(jié)合，通過(guò)促進(jìn)NLRP3 48位賴(lài)氨酸泛素化及蛋白酶體降解負(fù)反饋調(diào)控NLRP3炎癥小體活化[9]。

3.3 NO

一氧化氮(nitric oxide, NO)在機(jī)體多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如免疫反應(yīng)、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)、血液循環(huán)等。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，NO參與控制感染、生成細(xì)胞因子、介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)血管反應(yīng)等。我們以往研究發(fā)現(xiàn)NO作為炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)分子，能夠抑制ASC寡聚體形成、Pro-Caspase-1剪切以及IL-1β和IL-18成熟。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthases, iNOS)缺失，小鼠體內(nèi)NLRP3依賴(lài)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生顯著增加，且LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥病死率顯著提高。機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)NO通過(guò)維持線(xiàn)粒體穩(wěn)定負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體[10]。同時(shí)，另有兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)IFN-γ 誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO通過(guò)對(duì)NLRP3蛋白進(jìn)行亞硝基化作用抑制其招募ASC，從而負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體激活[11]。

3.4 COPs和POPs蛋白

炎癥小體組成分子一般含有PYCARD結(jié)構(gòu)域，其他含有PYCARD結(jié)構(gòu)域的蛋白能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合炎癥小體組成蛋白，阻止炎癥小體復(fù)合物組裝。這類(lèi)炎癥小體抑制性蛋白包括COPs (CARD-only proteins)、 POPs (PYD-only proteins)、NLRP10和pyrin等。COPs 蛋白與Caspase-1的CARD結(jié)構(gòu)域高度同源，包括COP1、INCA、Caspase-12及Nod2-S等，可與 Pro-Caspase-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ASC阻礙炎癥小體組裝。其中，Caspase-12研究較透徹，該基因敲除的小鼠能較好地耐受LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥。POPs包括POP1、POP2、POP3和POP4等。POP1與ASC的PYD結(jié)構(gòu)域同源性高達(dá)64%，可干擾ASC與NLRP3結(jié)合，抑制炎癥小體復(fù)合物組裝。POP2雖也含有PYD結(jié)構(gòu)域，但其與NLRs的結(jié)合力較弱且不與NLRP3結(jié)合。新近發(fā)現(xiàn)的POP3可抑制AIM-2炎癥小體而POP4與POP2高度相似，也不結(jié)合NLRP3。同時(shí)，POP1、POP2和POP4均能通過(guò)抑制NF-κB的活性減少Pro-IL-1β生成。NLRP10只含有PYD和NACHT結(jié)構(gòu)域，可自身寡聚化但不能招募活化Pro-Caspase-1，從而抑制炎癥小體。Pyrin即前文所述的TRIM20，可干擾NLRP3與ASC 組裝，還可結(jié)合其他類(lèi)型炎癥小體，抑制Caspase-1剪切[1,11]。

3.5 自噬

在哺乳細(xì)胞內(nèi)，自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞自我保護(hù)過(guò)程，通過(guò)降解異常蛋白或損傷的細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。近年研究表明，自噬可通過(guò)吞噬和降解炎癥小體組分，如泛素化NLRP3和ASC等來(lái)降解和抑制炎癥小體，還可通過(guò)線(xiàn)粒體自噬清除受損線(xiàn)粒體以減少線(xiàn)粒體ROS或線(xiàn)粒體DNA釋放，進(jìn)而負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體。在巨噬細(xì)胞中，抑制ATG16L1 (autophagy gene 16L1)、LC3B (autophagy protein microtubule-associated protein 1 light chain-3B)或Beclin1 (moesin-like BCL2-interacting protein)表達(dá)能夠?qū)е戮€(xiàn)粒體膜電位降低、線(xiàn)粒體ROS產(chǎn)生及線(xiàn)粒體DNA釋放，促進(jìn)NLRP3 炎癥小體激活，誘導(dǎo)炎性相關(guān)疾病。在流感病毒感染的小鼠模型中，RIPK2 (receptor interacting protein kinase 2)蛋白經(jīng)由線(xiàn)粒體自噬負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體[2,4,12]。Zhong等報(bào)道LPS 激活巨噬細(xì)胞NF-κB通路增強(qiáng)p62轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)線(xiàn)粒體自噬而負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體[13]。

3.6 I型干擾素

I型干擾素(interferon, IFN)分為IFN-α和IFN-β，是病毒感染早期機(jī)體產(chǎn)生的抗病毒細(xì)胞因子，參與調(diào)控NLRP3炎癥小體激活。Guarda等報(bào)道，I型干擾素通過(guò)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-10而促進(jìn)STAT3轉(zhuǎn)錄，從而降低Pro-IL-1β表達(dá)；同時(shí)通過(guò)促進(jìn)STAT1第701位酪氨酸的磷酸化負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體。I型干擾素還能活化SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1)誘導(dǎo)Rac1泛素化降解以減少ROS產(chǎn)生，最終抑制NLRP3炎癥小體活化。此外，I型干擾素還可通過(guò)調(diào)控下游基因，如編碼25-羥基膽固醇酶Ch25h的轉(zhuǎn)錄，使膽固醇轉(zhuǎn)化為25-羥基膽固醇，減少Pro-IL-1β表達(dá)而抑制NLRP3炎癥小體激活[3,14]。

3.7 其他

除上述研究較深入的機(jī)制外，近期發(fā)現(xiàn)一些分子也可抑制NLRP3炎癥小體激活。IL-18結(jié)合蛋白(IL-18 binding protein, IL-18BP)，IL-18的天然拮抗劑，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并抑制NLRP3的表達(dá)[15]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子1 (heat shock transcription factor 1, HSF1)通過(guò)激活β-catenin抑制XBP-1依賴(lài)的NLRP3炎癥小體激活和IL-1β釋放，抑制肝臟缺血再灌注導(dǎo)致的炎癥損傷[16]。比較基因組學(xué)鑒定蛋白-58 (comparative gene identification-58，CGI-58)通過(guò)維持PPAR-γ信號(hào)通路及線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)以抑制高脂飲食誘導(dǎo)活化NLRP3炎癥小體[17]。在巨噬細(xì)胞中，一氧化碳抑制NLRP3炎癥小體組成蛋白互作，通過(guò)維持線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)，減少線(xiàn)粒體ROS及線(xiàn)粒體DNA釋放而抑制NLRP3炎癥小體激活以及IL-1β和IL-18成熟和分泌[2]。神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(dopamine, DA)可通過(guò)細(xì)胞膜上多巴胺受體D1 (dopamine D1 receptor, DRD1)激活胞內(nèi)第二信使環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)信號(hào)通路，cAMP與NLRP3結(jié)合并誘導(dǎo)NLRP3發(fā)生泛素化降解，抑制NLRP3炎癥小體激活[18]。在未激活狀態(tài)下，芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)存在于胞質(zhì)中，與伴侶分子結(jié)合不具有轉(zhuǎn)錄活性；在一些外源化合物如多環(huán)芳烴作用下，AhR與伴侶分子解離，入核與芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AhR nuclear translocator, ARNT)形成異源二聚體，結(jié)合于NLRP3基因啟動(dòng)子的外源物反應(yīng)元件，干擾NLRP3正常轉(zhuǎn)錄[2]。

此外，G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白3 (G protein signaling modulator-3, GPSM3)通過(guò)與NLRP3分子羧基端LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合而抑制NLRP3炎癥小體。LRRFIP2 (leucine-rich repeat Fli-I-interacting protein 2)通過(guò)直接與NLRP3相互作用或結(jié)合Caspase-1底物抑制蛋白Flightless-I抑制Caspase-1剪切IL-1β和IL-18。IκB 激酶 α (IκB kinase subunit α, IKKα)可結(jié)合ASC，從而抑制其與NLRP3組裝成炎癥小體。作為新近發(fā)現(xiàn)的一種NLRP3炎癥小體負(fù)調(diào)控蛋白，孤核受體小異源二聚體伴侶(small heterodimer partner, SHP)與NLRP3 結(jié)合后轉(zhuǎn)移至線(xiàn)粒體，以阻斷NLRP3與ASC結(jié)合干擾炎癥小體活化。SHP缺失可導(dǎo)致NLRP3炎癥小體過(guò)度活化而引起多種炎癥性疾病，如急性腎壞死和痛風(fēng)等[2]。

一些小分子化合物也被報(bào)道可抑制NLRP3炎癥小體，深海魚(yú)油中的Omega-3 (ω-3)多不飽和脂肪酸調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體120 (G protein-coupled receptor 120, GPR120)和GPR40以及下游β-arrestin-2抑制NLRP3炎癥小體的激活[19]。植物化合物如漢黃芩苷、大黃素、白藜蘆醇等也有研究證明可抑制NLRP3炎癥小體活化[20]。

4 小結(jié)與展望

近年來(lái)炎癥小體相關(guān)研究獲得較大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)多種外源因素或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)可誘導(dǎo)炎癥小體活化，但對(duì)于NLRP3炎癥小體活化通路和調(diào)控機(jī)制，特別是對(duì)于機(jī)體為避免過(guò)度炎癥反應(yīng)如何進(jìn)行負(fù)調(diào)控維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的機(jī)制了解仍有限。目前報(bào)道的NLRP3炎癥小體負(fù)調(diào)控機(jī)制主要有miRNA、泛素化、TRIM蛋白、自噬、COPs、POPs、NO、I型干擾素等。另外，有多種食物和天然植物活性成分被證明可負(fù)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體活化，可為干預(yù)和抑制過(guò)度活化NLRP3炎癥小體提供潛在作用分子。研究機(jī)體對(duì)NLRP3炎癥小體的負(fù)調(diào)控機(jī)制，對(duì)相關(guān)感染性疾病、自身免疫性疾病等預(yù)防和治療至關(guān)重要，可為其提供潛在干預(yù)靶點(diǎn)和治療策略。