劉偉 張敏佳 周雅琳 李雍 許雅君

LIU Wei, ZHANG Minjia , ZHOU Yalin , LI Yong, XU Yajun.

高濃度的細顆粒物(空氣動力學直徑小于或等于2.5μm 的顆粒物，簡稱PM2.5) 是大氣環(huán)境中危害最大的污染物之一[1]。Cohen等[2]于2015年在《Lancet》發(fā)表研究報告指出，PM2.5長期暴露造成420萬死亡和1.031億傷殘調整壽命年(DALYs)，分別占全球死亡和DALYs的7.6%和4.2%。有研究表明孕期暴露于PM2.5會導致新生兒低出生體重[3-4]，并可能導致線粒體損傷進而導致子代心臟毒性[5]。諸多研究表明，PM2.5發(fā)揮毒性作用的機制與氧化損傷和炎癥反應有著密切的聯(lián)系[6-7]。

本文就膳食中天然存在的成分槲皮素能否拮抗PM2.5造成的健康損害進行探索，以期降低空氣污染所致的疾病負擔發(fā)生的風險。槲皮素(quercetin)是植物界分布最廣的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜以及一些中草藥中[8]，是人類飲食中最主要的生物類黃酮，具有抗炎、抗纖維化、調節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學功能，且槲皮素在孕期使用相對安全無毒。1982年，Willhite[9]就曾報道大鼠整個孕期服用2～2 000 mg/kg槲皮素對胎鼠均沒有明確的致畸作用，提示其用于孕期的安全性。

基于上述研究背景，對小鼠孕期及哺乳期進行PM2.5染毒，同時進行槲皮素干預，并在產(chǎn)后3天、10天、21天及5周測定仔鼠4個時間的臟器重量和臟器系數(shù)(包括心、肝、脾、肺、腎)，并測量仔鼠小腸長度和大腸長度，旨在探索PM2.5對子代小鼠發(fā)育的影響及槲皮素對該影響的干預效果。

材料與方法

一、材料

2.設備和儀器：電子天平(SPN3001F，奧豪斯，上海)、電子天平(BS2000S，賽多利斯，德國)、小動物麻醉機(VMR，Matrx，美國)、冷凍干燥機(ERV085, Millrock,美國)。

3.實驗動物：健康成年SPF級ICR孕鼠60只，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，許可證號SCXK(京)2016-0010。動物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，溫度(22±2) ℃，相對濕度50%～60%，晝夜照明時間為12 h：12 h。

二、方法

1. PM2.5采集和制備：于2016年11月15日到2017年4月30日在北京市海淀區(qū)學院路某高層建筑的六層平臺采集PM2.5樣本，采用TH-150C型號智能中流量(TSP)采樣器(天虹智能儀器表廠，武漢)將PM2.5樣品收集在石英濾膜上。用干凈消毒的手術剪將膜剪成3～4 ×0.5 cm大小后放入潔凈燒杯中，加入90 ml的消毒去離子水，并用保鮮膜封口。水浴超聲提取20 min，加冰保持水溫在20 ℃以下，重復三次，將提取液冷凍用六層滅菌紗布過濾，收集洗脫液，使用冷凍干燥機(ERV085, Millrock, USA)進行干燥24 h后，刮取，稱重。用無菌 PBS 配制成濃度為15 mg/kg的溶液，-20℃避光保存。

2.實驗操作：各組母鼠于孕期第3、6、9、12、15天和產(chǎn)后第3、6、9、12、15、18天，在3%異氟烷短效氣體麻醉下進行氣管滴注。除空白對照組外，其余各組滴注PM2.5溶液(15 mg/kg)，空白組給予相應劑量的干凈濾膜洗脫液；各組孕鼠于孕期和哺乳期每天灌胃，空白對照組和PM2.5模型組給予0.15%羧甲基纖維素鈉灌胃，槲皮素三個干預組分別予以50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg的槲皮素羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃。記錄母鼠孕期體重變化，所有母鼠自然分娩，觀察記錄自然分娩的時間、生產(chǎn)的只數(shù)及性別。分娩后各窩仔鼠均母乳喂養(yǎng)，記錄母鼠哺乳期體重變化，生后3天將每窩仔鼠按性別分別稱重并編號，根據(jù)仔鼠體重，利用隨機數(shù)表隨機留取雌雄仔鼠各3只，其余仔鼠處死。各組留取的仔鼠于生后21天后斷乳，處死母鼠，稱取每只母鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)重量。仔鼠飼喂市售生長期飼料直至5周齡。于生后3天、10天、21天、5周每窩取雌雄仔鼠各1只稱重后脫頸處死，稱取臟器(心、肝、脾、肺、腎)重量并測量小腸、大腸長度。

3.統(tǒng)計學處理：臟器系數(shù)計算公式為臟器系數(shù)(mg/g)=臟器重量(mg)/仔鼠體重(g)。數(shù)據(jù)均應用 SPSS 20.0軟件進行分析，采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，方差齊時利用LSD法進行兩兩比較，方差不齊時采用Tamhane’s T2法進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、仔鼠基本情況

各組仔鼠活產(chǎn)只數(shù)、性別比和平均出生體重見表1。各組活產(chǎn)仔鼠總只數(shù)及仔鼠平均出生體重差異無統(tǒng)計學意義，每只孕鼠約產(chǎn)12～13只活胎。

表1 活產(chǎn)仔鼠基本情況

二、母鼠體重變化及臟器系數(shù)

如圖1-(a)所示，孕0天至孕9天各組體重無顯著差異。從孕12天開始，PM2.5模型組母鼠體重逐漸高于空白組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。從孕15天開始槲皮素中劑量組母鼠體重顯著低于PM2.5模型組并持續(xù)至孕18天(P<0.05)。從孕12天開始槲皮素高劑量組母鼠體重顯著低于PM2.5模型組并持續(xù)至孕18天(P<0.05)。至孕18天時，槲皮素中劑量組和高劑量組母鼠體重已經(jīng)達到空白對照組水平。

如圖1-(b)所示，PM2.5模型組哺乳期體重從產(chǎn)后0天至11天呈現(xiàn)出高于空白對照組的趨勢。從產(chǎn)后14天開始，PM2.5模型組母鼠體重顯著高于空白組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。產(chǎn)后21天槲皮素中劑量組母鼠體重顯著低于PM2.5模型組(P<0.05)，且達到了空白對照組水平(P>0.05)。槲皮素高劑量組母鼠體重從產(chǎn)后當天開始便顯著低于PM2.5模型組(P<0.05)，并一直持續(xù)到產(chǎn)后21天。21天時槲皮素高劑量組母鼠體重已經(jīng)達到空白對照組水平。

產(chǎn)后21天PM2.5模型組、槲皮素低劑量組母鼠的肝重量、肝系數(shù)高于空白組(P<0.05)，槲皮素高劑量組母鼠的肝重量低于PM2.5模型組(P<0.05)。槲皮素中劑量組母鼠的肝重量與空白對照組無顯著差異，且槲皮素中、高劑量組肝系數(shù)與空白對照組無顯著差異。PM2.5模型組、槲皮素低劑量組母鼠的脾重量、脾系數(shù)高于空白組(P<0.05)。PM2.5模型組母鼠的腎系數(shù)低于空白組(P<0.05)，槲皮素低、中、高劑量組母鼠的腎系數(shù)高于PM2.5模型組(P<0.05)。見表2。

圖1 孕期及哺乳期體重變化Figure 1 Changes of body weight during pregnancy and lactation

三、仔鼠體重、臟器重量和臟器系數(shù)

1.仔鼠體重變化：產(chǎn)后10天槲皮素高劑量組雄性仔鼠的體重顯著低于空白對照組；產(chǎn)后21天PM2.5模型組、槲皮素中、高劑量組雄性仔鼠的體重顯著低于空白對照組(P<0.05)。雌性仔鼠體重各組間差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.生后3天仔鼠主要臟器重量和臟器系數(shù)： PM2.5模型組生后3天雄性仔鼠的脾重量低于空白對照組，脾系數(shù)亦小于空白對照組；槲皮素低、中劑量組的脾系數(shù)高于PM2.5模型組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PM2.5模型組3天雄性仔鼠的腎重量輕于空白對照組，腎系數(shù)也小于空白對照組；槲皮素中劑量組的腎系數(shù)高于PM2.5模型組(P<0.05)。如表所示，槲皮素低劑量組3天雌性仔鼠的脾重量低于空白對照組，PM2.5模型組、槲皮素低劑量組的脾系數(shù)小于空白對照組(P<0.05)；槲皮素高劑量組脾系數(shù)大于PM2.5模型組(P<0.05)。見表4。

表2 母鼠產(chǎn)后21天心、肝、脾、肺和腎等臟器重量及臟器系數(shù)

Note: compared with control group ,*P<0.05; compared with PM2.5 model group,#P<0.05.

表3 仔鼠體重變化

Note: compared with control group ,*P<0.05; compared with PM 2.5 model group,#P<0.05.

表4 生后3天仔鼠心、肝、脾、肺和腎等臟器重量和臟器系數(shù)

Note: compared with control group ,*P<0.05; compared with PM2.5 model group,#P<0.05.

3.生后10天仔鼠主要臟器重量和臟器系數(shù)： PM2.5模型組、槲皮素中劑量組的雄性仔鼠的心臟重量、心臟系數(shù)均大于空白對照組，同時，槲皮素高劑量組的心臟系數(shù)大于空白對照組(P<0.05)。PM2.5模型組10天雄性仔鼠的脾重量、脾系數(shù)低于空白對照組，槲皮素低劑量組的脾重量、脾系數(shù)大于PM2.5模型組(P<0.05)。槲皮素低劑量組雄性仔鼠肺系數(shù)大于空白對照組(P<0.05)。如表所示，槲皮素中劑量組雌性仔鼠的心臟系數(shù)大于空白對照組(P<0.05)。見表5。

表5 生后10天仔鼠心、肝、脾、肺和腎等臟器重量和臟器系數(shù)Table 5 The weight and indexes of heart, liver, spleen, lung and kidney among offspring mice of postnatal day of 10

Note: compared with control group ,*P<0.05; compared with PM2.5 model group,#P<0.05.

4.生后21天仔鼠主要臟器重量和臟器系數(shù)： PM2.5模型組、槲皮素高劑量組雄性仔鼠的心臟重量低于空白對照組，同時，槲皮素中劑量組的心臟重量、心臟系數(shù)均大于PM2.5模型組(P<0.05)。PM2.5模型組、槲皮素中、高劑量組21天雄性仔鼠的脾重量低于空白對照組，PM2.5模型組、槲皮素高劑量組脾系數(shù)低于空白對照組。PM2.5模型組雄性仔鼠的腎臟重量小于空白對照組(P<0.05)。如表所示，PM2.5模型組雌性仔鼠的心臟系數(shù)大于空白對照組(P<0.05)。PM2.5模型組、槲皮素中劑量組雌性仔鼠的肺系數(shù)大于空白對照組(P<0.05)。見表6。

表6 生后21天仔鼠心、肝、脾、肺和腎等臟器重量和臟器系數(shù)Table 6 The weight and indexes of heart, liver, spleen, lung and kidney among offspring mice of postnatal day of 21

Note: compared with control group ,*P<0.05; compared with PM2.5 model group,#P<0.05.

5.生后35天仔鼠主要臟器重量和臟器系數(shù)： PM2.5模型組、槲皮素低、中劑量組的雄性仔鼠的心臟重量、心臟系數(shù)均大于空白對照組(P<0.05)。槲皮素高劑量組心臟系數(shù)亦大于空白對照組(P<0.05)。如表所示，PM2.5模型組、槲皮素中劑量組雌性仔鼠的肝臟重量、肝臟系數(shù)均小于空白對照組(P<0.05)。PM2.5模型組雌性仔鼠的腎臟重量、腎臟系數(shù)均小于空白對照組(P<0.05)。見表7。

表7 生后35天仔鼠心、肝、脾、肺和腎等臟器重量和臟器系數(shù)Table 7 The weight and indexes of heart, liver, spleen, lung and kidney among offspring mice of postnatal day of 35

Note: compared with control group ,*P< 0.05; compared with PM2.5 model group,#P<0.05.

四、仔鼠腸道長度

1.小腸長度：對于雄性仔鼠，各組間生后3天腸道長度無顯著統(tǒng)計學差異，如圖2-(a)所示。PM2.5模型組、槲皮素低、中、高劑量組生后10天小腸長度顯著短于空白對照組(P<0.05)，如圖2-(b)所示。PM2.5模型組、槲皮素低、中、高劑量組生后21天小腸腸道顯著短于空白對照組(P<0.05),如圖2-c所示。PM2.5模型組、槲皮素低、中、高劑量組生后5周小腸腸道顯著短于空白對照組(P<0.05)，如圖2-d所示。

對于雌性仔鼠，組間生后3天腸道長度無顯著統(tǒng)計學差異，如圖2-(a)所示。PM2.5模型組、槲皮素低劑量組生后10天雌性仔鼠小腸長度顯著短于空白對照組；槲皮素中、高劑量組小腸長度大于PM2.5模型組(P<0.05),如圖2-(b)所示。各組間生后21天、5周腸道長度差異無統(tǒng)計學意義，如圖2-(c)、2-(d)所示。

2.大腸長度：PM2.5模型組、槲皮素高劑量組的10天雄性仔鼠的大腸長度短于空白對照組(P<0.05)，如表8所示。其余各時間點五組之間差異無統(tǒng)計學意義。

討 論

研究顯示，大氣PM2.5是威脅人類健康的因素之一，增加多種疾病的發(fā)生率并造成沉重的疾病負擔[10]。諸多流行病學研究表明，孕產(chǎn)婦暴露于PM2.5與胎兒和新生兒發(fā)育障礙有關[11-13]。PM2.5通過影響母體代謝、免疫功能對母體產(chǎn)生健康危害，進而影響胎兒和嬰幼兒發(fā)育，且PM2.5可以穿過胎盤屏障直接產(chǎn)生影響[14]。降低空氣污染所致的疾病負擔存在重大挑戰(zhàn)，盡快開展干預措施研究非常重要，本研究選擇食物中存在的天然多酚類成分槲皮素進行干預研究，探索安全有效的干預方法。

Xu等[15]研究結果顯示，小鼠暴露于PM2.5可誘發(fā)肥胖，可能與PM2.5暴露導致機體氧化狀態(tài)、炎癥因子、胰島素敏感性等發(fā)生改變有關，在本研究中，孕期及哺乳期PM2.5模型組母鼠體重要顯著高于空白組。哺乳期100 mg/kg、200 mg/kg的槲皮素干預組母鼠體重顯著低于PM2.5模型組，可能與槲皮素可以調節(jié)胰島素的生理活性[16]、抗氧化、抗炎等作用有關。張凱等[17]和Liu等[18]對蘭州地區(qū)PM2.5毒性的研究顯示，小鼠孕期暴露于PM2.5可影響仔鼠體重，但在本研究中，除21天PM2.5模型組雄性仔鼠體重顯著低于空白組外，其他4個時間點雌雄仔鼠5個組間的體重差異均無統(tǒng)計學意義，造成這種差異的原因可能包括：(1)兩個研究的PM2.5采樣城市不同，PM2.5顆粒樣品的化學組成以及其所攜帶的化學物質成分可能存在差異；(2)兩個研究的染毒劑量、染毒時間和染毒次數(shù)均不相同，直接造成對后代發(fā)育的影響也不盡相同，具體的原因仍需更多的研究證實。

圖2 仔鼠小腸長度Figure 2 The length of small intestine among offspring mice

GroupPND3MaleFemalePND10MaleFemalePND21MaleFemalePND35MaleFemaleNormalcontrol2 6±0 42 6±0 34 7±0 3#4 3±0 38 2±1 28 0±0 510 6±0 810 6±0 8PM2 5modelcontrol2 6±0 32 5±0 44 3±0 4?4 3±0 58 0±0 88 1±0 910 3±0 89 8±0 7Low?dosagequercetin2 6±0 42 6±0 44 4±0 54 2±0 57 9±0 77 7±1 010 6±0 910 1±1 3Middle?dosagequercetin2 6±0 42 5±0 34 4±0 44 5±0 37 7±0 77 8±0 910 6±0 79 7±0 9High?dosagequercetin2 9±0 72 6±0 44 3±0 4?4 4±0 57 8±0 98 0±0 710 6±0 79 8±0 8

Note: compared with control group ,*P<0.05; compared with PM2.5 model group,#P<0.05.

本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5孕期和哺乳期暴露主要影響母鼠肝、脾及腎的重量和臟器系數(shù)，而對于心、肺的重量和系數(shù)影響較小。PM2.5模型組、50 mg/kg槲皮素干預組母鼠肝臟重量及肝系數(shù)均高于空白組，推測PM2.5暴露可能導致了母鼠肝臟的慢性炎癥[19]。100 mg/kg、200 mg/kg槲皮素干預組母鼠肝臟重量、肝臟系數(shù)與空白組無顯著差異，且200 mg/kg槲皮素干預組母鼠肝臟重量低于PM2.5模型組。PM2.5模型組的脾重量、脾系數(shù)顯著高于空白組，說明在本實驗條件下，孕期暴露于PM2.5已對母體主要免疫器官造成影響。Aztatzi-Aguilar等[20]發(fā)現(xiàn)亞慢性暴露于PM2.5可導致大鼠腎損傷，在本研究中PM2.5模型組母鼠腎指數(shù)顯著低于空白組，槲皮素干預可逆轉PM2.5導致的母鼠腎臟毒性。

通過對四個時間點臟器重量和臟器系數(shù)的比較得出，PM2.5孕期和哺乳期暴露主要影響后代心臟、脾臟的重量和臟器系數(shù)，其次是腎臟，而對于仔鼠肝臟、肺的重量和系數(shù)影響較小。對于臟器重量和臟器系數(shù)的影響多表現(xiàn)為PM2.5模型組較空白組明顯降低，說明孕期和哺乳期暴露于PM2.5會影響后代臟器的組織發(fā)育，進一步可能會影響相應臟器功能。但是，心臟的發(fā)育結果比較特殊，PM2.5模型組仔鼠生后10天、5周齡時心臟重量和系數(shù)均表現(xiàn)為大于空白組，分析原因可能是模型組仔鼠宮內心臟發(fā)育不良，直接導致生后心臟功能不全，為了盡量適應進一步發(fā)育的需要，心臟過度做功發(fā)生代償性肥大，進而出現(xiàn)后期心臟重量增加的情況。PM2.5導致子代小鼠臟器重量顯著變化的原因很復雜，可能是由于PM2.5本身對母體造成一系列的炎癥反應和氧化應激狀態(tài)[21]，甚至影響到母嬰免疫平衡系統(tǒng)，這一系列的損傷導致子宮內的胚胎及其主要臟器發(fā)育不全，而這一現(xiàn)象一直持續(xù)到出生后。先天臟器發(fā)育不全又可能會進一步導致某些臟器(如心臟)后續(xù)的代償性增大。孕期和哺乳期50 mg/kg、100 mg/kg的槲皮素干預，可以在一定程度上逆轉PM2.5導致的子代臟器發(fā)育不良，但200 mg/kg的槲皮素干預效果并不理想，提示槲皮素的保護作用存在一定的適宜劑量范圍。

動物的小腸作為營養(yǎng)物質消化、吸收的重要場所和動物體內最大的內分泌器官、免疫屏障，其結構和功能的完整性對于保證動物健康，促進生長發(fā)育具有重要意義[22]。而大腸能夠吸收水、無機鹽和部分維生素，且大腸內的酸堿度和溫度對一般細菌的繁殖極為適宜，故細菌在此大量繁殖，而腸道菌群對于人體健康發(fā)揮著非常重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，孕期和哺乳期PM2.5暴露對子代小鼠腸道長度有顯著影響。PM2.5模型組仔鼠的小腸長度要顯著短于空白組，而對于大腸長度的影響要弱于小腸。通過分析各組雄性仔鼠小腸長度差異看出，PM2.5導致小腸長度變短的效應可延續(xù)至生后5周。100 mg/kg、200 mg/kg槲皮素補充對生后10天雌性小腸長度變化可起到一定程度干預效果。與PM2.5模型組相比，不同劑量槲皮素干預已表現(xiàn)出逆轉腸道長度的趨勢，但無統(tǒng)計學差異。

本研究結果提示，孕期及哺乳期經(jīng)呼吸道暴露于PM2.5，對雄性子代主要臟器結構發(fā)育的影響要大于雌性子代，表現(xiàn)在臟器重量、臟器系數(shù)、腸道長度的異常要多于雌性后代。在本研究劑量范圍內，槲皮素可以在一定程度上減輕孕期和哺乳期經(jīng)呼吸道PM2.5暴露對后代主要臟器發(fā)育的危害，但存在適宜的干預劑量范圍，并非劑量越高拮抗效果越好。

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