吳憶寧, 梅娟,2,3*, 沈耀良,2,3

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甲烷厭氧氧化機理及其應用研究進展

吳憶寧1, 梅娟1,2,3*, 沈耀良1,2,3

1．蘇州科技大學環(huán)境科學與工程學院, 蘇州 215009 2．城市生活污水資源化利用技術國家地方聯(lián)合工程實驗室, 蘇州 215009 3．江蘇省環(huán)境科學與工程重點實驗室, 蘇州 215009

甲烷是一種重要的溫室氣體, 研究證明甲烷厭氧氧化(AOM)對于降低全球甲烷的排放有著重要意義。參與AOM反應的最終電子受體可分為三類, 即SO2– 4、NO2–/NO3–以及以Fe3+、Cr5+等為代表的金屬離子。本文基于甲烷厭氧氧化過程所利用的電子受體的差別, 結合不同類型AOM反應微生物的基因型分析, 闡述了AOM過程的反應機理、相關的微生物種類及其代謝途徑。其中對AAA(AOM-associated archaea, 屬于ANME-2d)的分離培養(yǎng), 以及其利用硝酸鹽、Fe3+、Cr5+等離子氧化甲烷的研究對認識AOM反應機理和AOM的實際應用有很大推動作用。本文還介紹了AOM過程在環(huán)境污染控制領域實際應用中的最新研究進展, 對AOM的實際應用及其在節(jié)能減排上的價值進行展望。AOM過程的進一步研究對拓寬該過程的工程應用以及對正確認識全球碳、氮、硫循環(huán)均有著重要意義。

甲烷厭氧氧化; 電子受體; 甲烷厭氧氧化古菌; 環(huán)境污染控制

甲烷在地球生物演化過程以及人類的生活生產中扮演著重要的角色。它是一種重要的化石燃料, 是一種不可忽視的溫室氣體, 是自然界中一種豐富的碳氫化合物, 同時也可作為微生物生長的底物[1]。甲烷對溫室效應的貢獻僅次于二氧化碳, 達到了20%, 它對全球變暖的影響是二氧化碳的25倍。在過去的30年中, 大氣中甲烷的含量從1.6 ppm增至1.8 ppm (然而在1999年至2006年, 該值一直保持穩(wěn)定)?？刂拼髿庵屑淄闈舛葘刂迫蜃兣兄匾饬x[2,3]。

甲烷的厭氧氧化(Aerobic methane oxidation, AOM)是減少甲烷的重要途徑之一。AOM反應普遍存在, 海洋沉積物、冷泉區(qū)、泥火山和天然氣水合物儲層上方以及人類活動的水稻田、垃圾填埋場等存在甲烷氣體滲漏逃逸的區(qū)域都能檢測到AOM反應的發(fā)生[3]。根據最終電子受體的不同, 甲烷厭氧氧化可分為3類, 一類是以SO2- 4為最終電子受體, 被稱為硫酸鹽還原型甲烷厭氧氧化(Sulphate-reduction- dependent aerobic methane oxidation, SAMO); 一類以NO2–、 NO3–為最終電子受體, 被稱為反硝化型甲烷厭氧氧化(Denitrification-dependent anaerobic methane oxidation, DAMO); 第三類是Fe3+、Mn4+、Cr5+、MnO4—等離子為電子受體的甲烷厭氧氧化[4]。

深入了解和研究不同環(huán)境中的甲烷厭氧氧化過程和機理, 對進一步理解全球碳循環(huán)和控制甲烷氣體的排放都有重要意義。

1 以SO2– 4為最終電子受體的硫酸鹽還原型甲烷厭氧氧化(SAMO)

AOM反應最早是在海洋沉積物中發(fā)現(xiàn)。海洋中發(fā)生的AOM 過程主要由甲烷厭氧氧化古菌( Anaerobic methanotrophic archaea, ANME) 和硫酸鹽還原細菌( Sulfate-reducing bacteria, SRB) 共同完成, 其化學計量關系可表示為[5]:

CH4+ SO2– 4→ HCO3–+ HS–+ H2O

(ΔGθ’= –16 kJ·mol–1CH4) (1)

盡管SAMO反應釋放的能量極低(△Gθ’=–16 kJ·mol–1CH4), 但由于硫酸鹽-甲烷轉換帶(Sulfate- methane transition zone, SMTZ)中富含硫酸鹽和甲烷, 是SAMO 發(fā)生的良好環(huán)境, 所以在SMTZ 中SAMO非常普遍。SAMO 是最先發(fā)現(xiàn)的甲烷厭氧氧化途徑, 研究得也最深入。針對海洋環(huán)境尤其是深海沉積物中的AOM已有較多研究, 研究者們通過現(xiàn)代分子微生物學和地球化學交叉的研究手段, 揭示了SAMO過程的調控機理, 提出了的反應機制模型[5]。

1.1 SAMO參與微生物

參與SAMO 反應的甲烷厭氧氧化古菌(ANME)根據系統(tǒng)發(fā)育分析, 通?？煞譃槿? ANME-1、ANME-2、ANME-3, 均屬于廣古菌門[4]。SAMO系統(tǒng)中的SRB一般屬于脫硫八疊球菌屬(), 典型形狀為球狀、短桿狀、弧狀[5]。陳穎在研究與ANME-2形成細胞團的SRB時發(fā)現(xiàn)該類細菌是一類自養(yǎng)型微生物, 基因層面上顯示它是通過還原型乙酰輔酶來固定二氧化碳, 還原型乙酰輔酶A途徑是一個相對較簡單的途徑, 即兩個二氧化碳直接以非環(huán)化的方式合成乙酰輔酶A[6]。

之前人們普遍認為在SAMO 反應中, 甲烷厭氧氧化古菌(ANME)往往與硫酸鹽還原細菌(SRB)形成共生體, 古菌在中央, 硫酸鹽還原菌在周圍, 因此甲烷氧化的同時伴隨著硫酸鹽的還原[7]。隨著進一步的研究, 越來越多的證據表明與ANME 共生的細菌可能不僅限于SRB, 而且具有較高的多樣性[8]。例如, Orphan等發(fā)現(xiàn)僅僅由ANME-2 細胞就可形成單一類型微生物的共生體[8]; ANME-2a能與、以及共生[6]; ANME-3古菌能與ANME-2a /( DSS) 共生[8]。但這些共生現(xiàn)象目前為止只是通過實驗觀測到的, 具體共生體的代謝方式與機理仍需通過深入的基因組分析來解答。

1.2 SAMO反應機理

目前, 已有三種理論模型用于解釋SAMO的反應機理, 即: 反向產甲烷理論、乙酸化理論以及甲基化理論[4]。

Hallam在2004年發(fā)表的論文中提出了反向產甲烷模型, 依據是ANME古菌的基因組中除了缺少參與甲基和亞甲基氧化還原反應的Mer基因外, 包含了幾乎所有產甲烷過程所需的基因[9]。但也有研究者對反向產甲烷理論提出了質疑, 例如: 反向產甲烷的理想條件應該是低H2濃度但Moran利用13C標記的CH4研究不同H2分壓下AMO的反應速率, 發(fā)現(xiàn)增加H2分壓對AOM的影響作用微乎其微。這也就說明H2在AOM過程中并非起中間體作用[10]。而且大部分產甲烷八疊球菌目的古菌在產甲烷過程中只能利用乙酸和甲基化合物, 并不能利用H2, 這一現(xiàn)象與反向產甲烷理論矛盾[5]。

基于上述問題的思考, Valentine 和Reeburgh[11]提出了SAMO 發(fā)生的乙酸化理論模型。該模型包括兩種乙酸化模型。第一類: ANME 能夠將兩分子的甲烷氧化生成乙酸和H2(式(2)) , 產生的乙酸和H2被SRB 利用(式(3) 和式(4)) 。結合三個反應式, 可得到SAMO 的凈反應式(式(5)) 。

2CH4+ 2H2O→CH3COOH + 4H2(2)

4H2+ SO2- 4 + H+→HS–+ 4H2O (3)

CH3COOH + SO2- 4→2 HCO3–+ HS–+ H+(4)

2CH4+ SO2- 4→2 HCO3–+HS–+ 2H2O (5)

另一種代謝途徑則是ANME 利用CO2和甲烷生成乙酸(式(6) ) , 隨后再被SRB 利用(式(7))。

CH4+ HCO3–→CH3COO–+ H2O (6)

CH3COO–+ SO2– 4→HCO3–+ HS–(7)

盡管目前沒有充足的證據證明SAMO中確實存在乙酸化途徑, 但它卻解釋了反向產甲烷理論中存在的問題[5]。

Moran[10]提出的甲基化理論是ANME以及CO2還原古菌將通過甲烷氧化產生的甲基硫化物(式(8))傳輸到SRB中, 其中甲烷氧化為CO2還原提供電子受體(式(9))。CO可代替甲烷為CO2的氧化提供電子受體, 從而繼續(xù)甲基化反應。硫酸鹽在SRB作用下, 還原生成HCO3–和HS–,這兩種產物可用于甲烷氧化, 產生的H3CSH 又可作為SRB 的基質(式(10))。

CH4+1/3 HCO3–+ 5/3H++ 4/3HS–→4/3H3CSH +H2O (8)

4 /3 H3CSH + SO2- 4→4 /3 HCO3–+ 7 /3 HS–+5 /3 H+(9)

CO+1/3 HS–+1/3H2O+1/3 H+→1/3H3CSH +2/ 3CO2(10)

除了以上三種理論模型, 也有研究者認為, 不同的ANME類群可能采用的AOM機制是不同的。例如, 陳穎[6]發(fā)現(xiàn)ANME-2a的基因組中包含有一套經典的完整七步甲烷產生途徑所需的基因, 并且轉錄組分析顯示這些基因都是活躍表達的, 這其中包括了兩套先前報道在ANME-1中缺失的Mer基因以及兩套編碼四氫甲烷蝶呤S-甲基轉移酶, 這是第一次在甲烷代謝古菌(包含甲烷產生菌)中發(fā)現(xiàn)同時存在兩套Mtr與Mer基因。該研究認為ANME-2a的氧化甲烷可能采用逆向甲烷產生途徑的假說, 并且研究結果表明不同氧化古菌(ANME-1, ANME-2)采用了不同的甲烷氧化代謝途徑。

而最新的研究發(fā)現(xiàn)了一種新的代謝途徑, 研究證明零價硫可以作為ANME和SRB的中間物質, 即與ANME-2共生的SRB獲取能量的方式是零價硫的歧化反應。因為研究者發(fā)現(xiàn), ANME-2能夠同化溶解的無機碳、催化甲烷厭氧氧化并且將硫酸鹽還原成零價硫甚至硫化物, 而屬于/(DSS)類群的SRB則通過歧化反應利用二氧化硫生成硫酸鹽和負二價硫, 與此同時進行碳的固定。因此兩者在一定條件下可分別獨自生存而不需要依賴共生關系[6]。

1.3 SAMO過程的實際應用

很多污水中含有大量的硫酸鹽, 如垃圾滲濾液、食品和醫(yī)藥生產廢水、礦山廢水等?？梢岳煤蛩猁}的廢水處理含甲烷的廢氣, 是廢氣與廢水協(xié)同處理的一個有效途徑[12]。此外在廢水與污泥的厭氧處理中常含有大量H2S等惡臭物質, 可將H2S氧化生成硫酸鹽, 硫酸鹽作為氧化劑, 將CH4氧化為二氧化碳, 實現(xiàn)CH4與惡臭物質硫化氫的同步去除[13]。

李琳等[14]發(fā)明了用于實現(xiàn)甲烷廢氣與含硫含氮廢水協(xié)同有效地處理的膜生物處理設備。在該設備的環(huán)流式氧化容器中甲烷被氧化, 硫酸鹽被還原; 氣體膜組件的分離作用使未及時氧化的甲烷回流至環(huán)流式氧化容器繼續(xù)被氧化,硫酸鹽還原產物硫化氫進入升流式再生容器被硝酸鹽氧化為硫酸鹽,成為再生的氧化劑,同時硝酸鹽被還原為氮氣,實現(xiàn)甲烷廢氣與含硫含氮廢水在兩個生化反應區(qū)協(xié)同有效地處理。Auguet等[15]在研究處理含有大量H2S和CH4的下水管道廢水時, 向其中加入NO2–, H2S幾乎全部被氧化,包括41%的溶解性SO2- 4以及附著在生物膜上的單質硫、硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽。與此同時, 有78%的甲烷被氧化, 并且在停止加入NO2–后甲烷氧化并沒有立即消失。這可能是甲烷與廢水中溶解性SO2- 4發(fā)生了SAMO。

除了去除污水中的硫酸鹽與硫化氫, SAMO反應還能去除污水中的硫代硫酸鹽, Cassarini等[16]在以聚氨酯塑料泡沫為載體的生物滴濾池反應器中, 利用甲烷為唯一電子受體, 去除硫代硫酸鹽。硫代硫酸鹽首先通過歧化作用分解成硫酸鹽與硫化物, 然后硫酸鹽與甲烷發(fā)生SAMO反應, 該反應中硫酸鹽的還原速率達到0.38 mmol·L–1·d–1。并且成功富集到了SRB相關微生物。

SAMO作用在垃圾填埋場內及其滲濾液羽狀體中均可發(fā)生, 可以形成自生碳酸鹽和硫化物等沉積物。因此, AOM作用是垃圾填埋場甲烷減排的重要途徑之一[17]。J Dong等[18]收集研究了位于中國東北的金錢堡垃圾填埋場的不同填埋年齡的多個垃圾樣品, 并通過高通量測序法在樣品中監(jiān)測到了甲烷微菌科以及甲烷八疊球菌以及硫酸鹽還原菌等ANME相關菌。該研究結果也證明了SAMO在垃圾填埋場的甲烷厭氧氧化的重要地位。

2 以NO2– /NO3–為最終電子受體的反硝化型甲烷厭氧氧化(DAMO)

根據熱力學定律, NO2–/NO3–比SO2– 4更適于充當甲烷氧化的電子受體。反硝化型甲烷厭氧氧化(Denitrifying anaerobic methane oxidation, DAMO)的化學方程式可以表述為[5]:

5CH4+8NO3–+8H+→5CO2+4N2+14H2O (11)

(ΔGθ’= –765kJ·mol–1CH4)

3CH4+8NO2–+8H+→3CO2+4N2+10H2O (12)

(ΔGθ’= –928kJ·mol–1CH4)

2.1 DAMO參與微生物

參與DAMO 過程中的兩種主要功能微生物包括()細菌與()古菌。2006 年, Raghoebarsing等在實驗室條件下獲得了能夠利用亞硝酸鹽為電子受體的甲烷氧化微生物富集培養(yǎng)物, 證實了甲烷氧化可耦合亞硝酸鹽的還原。該生物過程被稱之為亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化( Nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, N-DAMO)。16SrRNA的系統(tǒng)發(fā)育表明該細菌屬于非培養(yǎng)的、只能通過環(huán)境基因序列定義的新亞門—NC10門細菌。Ettwig等將此類新發(fā)現(xiàn)的微生物命名為()[5]。

通過對“”菌全基因序列的組裝分析發(fā)現(xiàn), 該菌含有pmoCBA基因編碼的甲烷單加氧酶, 甲烷單加氧酶可催化完成該菌在厭氧環(huán)境中代謝。近年來, 隨著pmoA基因的特異性引物的開發(fā),菌被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于湖泊底泥、河流沉積物、泥炭、水稻田、濕地、土壤等各種自然生態(tài)環(huán)境中[19,20,21]。Yang等[19]研究了中國華南地區(qū)的惠州市的五片濕地中NC10門細菌種群結構時, 發(fā)現(xiàn)濕地植被類型以及濕地深度是影響NC10門細菌種群結構的重要因素。同樣的, Shen[20]在研究土壤環(huán)境中的NC10門細菌時也發(fā)現(xiàn)土壤深度是影響NC10門細菌分布以及多樣性的重要因素。Shen等[21]還研究了水庫沉積物、池塘沉積物、濕地沉積物以及水稻田土壤中NC10門細菌的菌落結構, 發(fā)現(xiàn)在這四個棲息地中, NC10門細菌的菌落結構有著巨大差異。其中銨含量與有機碳含量是影響該菌菌落結構的最重要的環(huán)境因素。

隨著研究的進一步深入, 研究者還在中國南海等海水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了菌的存在, 并且在實驗室20 g NaCL/L的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)90 d后檢測到了該細菌的存在, 盡管其活性很低[22]。所以菌可以在有一定含鹽量的環(huán)境下生長, 而非之前認為的只能生長在淡水環(huán)境中。Padilla等[23]在墨西哥北部和哥斯達黎加以外含氧量最小的海域(OMZ)中, 檢測到了NC10門的細菌, 并且在亞硝酸鹽和甲烷濃度升高的缺氧區(qū)豐度最高。這也說明了NC10門的細菌對于OMZ地區(qū)的氮、氧、甲烷的循環(huán)起著一定作用。

古菌()也是參與DAMO過程的一類微生物。在2013 年, Mohamed 等富集培養(yǎng)到一個可催化DAMO 反應的ANME-2d的單個種群, 將該古菌群命名為(), 歸屬于Methanoperedens科, 它是一種直徑為1—3 μm 的不規(guī)則球菌, 通常以類似八疊球菌的族群方式存在, 即在中溫(22—35℃)、pH 7.0—8.0 條件下生長[24]。

2.2 DAMO反應機理

DAMO反應機理可分為細菌通過內部好氧機制耦合亞硝酸鹽還原與甲烷的厭氧氧化, 以及古菌通過逆向產甲烷途徑耦合硝酸鹽還原與甲烷的厭氧氧化[5,14]。

Ettwig等利用宏基因組方法對進行研究時發(fā)現(xiàn)細菌具有一套完整的甲烷好氧氧化途徑酶系的編碼基因, 即含有編碼Nar(催化NO3–還原成NO2–的酶)、Nir(催化NO2–還原成NO的酶)、Nor(催化NO還原成N2O的酶)的基因。然而缺少N2O還原酶的編碼基因。所以Ettwig等認為細菌是通過一種全新的機制進行脫氮, 即NO 被未知的NO 歧化酶(nitricoxide dismutase, nod)分解為N2和O2[25]。其中一部分的O2(3/4) 用于甲烷氧化, 剩余的氧氣用于其他活動, 即被膜結合型bo類終末氧化酶利用。這也是地球上第四種生物產氧途徑[6]。Ananda等[26]發(fā)現(xiàn)現(xiàn)早在大氧化時代(GOE)之前, nod便可為對血紅素銅氧化酶具有低親和力的微生物提供局部生物可利用的氧作為其底物。說明nod是一種古老的酶。nod基因被認為是生物所特有, 該基因可以作為研究不同生態(tài)系統(tǒng)中的生物標記物。Ananda等利用以及含有nod- like基因的微生物的宏基因組文庫, 成功設計出了nod基因的靶向引物。為利用nod作為標記物追蹤DAMO現(xiàn)象提供了可能。

當然, 在脫氮過程中起作用的并非只有甲烷氧化菌一種生物, 還存在著其他異養(yǎng)反硝化菌與之共同作用。在氧化途徑中, 甲醇脫氫酶(MDH)是一種重要的酶, 它可將甲醇氧化成甲醛。而吡咯喹啉醌(PQQ)是MDH必不可少的輔助因子。PQQ生物合成需要兩個基因組的表達, 即pqqABCDE和pqqEF。然而體內只存在pqqE與pqqF兩種基因而缺乏合成PQQ的其他基因。而其他異養(yǎng)反硝化菌的作用就是為提供PQQ或類似生長因子。因此N-DAMO反應是建立在甲烷氧化菌以及異養(yǎng)反硝化菌的共同作用之上, 兩類菌對此反應過程都有著重要影響[27]。

2013 年, Mohamed 等研究了古菌在DAMO 過程中所發(fā)揮的重要作用, 利用宏基因組學、宏轉錄組學和單細胞基因組學等分子技術結合C-12、N- 15的同位素標記實驗, 發(fā)現(xiàn)在的基因庫中, 包含產甲烷途徑所需的全部基因, 包括甲基輔酶M 還原酶編碼基因( McrABCDG) 以及輔酶F420型甲基輔酶M轉移酶編碼基因( Mer)。甲烷氧化為二氧化碳所需要的全部基因也都高度表達。此外,含有NO3–還原酶編碼基因, 但是并未在細胞內檢測到參與反硝化后續(xù)步驟的相關編碼基因。因此只能完成將NO3–還原成NO2–的部分反硝化[28]。不過最近Ettwing等對富集到的AAA (AOM-asso-cia-ted archaea, 屬于ANME-2d, 基因組分析與有95%相似性)的進行基因組分析時, 發(fā)現(xiàn)其基因組中含有將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽以及將亞硝酸鹽還原成NH4+的基因, 這結果說明AAA很有可能發(fā)生將硝酸鹽還原成NH4+耦合甲烷厭氧氧化的反應。擁有這種特質的古菌非常少見。同時, AAA還能與以及Anammox菌共同生存, 并為它們提供NO2–, 實現(xiàn)污水中氮的去除[1]。

甲烷產生途徑中最后一步催化產生甲烷的酶甲基輔酶M還原酶(Mcr)是一個包含鎳離子的酶, 在逆向甲烷產生途徑中Mcr的同系物被認為催化甲烷氧化的第一步反應[6]。McrA基因是比16S rRNA基因更具特異性的產甲烷菌與ANMEs的生物標記物。研究者開發(fā)了兩個新型McrA引物對可以特異性識別。第一個引物對186-bp的片段可以對進行量化。另一個引物對1191- bp的擴增子可以對的系統(tǒng)發(fā)育進行更精細的分析。這兩種引物的發(fā)現(xiàn)將有助于我們研究自然生態(tài)系統(tǒng)中的分布與豐度[29]。

2.3 DAMO過程的實際應用

DAMO的發(fā)現(xiàn)為處理含氮廢水提供了新方法?？梢岳梦鬯畯S厭氧過程產生的甲烷作為反硝化過程中的電子供體, 既節(jié)約成本, 又可減少溫室氣體的排放[5]。

由于DAMO脫氮工藝僅能處理NO2–、NO3–, 考慮到實際污水中還存在NH4+, Shi等[30]提出了利用DAMO功能菌與Anammox功能菌共同作用進行脫氮,古菌利用CH4作為電子供體, 將NO3–還原成NO2–, 而細菌則和Anammox細菌共同作用, 利用CH4和NH4+作為電子供體, 將NO2–還原。Shi[31]等在實驗室建立了微孔膜曝氣膜反應器(MBfR), 該反應器的生物膜由DAMO功能菌以及Anammox細菌共同組成, 通過逐漸增加反應器中NO3–與NH4+的負荷, 在反應的453 d后達到了684±10 mg N/(L·d)的硝酸鹽去除率, 該去除率在迄今為止報道的關于DAMO反應器中硝酸鹽的去除率中是最高的。

N-DAMO功能細菌(以亞硝酸鹽為電子受體進行甲烷厭氧氧化的細菌)生長緩慢倍增時間長達數周甚至數月, 且代謝活性較低。針對這個問題, 國內外多個課題組研究了反應器構型, 微量元素, 電輔助手段等對N-DAMO過程的影響[32]。

傳統(tǒng)實驗室研究中, 甲烷的低傳質效率, 一定程度上限制了對DAMO的研究。中空纖維膜可以增加甲烷的傳質性能。錢祝勝等[35]利用中空纖維膜反應器(HfMBR)的菌群富集快速啟動了DAMO過程(<3個月), 且在一定程度上提高了反硝化速率。Fu等[34]也在研究HfMBR中DAMO與Anammox的共同作用時得到了NO3–-N 85.33 mg·L·d–1的去除率和NH4+-N 37.95 mg·L·d–1的去除率。HfMBR能顯著提高DAMO和Anammox的除氮率。He[35]等對痕量金屬濃度的變化對N-DAMO功能細菌的生長進行研究, 結果表明Fe2+與Cu2+(濃度分別為20 μmol·L與10 μmol·L)可以促進N-DAMO功能細菌的增長并促進其活性。該研究還發(fā)現(xiàn)了迄今為止第一個N- DAMO功能菌的大型聚集體(10—50 μm)。關于電場刺激對細胞生長、代謝的影響已有不少研究。范秋香等[36]研究了電場對DAMO功能微生物的作用。實驗證明施加電場對該DAMO功能微生物的活性具有促進作用。并且不同的電壓強度對DAMO的促進程度也不同。在施加電壓為1V時, DAMO功能微生物活性最強。

有研究者對污水廠利用DAMO技術的經濟效應進行了分析。假設污水廠的人口當量數為500000 (處理水量100000 m3·d-1), 如果污水廠不采用污泥厭氧消化技術(不采用該技術的污水廠占中國污水廠數的80%以上), 那么該污水廠每天的運行費用在60000—80000, 其中有40000用于處理剩余污泥。但污水廠若采用活性污泥法與DAMO相結合的技術, 那么該污水廠可以節(jié)省20000外加有機碳源的費用, 同時可產生5000 kWh電能, 并且回收近3 t的鳥糞石[37]。

DAMO除了在污水處理中有著廣泛應用, 對于降解垃圾填埋場污染物也起著重要作用。柳蓉[38]等通過靜態(tài)培養(yǎng)試驗, 分析了電子受體SO2-4共存條件下, NO3–和CH4共存對覆土中苯系物厭氧降解的影響。結果表明不外加NO3–時, 苯系物抑制CH4的降解, 單獨添加NO3–或CH4都能促進填埋覆土中苯系物的去除; 而同時添加NO3–和CH4能更好地促進苯系物的去除, 甲苯、二甲苯和異丙苯的去除率最高可達65%、88% 和82%。所以NO3–還原耦合甲烷厭氧氧化過程能同步促進具有“三致性”的苯系物的厭氧氧化。

總之, DAMO工藝不僅具有顯著的經濟環(huán)境效益, 在污水脫氮等領域存在的潛力也不容小覷, 值得進行更深入的研究。

以Fe3+、Mn4+、Cr5+、MnO4-等金屬離子為電子受體的甲烷厭氧氧化(metal-AOM)

Fe3+、Mn4+、Cr5+、MnO4—等電子離子是除了SO2- 4與NO2–/NO3–外第三類參與AOM過程的電子受體。該過程被稱為金屬離子耦合甲烷厭氧氧化(metal-AOM)[2]。在地球處于還原性大氣的時期, 甲烷營養(yǎng)型生物只能進行無氧呼吸, Mn4+、Fe3+便成為它們進行無氧呼吸獲取能量的重要的電子受體。根據Mn4+, Fe3+的柱狀綜合光氧化速率(分別為5mg ·(cm2· a)-1和200 mg·(cm2·a)-1) , 早期地球上依賴Mn和Fe 發(fā)生的AOM 氧化的甲烷的數量級可以達到10000 Tg ·a-1。說明依賴Mn和Fe 的AOM 作用有足夠的氧化能力消耗地球早期的甲烷通量[8]。其反應方程式為[39]:

CH4+8Fe(OH)3+15H+→HCO3–+ 8Fe2++21 H2O

(ΔGθ’= –572.15kJ·mol-1CH4) (13)

CH4+4MnO2+7H+→HCO3–+ 4Mn2++5 H2O

(ΔGθ’= –789.91kJ·mol-1CH4) (14)

3.1 參與metal-AOM的微生物

2009年, Beal等發(fā)現(xiàn)在加利福尼亞Eel River流域的海洋沉積物中的微生物可以分別實現(xiàn)甲烷厭氧氧化耦合Fe3+、Mn4+的還原, 為AOM開拓了新的領域[40]。隨后, 不斷有研究者利用地球化學分析法與同位素示蹤法, 在富鐵的丹麥日德蘭半島?rn湖和西伯利亞Baikal湖的沉積物、印度尼西亞的Matano湖、伯米吉州附近原油污染污染水域以及臺灣東部陸地泥火山中, 發(fā)現(xiàn)了甲烷厭氧氧化耦合金屬離子還原現(xiàn)象[39,43,47,49,50]。最近, Peng等[41]在沖繩海槽北部的海底碳酸鹽沉淀中檢測到了大量的自生黃鐵礦, 以及痕量Fe, 這也是第一個Fe3+還原耦合甲烷厭氧氧化的化石實例。除了在海洋沉積物中, Egger等[42]在沿海地區(qū)的表層沉積物中也發(fā)現(xiàn)了Fe3+還原耦合甲烷厭氧氧化, 并且由于該反應產物Fe3+可以原位利用磷元素形成磷酸亞鐵礦物, 對于沿海地區(qū)的富營養(yǎng)化有著削弱作用。

盡管許多研究者觀測到了自然界存在的甲烷厭氧氧化耦合金屬離子還原的現(xiàn)象, 但真正通過實驗室培養(yǎng)微生物從而實現(xiàn)甲烷厭氧氧化耦合金屬離子還原反應的報道并不多。在為數不多的實驗報道中, 我們發(fā)現(xiàn), 屬于甲烷厭氧氧化古菌的ANME-2及其亞類ANME-2a、ANME-2c、ANME-2d(也稱為AAA, 前文已有介紹)均可參與該反應[1,44]。各亞類之間進化距離相距較遠, ANME-2d與其他成員的同源性較遠[4], 并且被一度認為不具備氧化甲烷的能力。Chang 等[43]在臺灣東部泥火山的孔隙水中研究metal-AOM反應時, 發(fā)現(xiàn)包括ANME-1、ANME-2、ANME-3在內的幾乎所有ANME的亞類都可參與金屬離子耦合AOM反應。

Lu等[45]利用CH4作為唯一電子供體來研究Cr5+的還原。在間歇式反應系統(tǒng)中觀察到了Cr5+耦合甲烷厭氧氧化的反應。通過16SrRNA基因測序觀察Cr5+還原后微生物群落的變化。ANME-2的古菌數量大大增加, 并且成為與AOM反應相關的唯一優(yōu)勢種群。所以研究者猜測該反應的完成有兩種可能, 即由ANME-2單獨完成或是ANME-2耦聯(lián)其他未知的Cr5+還原菌完成。因為其他有著顯著數量增加的微生物(如紅球菌和甲烷八疊球菌), 從未有過它們擁有還原Cr5+能力的報道。

Scheller等[44]發(fā)現(xiàn)在對含有ANME-2古菌(包括ANME-2a與ANME-2C)的培養(yǎng)基中分別加入AQDS(一種人造電子受體)、腐殖酸、以及鐵的配合物(檸檬酸鐵和乙二胺四乙酸鐵)時均可發(fā)生甲烷厭氧氧化現(xiàn)象。主要原因是ANME-2古菌細胞膜表面含有大量血紅素c蛋白質, 該蛋白質可以使AQDS以及Fe3+等體外電子受體接受來自古菌體內通過反向產甲烷途徑產生的電子, 也就是說, AQDS以及Fe3+等體外電子受體充當了SAMO反應中SRB的角色。

Ettwing等[1]在厭氧并且持續(xù)通入甲烷的環(huán)境中, 從發(fā)生硝酸鹽耦合甲烷厭氧氧化的培養(yǎng)基中成功富集到了AAA, 并向利用其作為唯一金屬氧化菌的淡水富集培養(yǎng)基中通入13C標記的甲烷, 并且證明溶解態(tài)的Fe3+(檸檬酸鐵)以及納米顆粒態(tài)的Fe3+、Mn4+均支持甲烷厭氧氧化反應。并且對AAA基因型進行分析, AAA含有反向產甲烷所需的全部基因。并且含有大量編碼血紅素c蛋白質的基因。

3.2 金屬離子耦合甲烷厭氧氧化的反應機理

對于metal-AOM的反應機理目前還不是很明確, 目前根據研究所得可能的機制有三種, 第一種認為通過一種或幾種微生物使得金屬離子直接耦合甲烷厭氧氧化, 即類似于硫酸鹽還原耦合甲烷厭氧氧化機制[46]。

第二種是在硫化物存在條件下, 形成零價硫, 反應方程如下(以FeS為例)[47]。零價硫通過零價硫的歧化反應生成硫酸鹽和負二價硫, 與此同時進行碳的固定。產生的硫酸鹽可以與甲烷發(fā)生SAMO,從而氧化甲烷[48]。

Fe(OH)3+FeS+6H+→3Fe2++ S0+6 H2O (15)

第三種(以Fe3+耦合甲烷厭氧氧化為例)是反應體系中的H2被三價Fe還原菌利用至低濃度后, 通過反向產甲烷作用, 氧化甲烷[48]。

3.3 金屬離子耦合甲烷厭氧氧化的研究意義

金屬離子耦合甲烷厭氧氧化對于減少全球甲烷的排放量有重要意義。例如, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中, metal-AOM反應經常發(fā)生在硫酸鹽—甲烷轉換帶(SMTZ)以下的位置, 由于人為引起的海洋富營養(yǎng)化以及SMTZ帶上移等因素導致金屬氧化物經常被埋在還原區(qū)域以下, 在該區(qū)域中, NO2–、NO3–以及SO2– 4的含量十分有限, 金屬很有可能成為在該海洋深度中唯一可以氧化甲烷的電子受體[2]。除此之外, 在對metal-AOM反應中最常見的三價鐵還原耦合甲烷厭氧氧化(Fe-AOM)的研究中發(fā)現(xiàn), 如果Fe-AOM氧化的甲烷量可以占到全球甲烷氧化量的10%, 那么排放到空氣中的甲烷的減少量會是現(xiàn)在的兩倍[46]。

Metal-AOM反應對全球碳元素、硫元素、磷元素以及金屬元素的循環(huán)有著重要影響。Fe2+、Mn2+以及CO2等Metal-AOM的反應產物可以與其他金屬以及硫、磷元素等通過地質作用形成礦物。例如Fe2+可以與磷元素、硫元素、碳酸鹽以及殘余Fe3+的一起, 生成藍鐵礦、黃鐵礦、菱鐵礦、磁鐵礦等礦物[2]。除此之外, Fe-AOM過程中還可以去除環(huán)境中的污染物, 例如在含水層中, 苯、乙苯等碳氫化合物經常與三價鐵一起沉淀, 通過Fe-AOM可以降解這些有毒有害物質[49]。

4 展望

對于目前已發(fā)現(xiàn)的甲烷厭氧氧化過程, SAMO、DAMO以及以Fe3 +、Mn4 +等高價離子為電子受體的甲烷厭氧氧化, 其反應機理和代謝途徑以及與實際工程相結合的應用仍處于初步研究階段, 仍有許多問題需要研究。

對甲烷厭氧氧化過程和機理的進一步研究, 有助于深入了解和認識自然界的物質循環(huán)過程。硫酸鹽型甲烷厭氧氧化的發(fā)現(xiàn)改變了我們對海洋環(huán)境碳、氮、硫循環(huán)的認識。而新近研究的Fe3+、Mn4+等金屬離子為電子受體的甲烷厭氧氧化過程, 增加了我們所知的自然界甲烷厭氧氧化類型。AAA被發(fā)現(xiàn)可以單獨完成甲烷厭氧氧化耦合金屬電子受體的還原, 但其將電子從細胞內傳遞至金屬受體內的機理仍需更深入的研究。AAA對于甲烷的減排起著至關重要的作用, 對AAA的研究將會對地球早期以及現(xiàn)在的鐵、錳、硫、磷甚至是碳元素的循環(huán)有重要影響。

由于人類活動的影響, 自然環(huán)境中的甲烷厭氧氧化過程也發(fā)生變化。由于沿海環(huán)境中的人為氮污染, 導致該環(huán)境含有大量的NO2–與NO3–, 所以沿海環(huán)境沉積物中往往會有DAMO發(fā)生, 甚至連深海沉積物中都有DAMO的發(fā)生。DAMO功能菌的在自然界中的分布, 種群的多樣性以及群落結構仍需進一步研究, 尤其是人為活動影響的生態(tài)系統(tǒng)中。

對甲烷厭氧氧化過程的發(fā)現(xiàn)和研究也為環(huán)境污染控制提供了新的技術。DAMO是處理含氮廢水的新方法, 是污水廠尋找節(jié)能減排, 可持續(xù)發(fā)展的新出路。DAMO耦合厭氧氨氧化(Anammox)處理含氮廢水已有實際運行工藝方面的初步研究, 但是DAMO功能菌生長緩慢限制了其實際應用。同時, DAMO及脫氮過程是建立在甲烷氧化菌以及異養(yǎng)反硝化菌的共同作用之上, 所以進一步研究這兩類菌的共同作用, 對提高反應速率會有很大幫助。

垃圾填埋場中普遍存在著缺氧區(qū), 甲烷的厭氧氧化對于垃圾填埋場的甲烷排放通量會有一定的影響, 而現(xiàn)在對垃圾在填埋場穩(wěn)定化過程中的甲烷厭氧氧化活動研究很少。因此深入研究填埋場內部厭氧氧化的微生物機制、參與該過程的微生物群落, 以及影響氧化速率的因素(如微生物生長量、底物、溫度、pH 以及濕度等), 將有助于全面理解填埋場內部的碳轉化過程, 為有效地調控垃圾填埋場的甲烷排放通量提供依據。

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Research progress on microbial mechanism and application of anaerobic oxidation of methane

WU Yining1, MEI Juan1,2,3*, SHEN Yaoliang1,2,3

1. School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China 2. Jiangsu Key Laboratory of Environmental Science and Engineering, Suzhou 215009, China 3. Jiangsu High Education Collaborative Innovation Center of Water Treatment Technology and Material, Suzhou 215009, China

Methane is a significant greenhouse gas, and anaerobic oxidation of methane (AOM) is important to mitigate the global methane emissions to atmosphere. There are three kinds of terminal electron acceptors involved in AOM processes: SO2– 4, NO2–/ NO3–and oxidized metals such as Fe3+, Cr5+. Based on microbial genotype analysis, the mechanisms, involved microorganisms and the intracellular metabolic pathway of three different kinds of AOM processes were summarized. Especially, the study of AAA(AOM-associated archaea, belonging to ANME-2d), which could couple the reduction of NO3–, Fe3+and Cr5+to the oxidation of methane is critical for understanding the mechanisms of AOM, and researches on its separation and cultivation is important for the practical application of AOM. The latest research progresses of engineering applications of AOM in the field of environmental pollution control were also introduced, and the significance of AOM process in energy-saving and emission reduction was discussed. Further researches on the mechanisms of AOM are helpful for better understanding of the biogeochemical cycle of carbon, nitrogen and sulfur, and can promote more practical application of AOM.

aerobic methane oxidation; electron acceptors; anaerobic methanotrophic archaea; environmental pollution control

10.14108/j.cnki.1008-8873.2018.04.029

A

1008-8873(2018)04-231-10

2017-8-2;

2017-11-30

國家自然科學基金(No.51508367); 江蘇省自然科學基金項目(No.BK20140282)

吳憶寧(1993—), 女, 碩士, 主要從事環(huán)境工程專業(yè). E-mail:953663455@qq.com.

梅娟. E-mail:susie_mei@163.com

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