喬宇琛，劉桂君*，王 平，周思靜，鄭 潔，尚宏忠

（北京市輻射中心，北京 100015）

蛹蟲草（Cordyceps militaris (L.) Link）是我國重要的食藥用菌之一，隸屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales）蟲草科（Cordycipitaceae）[1]，是蟲草屬（Cordyceps）的模式種[2]。蛹蟲草與冬蟲夏草有相似或相同的化學(xué)成分和藥理作用，并已在1986年被人工馴化成功[3]，故可作為冬蟲夏草的良好替代品[4]。蛹蟲草活性成分主要包括：1）核苷類，如蟲草素、腺苷、腺嘌呤和次黃嘌呤等[5-7]；2）蟲草多糖[8]；3）蟲草甾醇和糖醇類物質(zhì)，如蟲草酸（又名D-甘露醇）、麥角甾醇和膽固醇等[6]；4）酶類，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）[9]、纖維蛋白溶解酶[10]和溶栓酶等[8,11]。同時，蛹蟲草具有抗炎[12]、抗氧化[13]、抗腫瘤[14-15]、免疫調(diào)節(jié)[16]、抗菌、抗細胞纖維化、改善低血糖癥、降血脂、抗艾滋病、保護神經(jīng)、保護肝臟、腎臟和肺等多種作用[17-18]。蛹蟲草早期的使用與研究多集中在亞洲，并且主要集中在優(yōu)化培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件、提高其活性產(chǎn)物產(chǎn)量上[19-23]。近年來，蛹蟲草在西方國家也開始受到關(guān)注，并作為非處方藥使用。2005年4月，蛹蟲草被正式收錄于《中華人民共和國藥典》，2009年3月被正式批準為新資源食品[24]，2014年10月改稱為新食品原料[25]。蛹蟲草是目前公認的食藥用蟲草之一，在我國已經(jīng)形成了一個巨大的產(chǎn)業(yè)，估計年產(chǎn)值可達100億 元人民幣[26-27]。

鑒于蛹蟲草重要的食藥用價值和巨大的應(yīng)用前景，其已成為近年來人們研究的熱點。隨著基因組技術(shù)的普及和后基因組時代的到來，關(guān)于蛹蟲草分子生物學(xué)方面的研究和技術(shù)越來越多，本文主要從蛹蟲草遺傳多樣性、分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方面介紹蛹蟲草相關(guān)研究現(xiàn)狀，以期為蛹蟲草在分子生物學(xué)研究、人工栽培中存在的菌種退化問題以及蟲草素代謝途徑等的研究提供有力依據(jù)。

1 蛹蟲草的遺傳多樣性

蛹蟲草多生長在溫帶、低海拔的林地，地理分布廣泛[28]，北美、南美、歐洲和亞洲都有分布[29]，在我國分布于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、西藏、陜西、河北、山東、安徽、浙江、福建、廣東、廣西、湖北、四川、貴州、云南和臺灣[30-31]。蛹蟲草寄主范圍廣泛，包括鱗翅目12 個科、鞘翅目3 個科、膜翅目1 個科和雙翅目1 個科昆蟲的蛹、幼蟲或成蟲[28,32]。

研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地蛹蟲草菌株間的遺傳分化程度較低，這與不同產(chǎn)地冬蟲夏草種內(nèi)具有較高的遺傳分化程度不同[33]。Sung等[34]利用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）對韓國11 個地點的72 株蛹蟲草菌株進行遺傳關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其平均遺傳距離均小于0.221，11 個種群間沒有遺傳關(guān)系。Wang Lei等[35]基于nrDNA ITS序列分析比較了英國、中國、日本、韓國和挪威地區(qū)蛹蟲草菌株的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其遺傳分化程度很小（Kimura雙參數(shù)遺傳距離不超過0.010）。但也有相反的研究結(jié)論，Yuan Feng等[36]利用表達序列標簽-簡單序列重復(fù)標記（expressed sequence tagssimple sequence repeats，EST-SSR）技術(shù)分析不同地理來源的蛹蟲草的種群遺傳分化程度時發(fā)現(xiàn)基因分化系數(shù)為0.450，非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的樹狀圖分析以及相關(guān)性驗證均表明其遺傳多樣性高與地理距離和地理來源無關(guān)，推測種群間高多樣化水平可能是由中國的森林砍伐和森林碎片化造成的。李挺等[37]利用目標起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT）分子標記技術(shù)對中國不同地區(qū)來源的27 株蛹蟲草菌株進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌株間的遺傳多樣性較高（遺傳相似性系數(shù)在0.383～0.933之間），通過UPGMA法和主坐標分析法分析發(fā)現(xiàn)，菌株多樣性與其來源有一定的相關(guān)性。這提示除了常用的ITS rRNA、RAPD和EST-SSR等分子標記，SCoT分子標記也可用于蛹蟲草遺傳多樣性的研究。因此，蛹蟲草種內(nèi)遺傳多樣性特征仍不清晰，需要進一步擴大菌株樣品量和篩選合適的、有代表性的分子標記。

已有多項研究證明正常菌株和退化菌株之間存在明顯的遺傳差異[38-39]。菌種退化是蛹蟲草人工栽培中一個常見且難解決的問題，主要表現(xiàn)為菌種使用一段時間后子實體形成能力下降、原基減少、產(chǎn)孢能力大幅度上升或下降、培養(yǎng)周期變長、子實體生長受阻[40-41]、不長子實體或只有極少量子實體產(chǎn)生[42]。李美娜等[38]利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和RAPD方法對野生馴化蛹蟲草及其退化菌株進行了基因水平的分析，表明兩者在DNA水平上已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的遺傳差異。李美娜[43]還分析了野生菌株與退化菌株的酯酶、蘋果酸酶和細胞色素酶等8 種同工酶，發(fā)現(xiàn)退化菌株的4 種同工酶不表達或表達量很低。李閩鋒等[39]利用RAPD分子標記的方法對正常菌株與退化菌株進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有兩對引物對6 個菌株的擴增譜帶有明顯的特異性，表明正常菌株與退化菌株間存在遺傳差異。以上研究一定程度上證明了蛹蟲草發(fā)生了較為頻繁的遺傳重組，驗證了準性生殖理論。

菌物菌株的退化現(xiàn)象已被證實與細胞中的活性氧積累有關(guān)[44]。Xiong Chenghui等[45]利用基因工程的手段，克隆了模式菌物構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的抗氧化酶——谷胱甘肽過氧化物酶編碼基因gpxA，通過基因敲入方法使其在兩株不同的蛹蟲草（正常產(chǎn)生子實體的Cm01菌株和在不同培養(yǎng)基上喪失了子實體生長能力的Cm04菌株）中持續(xù)表達[44]。過表達gpxA基因后，蛹蟲草菌株內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶總酶活力提高，清除細胞內(nèi)活性氧的能力提高，退化菌株Cm04恢復(fù)子實體結(jié)實能力，且其中1 株轉(zhuǎn)化株在繼代培養(yǎng)10 代之后仍可產(chǎn)生子實體，原本就正常產(chǎn)生子實體的Cm01菌株仍然保持良好的子實體生長能力[44]。該研究進一步證明了菌種退化與菌絲氧化脅迫有關(guān)聯(lián)性，但其中的因果關(guān)系仍有待進一步的研究[4]。

2 分子遺傳學(xué)

分子遺傳學(xué)是研究遺傳信息大分子的結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)，著重研究遺傳信息大分子在生命系統(tǒng)中的儲存、復(fù)制、表達及調(diào)控過程[46]。

2.1 遺傳轉(zhuǎn)化體系

菌物分子遺傳學(xué)研究需要一個高效的轉(zhuǎn)化體系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法是目前實現(xiàn)菌物遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛的方法之一，該方法具有操作簡單、受體范圍廣、轉(zhuǎn)化效率高、單拷貝率高以及突變體遺傳穩(wěn)定等特點[47-48]。Zheng Zhuangli等[49]于2011年成功建立和優(yōu)化了蛹蟲草農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation，ATMT）體系，其中農(nóng)桿菌AGL-1中攜帶載體pATMT1，轉(zhuǎn)化效率為每1×105個分生孢子產(chǎn)生30～600 個轉(zhuǎn)化子，同時發(fā)現(xiàn)在其預(yù)培養(yǎng)或共培養(yǎng)過程中都無需額外補充乙酰丁香酮。這一體系的建立為從分子水平上更好地研究蛹蟲草提供了技術(shù)支持?；诖耍琂iang Keqing等[50]利用蛹蟲草的ATMT體系方法篩選了一個具有快速子實體分化功能且高產(chǎn)的插入突變菌株g38，并在其中發(fā)現(xiàn)一個單拷貝基因Rhf1參與蛹蟲草子實體的產(chǎn)生。該基因編碼菌絲形成蛋白，利用T-DNA插入到野生菌株JM4中破壞了基因Rhf1功能，而突變菌株g38中沒有檢測到Rhf1。為了進一步證明Rhf1的功能，Jiang Keqing等[50]利用ATMT技術(shù)將構(gòu)建好的Rhf1-RNAi質(zhì)粒和過表達載體轉(zhuǎn)入野生型JM4菌株中。在Rhf1-RNAi突變體庫中找到了快速子座分化和能產(chǎn)生更大子實體的菌株。而過表達的突變體JM-OERhf1既產(chǎn)生子座，又產(chǎn)生子實體。回復(fù)突變株38-OERhf1的生長特性與野生型菌株JM4相似。這些結(jié)果表明基因Rhf1參與蛹蟲草子實體產(chǎn)生。Zheng Zhuangli等[51]同樣利用ATMT技術(shù)建了一個蛹蟲草突變體庫，并利用退化的特征篩選突變體，最終根據(jù)體內(nèi)、體外子實體的產(chǎn)生和蟲草素的形成情況篩選了含單拷貝T-DNA的6 個突變體。結(jié)合熱不對稱交錯聚合酶鏈式反應(yīng)（thermal asymmetric interlaced-polymerase chain reaction，TAIL-PCR）技術(shù)鑒定突變體T-DNA側(cè)翼序列，結(jié)合生物信息學(xué)方法鑒定出了6 個參與子實體產(chǎn)生與蟲草素形成的基因，其中ATP依賴的解旋酶、細胞色素氧化酶亞基I和泛素樣激活酶參與體外人工子實體的形成，絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶參與寄主體內(nèi)子實體的形成，葡萄糖甲醇膽堿氧化還原酶和端粒逆轉(zhuǎn)錄酶參與蟲草素的合成。

除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，茅文俊等[52]還建立了一種適合蛹蟲草的基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)?；驑屴D(zhuǎn)化技術(shù)又稱為生物彈道技術(shù)或微粒轟擊技術(shù)，是一種將包裹了DNA的球狀金粉或者鎢粉顆粒通過火藥爆炸或者高壓氣體加速手段直接送入完整的組織或者細胞中的技術(shù)[53]。其多用于植物，現(xiàn)在也有研究將其用于菌物的遺傳轉(zhuǎn)化[54]。該方法的優(yōu)點為無需制備原生質(zhì)體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，操作較為簡單。茅文俊等[52]采用蛹蟲草野生型菌株為材料，以金粉包裹的質(zhì)粒pdht-gpda-GFP-bar作為微彈，運用基因槍法轉(zhuǎn)化，經(jīng)草銨膦抗性篩選后，結(jié)合PCR鑒定、Southern印跡雜交以及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）技術(shù)，成功獲得兩個遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子Gfp2和Gfp3。這驗證了基因槍法可以應(yīng)用于菌物——蛹蟲草，從而建立一種簡單有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

蛹蟲草兩種遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為蛹蟲草基因功能鑒定提供了良好的基礎(chǔ)，是目前蛹蟲草研究中最為常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將有助于今后鑒定蛹蟲草未知基因的功能、尋找表型相關(guān)的基因等，可根據(jù)其優(yōu)缺點按照實際需求選用。

2.2 DNA甲基化

DNA甲基化是一種在真核生物中基本的表觀遺傳學(xué)機制，但在不同類群中其模式和作用各不相同[55]。在菌物中，DNA甲基化對多樣化的生物過程有多種影響[56]。然而，在菌物有性階段其功能尚不清楚。蛹蟲草容易進行有性生殖，為了解有性階段中的表觀遺傳過程提供了一個非常豐富的模型。Wang Yulong等[57]利用基因組亞硫酸鹽測序技術(shù)分析蛹蟲草的單堿基分辨率甲基化譜來評估蛹蟲草在有性階段的DNA甲基化。結(jié)果表明，大約0.40%的胞嘧啶發(fā)生了甲基化，與在無性階段的DNA甲基化水平（0.39%）類似，DNA甲基化在菌物發(fā)育期間經(jīng)歷了整體性的重組[57]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析表明蛹蟲草中不同的差異甲基化區(qū)域與在菌物有性階段起作用的基因無相關(guān)性。這些結(jié)果對蛹蟲草有性生殖過程中DNA甲基化給出了較全面地描述，也證明了和高等動植物相比[58]，菌物中的DNA甲基化可能并不是必須的，這將有助于未來更好地研究蛹蟲草的表觀遺傳學(xué)。

3 蛹蟲草基因組

3.1 基因組與比較基因組

Zheng Peng等[59]于2011年首次破譯了蛹蟲草的全基因組，組裝后基因組大小為32.2 Mb，GC含量為51.4%，含7 條染色體，范圍在2.0～5.7 Mb之間[60]；基因組中共含有9 684 個蛋白編碼基因，超過63%的編碼基因在菌絲體和子實體發(fā)育階段表達，大約16%的編碼基因（1 547 個）參與菌物-昆蟲的相互作用，沒有發(fā)現(xiàn)已知對人類有害的編碼菌物毒素的同源基因。蛋白質(zhì)編碼基因中13.7%為種特異性的基因，明顯高于羅伯茨綠僵菌（Metarhizium robertsii，4.8%）和蝗綠僵菌（M. acridum，3.5%）。運用比較基因組學(xué)與進化基因組學(xué)分析手段，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草的出現(xiàn)較綠僵菌早約1.3億 年，各自獨立進化而具有殺蟲特性，但表現(xiàn)出協(xié)同進化的特點，與其他菌物相比，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶等用于昆蟲體壁降解的蛋白質(zhì)家族表現(xiàn)出明顯的擴張現(xiàn)象。Zheng Peng等[61]利用種系基因組學(xué)分析表明，昆蟲病原菌物已進化多次，蛹蟲草由菌物寄生菌或植物內(nèi)生菌分化而來。相較于植物病原菌和腐生菌，蟲草屬菌物都顯示出了蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的特征性基因組擴張現(xiàn)象，兩種酶的作用都是幫助菌物分解侵入昆蟲表皮。這也印證了蛹蟲草的全基因組數(shù)據(jù)結(jié)果，提示這兩種酶的擴張現(xiàn)象與蛹蟲草的致病策略有關(guān)，其主要是通過降解昆蟲體壁侵入蟲體，然后進行侵染。Staats等[62]研究了蛹蟲草比較基因組，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草基因組大小比羅伯茨綠僵菌（39.04 Mb）、蝗綠僵菌（38.05 Mb）和金龜子綠僵菌（M. anisopliae，38.5 Mb）等其他病原菌物要?。ū?）。蛹蟲草含2 245 個獨有蛋白質(zhì)編碼基因，占蛹蟲草中全部蛋白質(zhì)編碼基因的23.2%，相較于同為病原菌物的蝗綠僵菌（875 個）、金龜子綠僵菌（690 個）和羅伯茨綠僵菌（603 個），其種特異性基因的數(shù)量最多，這和Zheng Peng等[59]的研究結(jié)果一致。4 種菌物中共有蛋白質(zhì)26 224 個，占蛋白質(zhì)總數(shù)的62.64%，相較于其他3 種病原菌物，蛹蟲草的種特異性蛋白質(zhì)數(shù)量最少（141 個），但具體原因還有待于進一步研究。

基因組測序只找到一個單一的交配型基因（mating type gene，MAT）說明蛹蟲草的有性生殖類型為異宗配合，但單交配型菌株也能夠長出子實體[59]。蛹蟲草有兩種交配型基因：MAT1-1和MAT1-2，其是調(diào)控菌物有性生殖的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，該兩組類等位基因相互協(xié)同完成菌物的有性生殖[66]。因此，交配型基因?qū)ρ芯孔幽揖到y(tǒng)進化關(guān)系、有性生殖以及小種分化差異等方面有著重要的意義。蛹蟲草的兩組交配型基因現(xiàn)已克隆成功，Cong Weiran等[67]利用TAIL-PCR技術(shù)克隆了MAT1-1，其核苷酸序列總長度為5 000 bp，包含兩個基因：MAT1-1-1和MAT1-1-2。MAT1-1-1基因由1 480 bp的核苷酸組成，編碼456 個氨基酸，還包含一個被兩個內(nèi)含子間隔的保守Alpha-box結(jié)構(gòu)域。MAT1-1-2基因由1 066 bp的核苷酸組成，編碼377 個氨基酸。魏靜[68]利用巢氏PCR和染色體步行方法克隆了MAT1-2-1基因，其核苷酸序列總長度為8 580 bp，編碼239 個氨基酸。這兩種基因可作為蛹蟲草的分子標記，為早期鑒定可產(chǎn)生子實體菌株、避免大規(guī)模的經(jīng)濟損失提供了可能。

蟲草素是蛹蟲草中最重要的活性成分之一[20]，蛹蟲草的全基因組測序和數(shù)據(jù)分析工作的完成，為從分子水平上解析蟲草素的生物合成途徑提供了可能，蟲草素生物合成涉及多基因的表達和調(diào)控，開展蟲草素生物合成相關(guān)基因研究，有助于從分子水平了解蟲草素生物合成的調(diào)控機制，為通過基因操作提高蟲草素的產(chǎn)量提供依據(jù)。目前，該方面的研究取得了一些新的進展。莫紅麗等[69]使用誘變劑對蛹蟲草菌株進行誘變，篩選蟲草素高表達菌株，在確定該突變穩(wěn)定可遺傳的基礎(chǔ)上，采用抑制消減雜交技術(shù)，從基因水平上對蟲草素表達產(chǎn)生的差異進行分析，以突變型（高表達蟲草素的菌株）作為檢測子，以野生型（未作誘變處理的出發(fā)菌株）作為驅(qū)動子，經(jīng)過消減雜交后得到了一組正調(diào)控基因片段的克隆，并對該組克隆進行了序列測定，克隆出7 個蟲草素生物合成相關(guān)的序列，分別命名為chcs1、chcs2、chcs3、chcs4、chcs5、chcs6、chcs7，這些序列均為蛹蟲草中首次報道，但是它們的具體功能有待進一步研究。葉小舟等[70]通過構(gòu)建含有上述基因的高效植物表達轉(zhuǎn)化載體，增加菌體內(nèi)生物合成基因拷貝數(shù)，以提高蟲草菌表達蟲草素的含量，并申請了專利。Wang Chengshu等[71]在蛹蟲草全基因組研究的基礎(chǔ)上，通過與模式生物構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的比較基因組分析，結(jié)合基因敲除、異體表達和代謝分析等技術(shù)手段，在蛹蟲草中發(fā)現(xiàn)了一組蟲草素的合成基因簇，包括Cm1和Cm2和/或Cm3，分別對應(yīng)構(gòu)巢曲霉中的同源基因An1、An2和/或An3。Wang Chengshu等[71]還提供了一種能夠?qū)崿F(xiàn)蟲草素生物合成的方法，即用蟲草素生物合成相關(guān)基因（包括蛹蟲草的Cm1和Cm2基因，或包括構(gòu)巢曲霉的An1和An2基因）轉(zhuǎn)化宿主細胞，使之生產(chǎn)蟲草素。這一研究涉及蛹蟲草代謝產(chǎn)物蟲草素的合成基因簇的鑒定和應(yīng)用，推進了蟲草素生物合成的研究。但關(guān)于蟲草素完整的生物合成代謝通路還未建立，這還是今后有待深入研究的重點。

3.2 線粒體基因組

除了基因組，線粒體基因組也具有自己特定的基因組成、遺傳密碼和復(fù)制方式，是研究物種起源與進化的有力工具[72]。Sung[73]于2015年報道了蛹蟲草線粒體基因組，全長33 277 bp，包含14 個蛋白質(zhì)編碼基因、2 個rRNA亞基和27 個tRNA。核酸由36.98%的腺嘌呤（A）、26.23%的胸腺嘧啶（T）、15.21%的鳥嘌呤（G）和11.59%的胞嘧啶（C）組成。蛹蟲草線粒體DNA包含共8 個Group I的內(nèi)含子，總長為11 052 bp，其中4 個內(nèi)含子包含在rnl基因中。因蛹蟲草線粒體DNA具有較快的進化速率，現(xiàn)已開始被廣泛應(yīng)用于進化、遺傳漂變、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳、雜交以及生物地理學(xué)等方面的研究。張永杰等[74]利用線粒體基因組，通過PCR擴增和序列分析，比較了20 個蛹蟲草菌株在12 個線粒體DNA片段和3 個細胞核DNA片段上的序列變異。發(fā)現(xiàn)蛹蟲草在線粒體DNA上的變異水平高于核DNA，主要表現(xiàn)為線粒體基因內(nèi)含子的插入缺失多樣性和較多的堿基變異位點，不同線粒體DNA片段的變異水平也有差異，而且內(nèi)含子編碼的蛋白質(zhì)比外顯子編碼的蛋白質(zhì)更易發(fā)生氨基酸的改變。通過增加使用的分子標記數(shù)目，其所揭示的遺傳多樣性程度也在逐漸提高，共找到了6 個線粒體DNA位點用于今后蛹蟲草遺傳多樣性或群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。這為更好地篩選蛹蟲草線粒體基因組中的分子標記提供了良好的支持。

綜上所述，蛹蟲草基因組和線粒體基因組的破譯以及比較基因組的研究為深入研究蛹蟲草活性成分代謝途徑及其有性生殖的分子調(diào)控機理等奠定了良好的基礎(chǔ)。這一系列研究將大力推進蛹蟲草分子方面的后續(xù)研究。

4 蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA；其狹義上指所有mRNA的集合[75]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究為人們開啟了基因功能研究的大門，已經(jīng)成為研究植物、動物以及微生物較為常規(guī)的手段[76-77]。但關(guān)于蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面的研究較少，而且大部分由我國學(xué)者報道。Xiong Chenghui等[78]采用EST分析技術(shù)，對不同培養(yǎng)條件及不同發(fā)育階段的蛹蟲草進行了研究，構(gòu)建了4 個cDNA文庫，分別代表蛹蟲草液體培養(yǎng)階段、人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生子實體的早期和末期階段以及注射蠶蛹產(chǎn)生子實體的末期階段，挑選5 000多個克隆子進行了測序。組裝后共獲得1 341 個非重復(fù)序列基因（unigene），包括454 個重疊群和887 個單條序列。比較發(fā)現(xiàn)4 個文庫間的基因轉(zhuǎn)錄差異顯著，僅2.1%的unigene是共有的。利用基因本體論分析（gene ontology，GO）進行基因注釋分析，發(fā)現(xiàn)不同文庫間有不同的轉(zhuǎn)錄表達模式。和有性階段相比，蛹蟲草菌絲體在無性階段中特異性地上調(diào)了更多細胞代謝、能量代謝以及壓力應(yīng)答相關(guān)的基因，還發(fā)現(xiàn)在人工培養(yǎng)基和注射蠶蛹所產(chǎn)生的子實體的轉(zhuǎn)錄譜中也有顯著差異，但兩個文庫均含有豐富的細胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，分別有38.72%和26.35%的unigene為細胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本[44]。這提示人工培養(yǎng)基上生長的菌絲體或子實體和蟲體上產(chǎn)生的子實體之間具有相似活性成分的說法不可靠。Zheng Peng等[59]通過高通量轉(zhuǎn)錄組分析表明，在蛹蟲草子實體階段Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子和絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路被誘導(dǎo)激活，而非MAPK和蛋白激酶A共同調(diào)控，這點與其他菌物不同[59,79]。同時，菌絲體階段和子實體階段基因轉(zhuǎn)錄譜存在差異也驗證了Xiong Chenghui等的研究結(jié)果[78]。Yin Yalin等[80]利用高通量Illumina測序分析蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌絲體階段和人工栽培子實體階段之間的轉(zhuǎn)錄譜存在明顯差異，預(yù)測到可變剪切與新的轉(zhuǎn)錄本，這一發(fā)現(xiàn)豐富了蛹蟲草的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫。通過基因表達分析，在菌絲體階段和子實體階段分別發(fā)現(xiàn)2 113 個和599 個基因上調(diào)。利用GO和京都基因與基因組百科全書分析來比較基因的表達差異，功能注釋后顯示，細胞內(nèi)的核苷酸結(jié)合和代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯在菌絲體階段更積極，而糖代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在子實體階段更為活躍。這意味著子實體生長需要更多的能量，大米培養(yǎng)基可以提供豐富的碳水化合物。此外，還對在不同發(fā)育階段蛹蟲草蟲草素可能的代謝差異進行了研究。推測蟲草素代謝途徑可能在菌絲體階段更加活躍[80]。這些關(guān)于蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究為今后探究其相關(guān)活性基因的表達調(diào)控和功能提供了依據(jù)，但是如前所述，蟲草素的基因通路和代謝網(wǎng)絡(luò)以及很多生物過程（例如菌株退化）的分子機制尚不清楚，今后仍然是研究重點。

對于研究基因的功能以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR（reverse transcription real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是一種有力的技術(shù)手段，蛹蟲草作為一種重要的食藥用菌物，其基因表達分析已變得越來越重要和流行。在不同的實驗條件下選擇合適的參考基因驗證是RT-qPCR分析的關(guān)鍵，但研究選擇的內(nèi)參基因五花八門，例如18S rRNA[45]、actin[81]、tub[81]等。Lian Tiantian等[82]選取3 組蛹蟲草樣品和5 個不同的發(fā)育階段，分別培養(yǎng)于麥麩培養(yǎng)基和蠶蛹蛹體中，利用RT-qPCR技術(shù)，選擇8 個候選內(nèi)參基因：actin、cox5、gpd、rpb1、tef1、try、tub和ubi（均為持家基因），分別采用GENORM、NORMFINDER、BESTKEEPER和比較ΔCt法4 種不同的算法對其表達的穩(wěn)定性進行評價。結(jié)果表明，所有發(fā)育階段中rpb1是最好的內(nèi)參基因，而最常用的actin和tub并不能作為合適的內(nèi)參基因。cox5表現(xiàn)不佳且表達不穩(wěn)定；ubi和gpd在采用不同的方法和不同的樣品時得到的結(jié)果不一致。該研究為不同發(fā)育階段內(nèi)參基因的選擇提供了依據(jù)，也表明在蛹蟲草基因表達分析中RT-qPCR是一種更準確、更應(yīng)廣泛使用的基礎(chǔ)技術(shù)。

5 蛹蟲草蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)組的概念最早由Wilkins等[83]提出，指由一個基因組或一個細胞、組織表達的全部蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)錄時，一個基因可以有多種mRNA剪接形式，一個蛋白質(zhì)組不是一個基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目[84]。隨著基因組測序技術(shù)的誕生與發(fā)展，生物學(xué)研究已經(jīng)進入后基因組時代。生物過程的發(fā)生常常是受多因素影響的，勢必涉及到多個蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)組不僅是后基因時代研究的重要組成，還為全面描述未知基因的功能提供了有力的技術(shù)支持。Yin Yalin等[80]利用蛋白質(zhì)組手段研究和分析蛹蟲草菌絲體階段和人工栽培的子實體階段之間的差異。結(jié)合一維凝膠電泳與納米電噴霧液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)測定了蛹蟲草蛋白組數(shù)據(jù)，分別在蛹蟲草菌絲體階段和人工栽培的子實體階段檢測到359 個和214 個蛋白質(zhì)，但僅有98 個蛋白質(zhì)在兩個階段中都有表達。這個結(jié)果也從蛋白水平提示，人工培養(yǎng)基上生長的菌絲體或子實體和蟲體上產(chǎn)生的子實體之間具有相似的活性成分這一說法不可靠。該研究還檢測到了一些重要的蛋白質(zhì)，如外源凝集素、SOD、糖苷水解酶和參與蟲草素代謝的蛋白質(zhì)，這為藥用成分的進一步研究提供了線索，將促進蛹蟲草的發(fā)育和藥理研究。Staats等[62]的分析發(fā)現(xiàn)蛹蟲草Cm01中有糖基化磷脂?；^定蛋白73 個，并預(yù)測到301 個與分泌有關(guān)的蛋白質(zhì)，占總蛋白質(zhì)數(shù)量（9 651 個）的3.1%。蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對基因表達的蛋白質(zhì)水平進行定量測定，解釋基因表達調(diào)控的機制[85]。雖然基因決定蛋白質(zhì)的水平，但是基因表達的水平并不能代表細胞內(nèi)活性蛋白的水平，蛋白質(zhì)組學(xué)分析是對蛋白質(zhì)翻譯和修飾水平等研究的一種補充，是全面了解基因組表達的一種必不可少的手段。

6 結(jié) 語

2011年蛹蟲草基因組得以破譯，蛹蟲草分子方面的神秘面紗在逐步揭開，一系列關(guān)于蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)方面的研究也取得了較大進展。

然而，還有許多問題沒有得到解決。蟲草素作為蛹蟲草中最重要的一類活性物質(zhì)，其化學(xué)合成成本高、難度大，目前主要是靠從蛹蟲草培養(yǎng)物中分離提取，所以價格昂貴。美國Sigma公司出售的蛹蟲草來源的蟲草素（C3394-25 mg）售價為2 765.88 元[20]?，F(xiàn)在的研究多是以優(yōu)化培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件來提高蟲草素的含量[86-88]，其生物合成途徑以及關(guān)鍵信號通路仍不清楚。另外，與一些絲狀菌物一樣，人工大規(guī)模栽培中蛹蟲草菌株容易出現(xiàn)退化的現(xiàn)象[89-90]，對生產(chǎn)會造成很大的經(jīng)濟損失[41,61,91]，而且這種退化通常是不可逆和可遺傳的[92-93]?，F(xiàn)在關(guān)于蛹蟲草菌株退化的研究大多集中于培養(yǎng)技術(shù)與保藏技術(shù)的優(yōu)化，培養(yǎng)條件的確影響子實體的形成和代謝物（如蟲草素、多糖）產(chǎn)生[94-95]，但這些過程的分子遺傳基礎(chǔ)仍不清楚，蛹蟲草分子水平上的變化才是引起菌種退化的根本原因。隨著后基因時代的到來，除了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)，其他如宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)、免疫組學(xué)以及RNA組學(xué)等組學(xué)手段可以應(yīng)用于蛹蟲草的研究中，這將有利于改善、解決蛹蟲草菌種退化問題以及構(gòu)建蟲草素代謝通路。

本文總結(jié)了蛹蟲草在遺傳多樣性、分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究現(xiàn)狀，以期能夠促進人們更好地認識和利用蛹蟲草這一古老的藥食同源菌，加快其基礎(chǔ)研究和應(yīng)用的步伐，造福于人類健康。