趙艷紅，劉 濤

(商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校人體解剖學(xué)教研室，河南商丘 476100)

目前，內(nèi)皮功能障礙是發(fā)生動脈粥樣硬化的早期事件。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它與動脈粥樣斑塊的進展有重要關(guān)系[1-2]。而內(nèi)皮細胞受損時，會破壞血穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致血栓形成、脂質(zhì)積累，最終形成粥樣斑塊，因此早期控制內(nèi)皮功能是防治冠心病的關(guān)鍵。目前已經(jīng)公認，高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的獨立危險因素[3]。血漿中同型半胱氨酸(Hcy)升高會造成內(nèi)皮細胞功能障礙，引起血管舒張功能異常，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞喪失抗血栓形成的作用，引起血小板黏附聚集，進而引發(fā)早期動脈粥樣硬化。熱休克蛋白27(HSP27)參與細胞凋亡、炎癥和動脈壁的穩(wěn)態(tài)維持等多種過程。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP27在抗心肌缺血損傷、細胞凋亡及抗炎性反應(yīng)中都有一定作用，還可調(diào)控平滑肌細胞的増殖遷移、穩(wěn)定細胞骨架、抗凋亡[4]。LEE等[5]研究發(fā)現(xiàn)，HSP27在動脈粥樣硬化有著不可忽視的作用，且血清中HSP27水平和動脈粥樣硬化程度呈負相關(guān)。HSP27有可能作為預(yù)防和診斷動脈粥樣硬化的新靶點。本研究通過實驗探討HSP27對Hcy誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用，并對HSP27相關(guān)保護機制進行分析。

1 資料與方法

1.1實驗儀器及耗材

1.1.1主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱Heracell150i(美國Thermo Scientific)；超凈工作臺(中國蘇凈安泰)；CH20-BIM倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；IX71熒光顯微鏡(日本Olympus)；離心機(美國Thermo Scientific)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson)；電熱恒溫水浴箱(中國上海精宏實驗設(shè)備)；電子分析天平(德國Sartorius)；恒溫磁力攪拌器(中國江蘇榮華儀器制造)。

1.1.2主要試劑 細胞培養(yǎng)DMEM(美國Gibco)；MTT細胞活性試劑(美國Invitrogen)；細胞培養(yǎng)胎牛血清(FBS，美國Coning)；AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒(中國南京凱基)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen)；總一氧化氮檢測試劑盒(碧云天公司)；DCHP活性氧檢測試劑盒(碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)培養(yǎng)及鑒定 無菌收集健康新生兒臍帶，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗靜脈腔后灌注0.1%膠原酶消化30 min，含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，消化液1 500 r/min離心8 min后加入培養(yǎng)液重懸細胞，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞貼壁并85%融合后，用0.05%胰酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。每2天進行一次細胞傳代，同時更換培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的第3～5代用于實驗。

1.2.2HUVECs存活率檢測 培養(yǎng)后的HUVECs，經(jīng)0.5%胰酶充分消化后接種于96孔板，10 000個/孔，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。按照實驗分組在孔板上加入不同濃度藥品，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)立陰性對照孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入15 μL的5 g/L的MTT溶液，孵育4 h后，棄上清液，立即加入100 μL DMSO，充分振蕩15 min，采用酶標(biāo)儀波長490 nm測定各孔吸光度(A)值。HUVEC增殖率(%)=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。Hcy組：分別加入Hcy使終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。Hcy+HSP27組：每孔分別加入Hcy使終濃度為0.8 mmol/L，并分別加入HSP27，使終濃度為0、2、4、6、8、10 μg/L。

1.2.3細胞凋亡檢測 培養(yǎng)后的HUVECs，經(jīng)0.5%胰酶充分消化后接種于96孔板，10 000個/孔，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。HSP27+Hcy組給予終濃度0.8 mmol/L的Hcy培養(yǎng)12 h后，將培養(yǎng)液更換為含有濃度為10 μg/L的HSP27，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Hcy組給予終濃度0.8 mmol/L的Hcy后培養(yǎng)12 h后，將培養(yǎng)液更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。空白組使用正常培養(yǎng)基。收集各組細胞于EP管中，1 800 r/min離心5 min。用PBS對細胞清洗2次，再次1 800 r/min離心5 min。棄上清液，加入200 nL結(jié)合液重懸細胞；加入2.5 μL Annexin V-FITC，充分混勻后于室溫下避光反應(yīng)10 min。加入5 μL 碘化丙啶(PI)染色液，混勻后室溫避光反應(yīng)5 min，進行流式細胞儀檢測。

1.2.4細胞培養(yǎng)液中NO水平檢測 培養(yǎng)后的HUVECs，經(jīng)0.5%胰酶充分消化后接種于96孔板，10 000個/孔，放入 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。HSP27+Hcy組更換為含有濃度為0.8 mmol/L的Hcy及10 μg/L的HSP27的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Hcy組更換為含有濃度為0.8 mmol/L的Hcy的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h?？瞻捉M使用正常培養(yǎng)基，每組6個復(fù)孔。分別收集各組細胞培養(yǎng)液，離心取上清液備用。按照總一氧化氮檢測試劑盒(硝酸還原酶法)說明書進行檢測，計算樣品中的NO濃度。

1.2.5細胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測 培養(yǎng)后的HUVECs，經(jīng)0.5%胰酶充分消化后接種于96孔板，10 000個/孔，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h。HSP27+Hcy組更換為含有濃度為0.8 mmol/L的Hcy及10 μg/L HSP27的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Hcy組更換為含有濃度為0.8 mmol/L Hcy的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h?？瞻捉M使用正常培養(yǎng)基。每組6個復(fù)孔。按照試劑盒說明書進行如下操作：按照1∶1 000用DMEM培養(yǎng)液稀釋2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，終濃度為10 μmol/L。分別收集各組細胞于EP管中，1 800 r/min離心5 min；棄上清液，加入約1 mL DMEM培養(yǎng)液懸浮細胞，再次離心后吸除上清液；于37 ℃避光條件下加入500 μL的DCFH-DA染液，反應(yīng)20 min后1 800 r/min離心5 min，采用無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌2次；加入500 μL的DMEM培養(yǎng)液懸浮細胞，進行流式細胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1HUVECs生存率

2.1.1Hcy對HUVECs存活率的影響 HUVECs與不同濃度的Hcy作用后，0 mmol/L存活率均值為97.33%，Hcy 0.2 mmol/L組存活率均值為95.17%，Hcy 0.4 mmol/L組存活率均值為90.72%，Hcy 0.6 mmol/L組存活率均值為78.29%，Hcy 0.8 mmol/L組存活率均值為63.65%，Hcy 1.0 mmol/L組存活率均值為41.51%。0 mmol/L組與Hcy 0.2 mmol/L組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Hcy 0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L組存活率均低于0 mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖1。

a:P<0.05，與Hcy 0 mmol/L比較

圖1 Hcy對HUVECs存活率的影響

a:P<0.05，與HSP27 0 μg/L比較

圖2 HSP27對HUVECs損傷的保護

2.1.2HSP27對HUVECs存活率的影響 取Hcy 0.8 mmol/L時不同濃度的HSP27與HUVECs相互作用，加入不同濃度HSP27組的內(nèi)皮細胞存活率較0 μg/L組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

a:P<0.05,與空白組比較；b:P<0.05與Hcy組比較

圖3 HSP27對Hcy誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響

a:P<0.01,b:P<0.05,與空白組比較；c:P<0.05,與Hcy組比較

圖4 HSP27對Hcy刺激HUVECs的NO水平的影響

a:P<0.01，與空白組比較，b：P<0.01,與Hcy組比較

圖5 HSP27對Hcy誘導(dǎo)的HUVECs產(chǎn)生ROS的影響

2.2HUVECs凋亡情況 空白組細胞凋亡率為0.5%，Hcy組細胞凋亡率為88.85%，明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Hsp27+Hcy組細胞凋亡率為50.93%，低于Hcy組且高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖3。

2.3NO水平 空白組NO水平29.37 μmol/L明顯低于Hcy組NO水平8.94 μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；空白組NO水平29.37 μmol/L高于HSP27+Hcy組NO水平22.18 μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Hcy組NO水平8.94 μmol/L低于HSP27+Hcy組NO水平22.18 μmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.4對Hcy誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS的影響 通過DCF的熒光反應(yīng)程度來反映ROS的產(chǎn)生水平?？瞻捉MROS水平最低，Hsp27+Hcy組次之，Hcy組ROS水平最高；Hcy組ROS水平明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Hsp27+Hcy組高于空白組且低于Hcy組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，見圖5。

3 討 論

動脈粥樣硬化是由于脂質(zhì)代謝異常和慢性炎性反應(yīng)所引起的動脈管壁病變。近年來，“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”受到了廣泛關(guān)注[6]。越來越多的證據(jù)顯示，內(nèi)皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化與心血管疾病發(fā)展之間的一個重要病理生理環(huán)節(jié)[7]。在本研究中，聯(lián)合應(yīng)用Annexin V與PI可區(qū)分凋亡早期、晚期及壞死細胞的原理，發(fā)現(xiàn)Hcy能夠減少內(nèi)皮細胞的生存率，且隨著Hcy濃度增高，內(nèi)皮細胞的生存率越低，與Hcy濃度呈負相關(guān)。血漿Hcy水平升高是動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的獨立危險因素。斑塊中細胞持續(xù)凋亡會引起長期慢性炎性反應(yīng)，加快斑塊破裂及促進血栓形成。目前已有一些關(guān)于Hcy相關(guān)性的內(nèi)皮細胞功能障礙的研究[3,8]。本研究結(jié)果顯示，隨著Hcy濃度的增加，細胞生存率逐漸降低，高濃度Hcy可有明顯的內(nèi)皮細胞生長抑制作用，Hcy能夠抑制內(nèi)皮細胞生存，呈劑量依賴。

目前多數(shù)研究認為Hcy導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的重要機制[2,4,9]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy能夠?qū)е聝?nèi)皮細胞產(chǎn)生NO減少，還能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。NO是內(nèi)皮細胞維持血管擴張的主要調(diào)節(jié)因子，而血管內(nèi)皮在成生NO過程中出現(xiàn)異常，使NO生成減少，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，是動脈粥樣硬化的前奏[10]。AJITH[11]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞生成的減少及氧化應(yīng)激反應(yīng)增強導(dǎo)致的NO損失都會導(dǎo)致NO生物利用率下降。內(nèi)皮功能障礙時，通過趨化因子、黏附分子及一系列的反應(yīng)，影響NO生成。而有研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化病變細胞中死亡相關(guān)蛋白激酶表達增加，會增加動脈壁不穩(wěn)定性，更容易吸收低密度脂蛋白[12]。已有研究證實，死亡相關(guān)蛋白激酶參與Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡過程[13]。而HSP27并不影響死亡相關(guān)蛋白激酶表達，考慮死亡相關(guān)蛋白激酶處于HSP27的調(diào)控上游。NO產(chǎn)生減少可作為內(nèi)皮功能障礙的一個指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，HSP27濃度越高，細胞的存活率越高，呈濃度依賴性，HSP27對HUVECs損傷具有保護作用；同時采用總一氧化氮檢測試劑盒對細胞培養(yǎng)液中NO水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)Hcy刺激HUVECs會抑制NO的合成或釋放；加入HSP27后能減弱Hcy對內(nèi)皮細胞的影響，從而改善內(nèi)皮功能。還有研究發(fā)現(xiàn)，HSP27具有分子伴侶作用，它通過與轉(zhuǎn)錄因子作用，在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控，降低Hcy對內(nèi)皮細胞功能的影響[14]。

ROS能夠增強細胞氧化應(yīng)激，促進炎癥介質(zhì)釋放、低密度脂蛋白氧化，破壞凝血功能平衡等。據(jù)報道，氧化應(yīng)激在內(nèi)皮功能障礙發(fā)生機制中起著重要作用[15]。ROS的內(nèi)源性衍生物主要由線粒體產(chǎn)生，當(dāng)ROS過量時可造成廣泛性氧化損傷，導(dǎo)致細胞功能喪失，甚至凋亡。ROS是細胞內(nèi)信號傳遞者，在引起細胞凋亡中起重要作用。本研究采用DCFH-DA活性氧檢測試劑盒進行細胞內(nèi)ROS定量檢測。通過流式細胞儀檢測DCF的熒光強度就能知道細胞內(nèi)ROS的水平。本研究證實，Hcy能夠誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，引起內(nèi)皮細胞功能障礙，是早期血管出現(xiàn)動脈粥樣硬化的關(guān)鍵。HSP27被作為細胞保護者，已有研究證實它能夠通過多個作用靶點發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡的作用：(1)穩(wěn)定線粒體膜功能；(2)改善細胞呼吸，減少ROS生成；(3)提高細胞內(nèi)還原能力；(4)激活Mt，促進細胞生存。LIN等[16]為進一步研究HSP27在Hcy處理過的內(nèi)皮細胞中的表達情況，通過質(zhì)粒構(gòu)建了HSP27高表達的內(nèi)皮細胞系，證實了而HSP27表達增加能夠抑制Hcy引起的內(nèi)皮細胞損傷和凋亡。由此可見，減少內(nèi)源性ROS產(chǎn)生，穩(wěn)定線粒體膜電位，是HSP27對抗Hcy引起的內(nèi)皮損傷的重要機制之一。

綜上所述，HSP27通過影響NO表達和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS水平保護Hcy誘導(dǎo)的受損傷的內(nèi)皮細胞，這些作用提示HSP27可能是預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的新靶點。

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