周 昉，黨紅星，陳應(yīng)富，白 科，方 芳，許 峰

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400014)

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)發(fā)病率為1/2 000～1/3 000，病死率為20%～60%[1]。其死亡的主要原因是肺發(fā)育不良(pulmonary hypoplasia，PH)和持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓(persistent pulmonary hypertension，PPH)[2]。目前對(duì)這些主要致死病因的處理仍是臨床治療CDH的瓶頸。探索致畸因素及誘發(fā)機(jī)制，尋找積極有效的方法產(chǎn)前改善肺發(fā)育不良和肺動(dòng)脈高壓將是CDH基礎(chǔ)與臨床研究的重點(diǎn)及防治的重要突破口之一。既往研究表明，Rho/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路主要參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病和肺纖維化形成，而粉防己堿(tetrandrine,TET)也具有肺保護(hù)作用。本研究擬測(cè)定除草醚誘導(dǎo)的CDH大鼠模型肺組織中Rho蛋白A和Rho激酶ROCK1的水平及產(chǎn)前給予TET干預(yù)后的變化，探討TET肺保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物模型建立和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SD大鼠由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄鼠按2∶1分籠定時(shí)配種，以配種12 h后見(jiàn)到雌鼠陰道孕栓為孕0.5 d。孕9.5 d將受孕成功的15只孕鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、膈疝組和TET組，每組5只。采用除草醚灌胃法[3](除草醚購(gòu)自浙江化工二廠，每只125 mg +2 mL橄欖油灌胃)建立膈疝組與TET組CDH模型，對(duì)照組予每只2 mL橄欖油灌胃。孕16.5 d，TET組給予TET灌胃(TET購(gòu)自上海克拉瑪爾試劑公司，批號(hào)ZY160301，30 mg·kg-1·d-1，每日1次，3 d)，對(duì)照組和膈疝組給予2 mL/kg孕鼠體質(zhì)量生理鹽水灌胃。本研究符合重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2胎肺標(biāo)本收集 妊娠21.5 d，所有孕鼠在戊巴比妥鈉(0.04 g/kg)腹腔注射麻醉下剖宮產(chǎn)，取出胎鼠稱(chēng)質(zhì)量后斷頭處死。再經(jīng)胸骨正中切口剖胸，完整取出左右兩側(cè)肺組織分別稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算胎鼠肺質(zhì)量/體質(zhì)量比(Lw/Bw)，在放大鏡下觀察膈疝形成情況。

1.2方法

1.2.1胎肺組織形態(tài)學(xué)檢查和免疫組化染色 每組隨機(jī)取出22份胎肺標(biāo)本(每份含雙側(cè)肺組織)常規(guī)固定、石蠟包埋，切片(同一張切片要包括每份標(biāo)本的左右肺組織)后行蘇木素-伊紅(HE)染色。使用Image Pro Plus5.0圖像分析軟件對(duì)光鏡下圖像計(jì)算反映肺泡與肺泡腔面積的百分比，即肺泡面積比(PAA%)作為肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo)；同時(shí)測(cè)定肺小動(dòng)脈管壁厚度占血管外徑百分比(WT%)、中膜厚度百分比(MT%)及管腔面積與血管總面積比值(LA%)作為胎鼠肺血管形態(tài)學(xué)指標(biāo),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化染色采用SP法,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對(duì)照，抗體采用anti-RhoA兔抗鼠多克隆抗體及ROCK1兔抗鼠單克隆抗體(均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性，觀察RhoA、ROCK1在各組胎鼠肺組織中的表達(dá)情況。用Nikon圖像采集儀在400倍視野下計(jì)算陽(yáng)性染色顆粒積分光密度(IOD)值，IOD值與目的抗體表達(dá)強(qiáng)弱呈正相關(guān)。

1.2.2Western blot法檢測(cè)胎肺組織RhoA蛋白及Rho激酶表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)3組分別取10份肺組織標(biāo)本提取蛋白質(zhì)，Bradford法定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉加入抗體RhoA或ROCK1一抗(均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)、孵育后加二抗、DAB顯色。將目的條帶蛋白表達(dá)量轉(zhuǎn)換為內(nèi)參照β-actin校正的灰度值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1胎鼠膈疝形成情況 對(duì)照組獲得胎仔49只，無(wú)膈疝形成；膈疝組獲胎仔55只，形成膈疝36只，致畸率65.45%；TET組獲胎仔51只，形成膈疝32只，致畸率62.75%；除草醚總致畸率為64.15%；膈疝組和TET組的致畸率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。膈疝形成大多位于左側(cè)(共56只，占膈疝總數(shù)的83.82%)，疝內(nèi)容物主要為胃、小腸，其次為肝臟，左側(cè)膈疝中巨大膈疝共21只，占左側(cè)膈疝37.5%；右側(cè)膈疝胎仔共11只，均無(wú)巨大膈疝形成；雙側(cè)膈疝1只。

2.2胎肺形態(tài)學(xué)觀察及肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 HE染色觀察，對(duì)照組肺組織發(fā)育良好，肺泡結(jié)構(gòu)明顯，腺泡大，肺泡間質(zhì)薄而均勻，呼吸性支氣管末端呈囊泡狀,肺小動(dòng)脈血管壁薄腔大，內(nèi)皮細(xì)胞分布均勻，中膜無(wú)增厚；膈疝組胎肺發(fā)育差，肺泡少且小，間質(zhì)厚，肺泡、肺泡管及肺泡囊呈假腺體樣改變,有明顯肺發(fā)育不良表現(xiàn)，肺小動(dòng)脈血管肌層肥厚，管壁明顯厚且管腔窄；TET組肺發(fā)育接近對(duì)照組，好于膈疝組，光鏡下示肺泡變大，肺泡間質(zhì)變薄，肺小動(dòng)脈管壁變薄，管腔狹窄程度較膈疝組減輕(圖1)。實(shí)驗(yàn)各組肺發(fā)育的形態(tài)學(xué)指標(biāo)Lw/Bw、PAA%、肺小動(dòng)脈WT%、MT%和LA%計(jì)算結(jié)果表明，膈疝胎鼠存在肺發(fā)育不良和肺血管重構(gòu)，TET能有效地改善肺組織發(fā)育，與膈疝組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 各組胎肺HE染色(×200)

組別nLw/BwPAA%WT%MT%LA%對(duì)照組224．24±0．3158．81±2．9213．50±1．4516．47±2．0761．20±3．23膈疝組222．11±0．36a33．60±3．12a26．64±2．41a25．98±2．79a38．58±2．15aTET組223．61±0．24ab42．46±3．68ab16．02±2．35ab17．96±1．95ab56．07±3．32abF253．17339．697238．399108．428355．571P0．0000．0000．0000．0000．000

a：P<0.05，與對(duì)照組相比;b:P<0.05，與膈疝組相比

圖2 各組胎肺RhoA及ROCK1表達(dá)情況(免疫組化×400)

組別nIOD值RhoA(IOD×103)ROCK1(IOD×103)n蛋白表達(dá)RhoA蛋白R(shí)OCK1蛋白對(duì)照組2216．54±2．0310．38±2．28100．48±0．080．27±0．06膈疝組2250．51±2．25a39．24±2．71a101．33±0．18a0．83±0．07aTET組2228．44±1．92ab17．03±1．15ab100．82±0．08ab0．43±0．06abF1536．981084．604123．138216．680P0．0000．0000．0000．000

a：P<0.05，與對(duì)照組相比;b：P<0.05，與膈疝組相比

A:Western blot；B：RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)情況

圖3 Western blot檢測(cè)RhoA、ROCK1蛋白水平的表達(dá)

2.3胎肺組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果 膈疝組中，胎肺支氣管上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量棕黃色顆粒，RhoA及ROCK1的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組；TET組RhoA、ROCK1的表達(dá)較膈疝組降低，陽(yáng)性范圍面積縮小，接近于對(duì)照組(圖2)。實(shí)驗(yàn)各組RhoA和ROCK1表達(dá)情況由低到高依次是對(duì)照組、TET組、膈疝組(P=0.000)，3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見(jiàn)表2。

2.4胎肺組織RhoA及Rho激酶ROCK1蛋白表達(dá)情況 膈疝組胎肺組織RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P=0.000)，與膈疝組相比，TET組RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)量明顯降低(P=0.000)，見(jiàn)表2、圖3。

3 討 論

自1990年KLUTH等[4]報(bào)道以來(lái)，用除草醚灌胃誘導(dǎo)懷孕大鼠產(chǎn)生膈疝胎鼠已經(jīng)成為一種相對(duì)成熟的經(jīng)典的CDH建模方法,廣泛用于國(guó)內(nèi)外關(guān)于膈疝的研究。本研究成功復(fù)制CDH模型，致畸率64.15%。CDH患兒的根本死亡原因是肺發(fā)育不良和持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓，這些病理過(guò)程在患兒出生前即已完成。本研究中，膈疝組光鏡下可觀察到，與正常胎肺相比，膈疝組胎肺相對(duì)質(zhì)量輕，胎肺肺泡小而少，間質(zhì)增厚，呼吸性支氣管末端囊泡狀結(jié)構(gòu)少見(jiàn)；肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，這些形態(tài)學(xué)改變支持膈疝胎鼠存在肺發(fā)育不良和肺血管重構(gòu)。目前治療膈疝的方法多樣，但無(wú)論是產(chǎn)前使用糖皮質(zhì)激素、胎兒外科還是產(chǎn)后手術(shù)、使用肺表面活性物質(zhì)、降肺動(dòng)脈高壓等治療手段均不能實(shí)現(xiàn)病因治療，也不能改善存活率。

Rho/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子包括Rho蛋白、Rho激酶和肌球蛋白磷酸酶，Rho蛋白屬于Ras蛋白超家族，RhoA是最常見(jiàn)的Rho蛋白異構(gòu)體之一。Rho激酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是RhoA的下游靶效應(yīng)分子。近年來(lái)，Rho/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路被證實(shí)在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，該信號(hào)通路的選擇性抑制劑能夠顯著抑制肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物肺血管收縮和肺血管重建的進(jìn)展[5]。TAKAYASU等[6]對(duì)除草醚誘導(dǎo)的CDH模型研究發(fā)現(xiàn)CDH胎仔肺血管中RhoA表達(dá)增高且具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖作用，認(rèn)為RhoA介導(dǎo)的血管收縮參與了CDH中PH的發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，膈疝組RhoA及Rho激酶ROCK1在肺泡上皮細(xì)胞和肺間質(zhì)內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，在肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞也能見(jiàn)到明顯的棕黃色顆粒；同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，RhoA及ROCK1蛋白表達(dá)在膈疝組明顯升高。已有研究發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)內(nèi)肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化是肺動(dòng)脈高壓的分子基礎(chǔ)，PASMCs的收縮取決于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MLC磷酸化程度，而MLC磷酸化受肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chainkin-ase,MLCK)和肌球蛋白磷酸酶(myosin phosphatase,MP)之間動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)，這一過(guò)程受到Rho/Rho激酶信號(hào)通路的活化調(diào)控，促進(jìn)PASMCs鈣調(diào)敏感性收縮及細(xì)胞增殖、遷移，使血管中膜明顯增厚，非肌性小動(dòng)脈肌化，管腔狹窄，從而在肺血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[7-8]。另還有研究發(fā)現(xiàn)，成肌纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積作用有賴(lài)于RhoA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Rho激酶特異性抑制劑可抑制肺纖維化的發(fā)生，對(duì)肺有保護(hù)作用[9]。結(jié)合前述免疫組化及Western blot的研究結(jié)果，聯(lián)系本實(shí)驗(yàn)光鏡下膈疝組與對(duì)照組相比胎仔肺發(fā)育及肺血管形態(tài)學(xué)的指標(biāo)變化，提示在除草醚誘導(dǎo)的膈疝中存在Rho/Rho激酶信號(hào)通路的作用。據(jù)此推測(cè)該信號(hào)通路在除草醚誘導(dǎo)膈疝模型胎仔肺血管重構(gòu)過(guò)程中起重要作用，并能影響膈疝胎鼠的肺發(fā)育，它可能通過(guò)直接影響平滑肌細(xì)胞收縮、調(diào)節(jié)細(xì)胞功能參與肺動(dòng)脈高壓和肺發(fā)育不良的形成。

本研究也對(duì)除草醚誘導(dǎo)的膈疝孕鼠產(chǎn)前給予TET灌胃干預(yù)。TET是一種雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，為傳統(tǒng)中藥粉防己的主要成分[10]；作為一種新型的鈣通道阻滯劑，TET具有調(diào)節(jié)血管舒縮、抗纖維化、抗氧自由基、抗炎等生物學(xué)效應(yīng)，其藥理作用廣泛[11-12]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TET可顯著降低慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠平均肺動(dòng)脈壓和肺血管阻力，并能抑制肺組織和肺動(dòng)脈壁膠原水平的增加[12-13]。細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)，TET具有抑制體外培養(yǎng)的PASMCs增殖的作用，這種作用可能有助于抑制伴有肺血管重構(gòu)的肺動(dòng)脈高壓[12]。產(chǎn)前干預(yù)研究還發(fā)現(xiàn)TET可改善CDH胎鼠肺組織發(fā)育[3]。如前所述，Rho/Rho激酶信號(hào)通路有參與肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制及參與肺纖維化的作用，而作為鈣通道阻滯劑的TET恰好具有調(diào)節(jié)血管舒縮、抗纖維化的作用，且已被應(yīng)用于矽肺、高血壓、肺動(dòng)脈高壓、腫瘤放療增敏等的臨床治療[11-12]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TET產(chǎn)前干預(yù)的CDH胎鼠肺組織RhoA及ROCK1表達(dá)情況，與膈疝組相比，RhoA及Rho激酶ROCK1的表達(dá)水平均有明顯下降，提示TET的干預(yù)抑制了RhoA及Rho激酶的作用。同時(shí)在光鏡下觀察TET干預(yù)的CDH胎鼠肺組織，與膈疝組相比，胎鼠肺Lw/Bw、PAA%等肺發(fā)育指標(biāo)及WT%、MT%和LA%等肺血管重構(gòu)指標(biāo)明顯更優(yōu)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示與膈疝組相比，TET組改善了CDH胎鼠肺發(fā)育不良；同時(shí)，改善了肺小動(dòng)脈管壁變厚管腔變窄的情況，表明TET在促進(jìn)CDH胎鼠肺發(fā)育，改善肺血管重構(gòu)方面有效。由此推測(cè)TET可通過(guò)調(diào)節(jié)Rho/Rho激酶信號(hào)通路對(duì)胎肺發(fā)揮保護(hù)作用。

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