馬新宇，李欣南，韓鐫竹，徐方旭，王升厚?，葉 齊

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品安全檢測(cè)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）又名北蟲(chóng)草，為子囊菌門(mén)[1]，肉座目，麥角菌科、蟲(chóng)草屬的模式種[2]。由子座（即草部分，又稱(chēng)子實(shí)體）與菌核（即昆蟲(chóng)的尸體部分）兩部分組成的復(fù)合體。1950年，德國(guó)科學(xué)家Cunningham從中分離出一種抗菌性物質(zhì)，3'-脫氧腺苷，定名為蟲(chóng)草素。蛹蟲(chóng)草中除蟲(chóng)草素外，還含有蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草多糖、腺苷等多種生物活性成分[3]。研究表明，蛹蟲(chóng)草具有消炎[4]、抗菌抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、提高人體免疫力等作用[5]。

很多學(xué)者在蛹蟲(chóng)草的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了抗菌活性物質(zhì)，如高燕燕等[6]在蛹蟲(chóng)草中提取到了水溶性和脂溶性的抗菌物質(zhì)，這種抗菌物質(zhì)初步斷定為蛋白質(zhì)。秦建春等[7]對(duì)蛹蟲(chóng)草中的乙酸乙酯萃取物質(zhì)和正丁醇萃取物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比研究其抗菌作用，結(jié)果表明乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用，而正丁醇萃取物對(duì)其無(wú)抑菌作用，但文獻(xiàn)中沒(méi)有涉及到蛹蟲(chóng)草浸提液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌抑菌作用的對(duì)比。本試驗(yàn)選用蛹蟲(chóng)草子實(shí)體粉的水提液和乙醇提取液作為研究對(duì)象，并通過(guò)薄層色譜法分析，初步得到使用不同濃度乙醇對(duì)蟲(chóng)草粉進(jìn)行提取而獲得的活性成分不同的結(jié)論，接著采用管碟法和微量稀釋法，分別對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，為進(jìn)一步研究蛹蟲(chóng)草的抗菌作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 標(biāo)準(zhǔn)菌株：ATCC25922大腸桿菌（E.coli）；ATCF29213金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），均購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 儀器 恒溫培養(yǎng)箱 memmert 260 INplus；高壓滅菌鍋SANYU MLS-3780；氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；EFAA-DC12-RT；麥?zhǔn)媳葷醿xDensimat bioMerieux France；恒溫水浴鍋，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司DKS-12；分析天平METTLER TOLEDO AG285；牛津杯放置器，北京先驅(qū)威峰技術(shù)開(kāi)發(fā)公司 2Y-300G。

1.1.3 藥品 新霉素（1 mg含645個(gè)單位）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所130309-200811；黏菌素（1 mg含22782個(gè)單位）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所K0271305；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司20160318。無(wú)水乙醇、NaCl、乙酸乙酯、正丁醇、二甲亞砜均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 生理鹽水：稱(chēng)取0.85 g的NaCl，加入100 mL無(wú)菌水。新霉素工作液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg新霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用3%NaCl定容到50 mL容量瓶中，配置為12.9 U/mL的金黃色葡萄球菌陽(yáng)性對(duì)照藥品。黏菌素工作液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg黏菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用3%NaCl定容至25 mL容量瓶中，配置為911.28 U/mL的大腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照藥品[8]。

1.2.2 蛹蟲(chóng)草活性物質(zhì)的提取與制備 提?。悍Q(chēng)取干燥的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體干粉20 g共6份，分別加入200 mL無(wú)菌水及50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，4℃浸提16～20 h，過(guò)濾分裝到離心管中，得到水提液和醇提液，使用氮吹儀分別氮吹，將浸提液濃縮為干粉合并，再用10 mL提取溶劑復(fù)溶，制備成抑菌活性物質(zhì)含量為0.001 g/mL浸提液。

使用乙酸乙酯和正丁醇作為提取劑，利用秦建春等文獻(xiàn)方法[7]，分別進(jìn)行蟲(chóng)草粉中抑菌活性物質(zhì)的提取，經(jīng)氮吹濃縮，乙酸乙酯浸提物用二甲亞砜助溶后用無(wú)菌水配成0.001 g/mL提取物的溶液。

1.2.3 薄層色譜法分離抑菌物質(zhì) 使用毛細(xì)管分別吸取蛹蟲(chóng)草水提液以及50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取液并進(jìn)行點(diǎn)樣，晾干后備用。使用無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮分別作為展開(kāi)劑，取20 mL左右展開(kāi)劑于層析缸內(nèi)，將晾干的硅膠板輕放在層析缸中，約40 min后將硅膠板取出晾干，在366 nm紫外燈下驗(yàn)視[9]。

1.2.4 菌懸液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株（E.coli、Staphylococcus aureus）接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h[10]。用無(wú)菌棉簽挑取新鮮單菌落（E.coli、Staphylococcus aureus）置于生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)菌懸液的濃度為1麥?zhǔn)?，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.5 平皿的制備 將1.2.4兩種菌懸液分別與48℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂按1:50比例混合均勻，制備好的上層在48℃水浴鍋中恒溫備用。定量平皿中加入15 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為下層，待冷卻后，加入5 mL上層，備用。

1.2.6 管碟法藥物敏感性試驗(yàn) 將制備好的水提液（50%、60%、70%、80%、90%乙醇的浸提液）（1.2.2）、新霉素工作液（1.2.1）、無(wú)菌水（50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液）試樣各200 μL加入放置于金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)用平板上的4個(gè)牛津杯中（提取液加入2個(gè)）；水提液（50%、60%、70%、80%、90%乙醇的浸提液）（1.2.2）、黏菌素工作液（1.2.1）、無(wú)菌水（50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液）試樣各200 μL加入放置于大腸桿菌檢驗(yàn)用平板上的4個(gè)牛津杯中（無(wú)菌水等加入2個(gè)）；將平皿放入恒溫培養(yǎng)箱，蓋好陶瓦蓋，37℃培養(yǎng)16～18 h[11]。

將制備好的乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液、80%乙醇提取液、二甲亞砜試樣各200 μL加入放置于金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)用平板上的4個(gè)牛津杯中，將平皿放入恒溫培養(yǎng)箱，蓋好陶瓦蓋，37℃培養(yǎng)16～18 h。

1.2.7 微量稀釋法藥物敏感性試驗(yàn) 取空白無(wú)菌96孔板，第一排加入1 000 μg/mL的蛹蟲(chóng)草粉浸提物（水提液，50%、60%、70%、80%、90%乙醇的浸提液）（1.2.2），用無(wú)菌水依次向右倍半稀釋?zhuān)渲贸蓾舛葹?1 000、 500、 250、 125、 62.5、 31.3、 15.6、7.8 μg/mL提取物的浸提液。

用無(wú)菌棉簽挑取新鮮單菌落（E.coli、Staphylococcus aureus）置于生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)菌懸液的濃度為0.5麥?zhǔn)?，吸?00 μL菌液加入已有10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的V型無(wú)菌槽中（1:100稀釋?zhuān)?，用微量移液器吸取混有菌液的營(yíng)養(yǎng)肉湯50 μL加入到96孔板中，將96孔板置于37℃培養(yǎng)24 h[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜法分離結(jié)果 不同的展開(kāi)劑分離物質(zhì)的效果不同，經(jīng)多次試驗(yàn)得出乙醇作為展開(kāi)劑展開(kāi)效果最好，如圖2所示。不同濃度乙醇提取液在薄層色譜板上以無(wú)水乙醇作為展開(kāi)劑，分離出物質(zhì)的比移值（Rf）不同，說(shuō)明提取得到的抑菌活性物質(zhì)不同，但抑菌活性物質(zhì)的具體成分有待進(jìn)一步考查。

2.2 蛹蟲(chóng)草浸提液的抗菌活性 圖3～14分別為蛹蟲(chóng)草不同濃度乙醇提取液和水提液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果，由圖可見(jiàn)，水提液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無(wú)明顯抑菌作用，50%、60%、70%、80%、90%乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用均大于對(duì)大腸桿菌的抑菌作用。

又由表1可知，80%乙醇提取得到的抑菌活性物質(zhì)對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌作用最大。

圖 2 薄層色譜法分離結(jié)果Fig.2 Thin layer chromatography separation results

圖 3 金黃色葡萄球菌Fig.3 Staphylococcus aureus

圖 4 大腸桿菌Fig.4 Escherichia coli

圖 5 金黃色葡萄球菌Fig.5 Staphylococcus aureus

圖 6 大腸桿菌Fig.6 Escherichia coli

圖 7 金黃色葡萄球菌Fig.7 Staphylococcus aureus

圖 8 大腸桿菌Fig.8 Escherichia coli

圖 9 金黃色葡萄球菌Fig.9 Staphylococcus aureus

圖 10 大腸桿菌Fig.10 Escherichia coli

圖 11 金黃色葡萄球菌Fig.11 Staphylococcus aureus

圖 12 大腸桿菌Fig.12 Escherichia coli

圖 13 金黃色葡萄球菌Fig.13 Staphylococcus aureus

圖 14 大腸桿菌Fig.14 Escherichia coli

2.3 乙酸乙酯、正丁醇和8800%%乙醇提取液抑菌活性物質(zhì)對(duì)比 由圖15和表2可看出，乙酸乙酯和正丁醇提取到的抑菌活性物質(zhì)小于80%乙醇提取到的抑菌活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用，說(shuō)明80%乙醇提取液提取到的抑菌活性物質(zhì)能更好地抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

圖 15 三種不同浸提液抑菌作用對(duì)比Fig.15 Comparison of bacteriostatic action of three different extracts

表 1 抑菌活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌性的測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of staphylococcus aureus bacteriostasis by antibacterial active substance

表 2 三種不同浸提液抑菌圈的測(cè)定結(jié)果Table 2 The results of three different kinds of antibacterial rings were obtained

2.4 微量稀釋法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 使用微量稀釋法對(duì)不同提取液的藥物敏感性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示，可看出80%醇提液對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌能力最強(qiáng)，水提液對(duì)其抑菌能力較弱，且80%乙醇提取液對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為250 μg/mL、500 μg/mL提取物。

2.5 提取方法的優(yōu)化 在蟲(chóng)草粉活性物質(zhì)提取工藝中，主要影響因素是乙醇濃度、提取時(shí)間、提取方式和提取溫度。通過(guò)篩選確定提取溶解為80%乙醇。因此，進(jìn)一步對(duì)提取時(shí)間、提取溫度和提取方式進(jìn)行考察，以提取抑菌活性物質(zhì)濃度為指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。提取溫度分別考察了4℃和20℃，結(jié)果顯示4℃條件下提取抑菌圈直徑平均值為12.69 mm，20℃條件下提取抑菌圈直徑平均值為12.52 mm，因此4℃溫度下進(jìn)行提取效果最佳；提取方式分別考察了搖床震蕩提取和靜置提取，結(jié)果顯示靜止條件提取抑菌圈直徑平均值為12.46 mm，震蕩條件提取抑菌圈直徑平均值為12.78 mm，因此震蕩提取的效果更佳；提取時(shí)間分別考察了16 h和24 h，結(jié)果表明16 h就可以達(dá)到最佳提取效果。初步確定最佳的抑菌活性物質(zhì)提取方案為：80%乙醇提取，4℃環(huán)境下震蕩提取16～24 h。

表 3 微量稀釋法藥物敏感性試驗(yàn)Table 3 Drug sensitivity test of microdilution method

表 4 提取條件對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響Table 4 The effect of extraction conditions on the diameter of staphylococcus aureus mm

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，80%乙醇提取到的抑菌活性物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌作用最大，使用報(bào)道中乙酸乙酯和正丁醇提取到的抑菌活性物質(zhì)分別與80%乙醇提取物進(jìn)行對(duì)比，前兩者的抑菌作用均小于80%乙醇提取物。

通過(guò)微量稀釋法試驗(yàn)也得到證明，80%乙醇提取得到的抑菌活性物質(zhì)對(duì)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用均最大。同時(shí)證明使用80%乙醇提取到的抑菌活性物質(zhì)對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果大于革蘭氏陰性菌。通過(guò)提取條件優(yōu)化，初步確定最佳提取條件為：80%乙醇提取，4℃環(huán)境下震蕩提取16～24 h。

本試驗(yàn)從抑菌方面證明，蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中存在多種抑菌活性物質(zhì)，使用無(wú)菌水對(duì)蛹蟲(chóng)草粉進(jìn)行提取，無(wú)法提取到抑菌活性物質(zhì)；但使用不同濃度乙醇對(duì)蛹蟲(chóng)草粉進(jìn)行提取，獲得的抑菌活性成分不同，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有不同的抑菌效果。因此對(duì)蛹蟲(chóng)草粉不同濃度乙醇提取液的應(yīng)用具有廣闊的前景，其抑菌活性物質(zhì)的成分在后續(xù)的研究中會(huì)加以關(guān)注。

現(xiàn)如今，抗生素的濫用情況十分嚴(yán)重，抗生素不僅會(huì)造成環(huán)境的污染，也對(duì)人體有一定的危害作用[13]，一些抗生素已經(jīng)被禁用，亟需研發(fā)純天然、綠色、環(huán)保的抗生素替代品。經(jīng)過(guò)多年的研究，蛹蟲(chóng)草具有消炎、抗菌抗病毒等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，蛹蟲(chóng)草栽培方法簡(jiǎn)單，出草時(shí)間快，成本低，是活性物質(zhì)篩選的較為理想的原料之一。但目前尚未從中提取有效的抗菌活性物質(zhì)，如果能從蛹蟲(chóng)草中提取到天然、綠色、環(huán)保的抑菌物質(zhì)，對(duì)于發(fā)揮蛹蟲(chóng)草的醫(yī)療價(jià)值和更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值作用將具有非凡的意義。

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