郝彥蘭 毛東偉 郭瑞軍 郝秋亞

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠期婦女特有疾病，也是造成孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一，嚴(yán)重威脅母嬰健康[1]，其但病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年來(lái)隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子作為重要的炎癥介質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起著越來(lái)越廣泛的生物學(xué)作用[2]。Sharma等研究表明白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 作為炎癥與內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志與妊娠期高血壓疾病的關(guān)系密切相關(guān)[3-4]，另有研究也發(fā)現(xiàn)IL-8及C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein ，CRP)的表達(dá)水平在子癇前期孕婦中明顯升高[5]。這些研究的發(fā)現(xiàn)為IL-8在胎盤(pán)血管病的炎性應(yīng)答中所起的作用提供了很好的依據(jù)。本研究通過(guò)檢測(cè)白介素-8在子癇前期患者血清及胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況，探討其與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展及疾病的嚴(yán)重程度的關(guān)系。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：選取于2014年10月—2015年12月，在我院產(chǎn)科分娩的子癇前期患者，孕婦年齡約在20～42歲，平均(29.3±3.7)歲。孕周34～40周，平均(37.2±3.2)周。并根據(jù)病情分為子癇前期組(輕度20例、重度40例)，選擇無(wú)并發(fā)癥足月妊娠的孕婦20例為正常妊娠組，孕婦年齡18～36歲，平均(28.15±3.2)歲；孕周37～41周，平均(38.5±1.0)周，各組孕婦年齡以及分娩時(shí)孕周比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有孕婦既往均無(wú)心、肝、腎疾病及高血壓病史，無(wú)其他產(chǎn)科并發(fā)癥，均以社會(huì)因素剖宮產(chǎn)終止妊娠。子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類按照謝幸主編的第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》[6]。

2.標(biāo)本處理和檢測(cè)

(1)標(biāo)本的獲取及儲(chǔ)存：子癇前期組在未治療前及正常妊娠組產(chǎn)前均抽取靜脈血3 mL,靜置30 min，以 3000 r/min離心10 min,分離血清，-80 ℃保存待測(cè)。

(2)血清IL-8檢測(cè)：采用 ELISA法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海博士德生物科技公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

(3)胎盤(pán)取材：分娩后取胎盤(pán)組織1 cm(應(yīng)避免鈣化及出血區(qū))，用生理鹽水沖洗后，用中性甲醛固定48小時(shí)，然后脫水包埋。

(4)胎盤(pán)中IL-8檢測(cè)：取各組組織切片,用免疫組織化學(xué)的方法分別對(duì)IL-8表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 將包埋的石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后進(jìn)行檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)抗原，滴3%H2O2甲醇溶液滅活酶，10%正常山羊血清室溫封閉，滴加1：200稀釋IL-8一抗，37℃溫盒孵育2小時(shí)。PBS洗掉后分別滴加通用型IgG/HRP二抗，37℃溫盒孵育30分鐘，即用DAB顯色，加DAB顯色液，光鏡下觀察3～8分鐘，自來(lái)水沖洗，然后，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗；酒精梯度脫水，二甲苯脫酒精后，封片鏡檢。結(jié)果判定：①按陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占11%～50%為2分；51%～80%為3分；>80%為4分。②按顯色程度評(píng)分：染色弱1分；中等染色2分；強(qiáng)染色3分。將兩種評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合起來(lái)分為3級(jí)：無(wú)論染色強(qiáng)度如何，細(xì)胞陽(yáng)性率<10%為陰性(-)；評(píng)分3～5為弱陽(yáng)性(+)；評(píng)分6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。

結(jié)果

1.各組血清中IL-8水平：結(jié)果提示IL-8在子癇前期重度組的表達(dá)明顯高于正常妊娠組(t=3.48,P<0.01)，而輕度子癇前期組的表達(dá)低于重度子癇前期組(t=2.03 ,P<0.05)，由結(jié)果推測(cè)，子癇前期患者血清中IL-8的濃度明顯升高，且隨著疾病的嚴(yán)重程度增加其含量也增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：P<0.01，CON為正常對(duì)照組，M-PE為子癇前期輕度，S-PE為子癇前期重度圖1 子癇前期患者與正常對(duì)照組血清中IL-8濃度的比較

2.各組胎盤(pán)組織中IL-8的表達(dá)：免疫組化方法檢測(cè)胎盤(pán)組織中IL-8的表達(dá)結(jié)果顯示胎盤(pán)組織中均可見(jiàn)IL-8表達(dá),主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)上皮細(xì)胞，腺上皮，細(xì)胞間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管周?chē)g質(zhì)細(xì)胞中。各組IL-8在胎盤(pán)組織檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(圖中棕色顆粒為IL-8的陽(yáng)性表達(dá))，IL-8在輕度子癇前期患者組及重度子癇前期患者組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80%、87.5%；而在正常對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率僅有35%。兩組患者與正常對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而輕度子癇前期組與重度子癇前期組差異不顯著(P=0.701)，見(jiàn)表1。

表1 各組胎盤(pán)組織切片中IL-8表達(dá)的比較n(%)

注:*與對(duì)照組比，P<0.05

討論

子癇前期是妊娠期特有的疾病之一，占整個(gè)妊娠的3～5%，臨床以血壓升高和蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)，隨著病情的進(jìn)展可引起全身多器官損害、抽搐、腦出血、凝血功能障礙、HELLP綜合癥、昏迷等癥狀，可導(dǎo)致胎兒窘迫、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、羊水過(guò)少、早產(chǎn)等[1]，雖然對(duì)子癇前期的研究不斷增多，但其病因及發(fā)病機(jī)制仍未明確，隨著PE的發(fā)病率逐步升高及對(duì)母嬰越來(lái)越嚴(yán)重的影響，對(duì)于子癇前期的病因及發(fā)病機(jī)制的研究仍是目前探究的難題。

子癇前期的基本病理生理變化是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致全身小血管痙攣、全身器官血流灌注銳減、局部缺血缺氧等病理變化并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[7],而且很多致病因素都與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān)[2]，多數(shù)研究者認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能與母體循環(huán)中的過(guò)度炎癥反應(yīng)和自由基增高及單核細(xì)胞、粒細(xì)胞的激活有關(guān)。隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明血管內(nèi)廣泛的過(guò)度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是子癇前期的病理基礎(chǔ)，而內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥過(guò)程中可以產(chǎn)生多種致炎性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子之間通過(guò)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，共同促進(jìn)炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定損傷。IL-8屬于CXC類趨化因子，與中性粒細(xì)胞上的受體結(jié)合后，通過(guò)Rho和Rac激酶信號(hào)通路增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞收縮，在高血壓的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用[8]。而且國(guó)外有報(bào)道子癇前期孕婦血清中IL-8的表達(dá)增高[5]，提示IL-8的高表達(dá)可能與子癇前期血壓升高有關(guān)。

IL-8是1987年由Yoshimura[9]首次發(fā)現(xiàn)，其基因定位于4號(hào)染色體的q12-21，全長(zhǎng)5191 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成[10]。IL-8在體內(nèi)具有廣泛的生物活性，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，其生物學(xué)功能都是由IL-8受體介導(dǎo)的，IL-8主要趨化調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞及嗜堿性細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞的趨化作用，導(dǎo)致組織細(xì)胞浸潤(rùn)，在免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用，與部分腫瘤和妊娠合并癥(如早產(chǎn)、胎膜早破)的發(fā)生和發(fā)展也密切相關(guān)[11-12]。既往實(shí)驗(yàn)顯示高血壓患者中內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-8增加[13]；也有研究顯示高血壓患者隨著治療，血壓下降時(shí)其血清中IL-8的表達(dá)水平也隨之下降[14]，從而說(shuō)明IL-8在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起著很重要的作用。根據(jù)既往的研究資料[8,13]，IL-8引起血壓升高的機(jī)理可能如下：一方面促進(jìn)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)受體結(jié)合，從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使血壓升高，另一方面可使鈣離子內(nèi)流，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的含量，平滑肌收縮加強(qiáng)，血管阻力增加，血壓升高。有研究指出胎盤(pán)缺血缺氧是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞激活和損傷的主要原因，而缺血缺氧又進(jìn)一步增加炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)，炎性因子表達(dá)增加又進(jìn)一步增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙也可以引起胎盤(pán)缺血缺氧，反復(fù)的惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致疾病的更深一步的發(fā)展[15]。而子癇前期患者顯著的臨床特征為血壓升高，故IL-8可能通過(guò)上述作用使子癇前期患者血壓升高，而血壓升高進(jìn)一步引起炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、局部缺血等反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，引起全身血管痙攣缺血，進(jìn)而出現(xiàn)一系列子癇前期或子癇的臨床癥狀。

Moreno-Eytimio等研究發(fā)現(xiàn)重度子癇前期患者血清中炎性因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)明顯高于輕度子癇前期和血壓正常的孕婦組，且三個(gè)指標(biāo)中IL-8的變化尤為明顯[16]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在子癇前期組患者血清中IL-8的表達(dá)明顯高于健康組患者(P<0.01)，且隨著病情加重其表達(dá)水平也增高，然而在研究CRP、IL-8、IL-6、IL-10等炎癥性因子引起的早產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)中，早產(chǎn)組孕婦血清對(duì)IL-8表達(dá)的比較沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的差異，進(jìn)一步說(shuō)明IL-8在子癇前期患者中的高表達(dá)具有一定的特異性[17]。胎盤(pán)作為母兒物質(zhì)交換的器官，在胎兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，正常情況下，胎盤(pán)中存在大量的細(xì)胞因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、免疫調(diào)節(jié)及炎癥的發(fā)生有重要作用，而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)胎盤(pán)中IL-8的表達(dá)顯示，IL-8在子癇前期輕度和重度孕婦胎盤(pán)中表達(dá)的陽(yáng)性率分別80%、87.5%；而在正常對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率僅有35%，而且隨著胎盤(pán)娩出后孕婦有關(guān)子癇前期的臨床癥狀逐漸消失，因此推測(cè)子癇前期的發(fā)生與子宮和胎兒關(guān)系不大，子癇前期患者的胎盤(pán)可能是炎癥性細(xì)胞因子IL-8的來(lái)源；此外IL-8的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)在子癇前期輕度和重度患者分別為45%和60%，總的來(lái)說(shuō)，IL-8在胎盤(pán)中的表達(dá)與子癇前期嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-8在子癇前期患者中的表達(dá)明顯增高，而且在胎盤(pán)及血清中水平變化有一定相關(guān)性，推測(cè)IL-8在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但具體作用機(jī)制尚未能明確。因此，進(jìn)一步研究IL-8分子基因水平上的作用機(jī)制以及胎盤(pán)在產(chǎn)生IL-8等炎性細(xì)胞因子的過(guò)程中的作用，更好地了解胎盤(pán)產(chǎn)生炎性因子的具體通徑，使IL-8成為子癇前期臨床檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)IL-8的水平及減少其釋放，可能成為預(yù)防和治療子癇前期的新路徑。

(圖2)

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