朱慶文 王婧 張玲莉 卞文君 林孟思 劉江悅 陳小波 周君 顧紅兵

色素失禁癥(incontinentia pigmenti,IP)是一種罕見的X連鎖顯性遺傳皮膚病，發(fā)病率約為1/50000；男性致病基因攜帶者一般胎死宮內(nèi)，因此患兒一般為女性，發(fā)病年齡大多在新生兒期，常伴有典型性皮膚、牙齒、骨骼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及眼部損害等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重的可導(dǎo)致角膜病變、視網(wǎng)膜剝離、癲癇和智力障礙等[1]。IP典型的皮膚損害表型包括四個階段[2]：早期紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)水泡、色素過度沉著和形成皮膚瘢痕。依照2013 年修正后的診斷標(biāo)準(zhǔn)，新生兒期IP臨床診斷主要依據(jù)典型性皮疹等臨床特征和IP疾病家族史。IP致病基因分別被定位在Xp11和Xq28[3,4]，其中80%～90%的IP患者均存在Xq28上的核因子-κB關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因(nuclear factor-κB essential modulator,NEMO)基因外顯子4-10缺失，NEMO基因重排還包括少量的點(diǎn)突變、微重復(fù)和缺失等[5]。本文對1例疑似IP 患兒及其父母進(jìn)行NEMO基因突變檢測和分析，從遺傳學(xué)角度確診該例IP患兒及其致病基因遺傳機(jī)制。

對象與方法

1.對象

研究對象：該例女嬰于2015年7月16日在他院出生，外觀無異常，出生后3h，發(fā)現(xiàn)皮膚出現(xiàn)紅色皮疹，并逐漸增多，少許破潰。體格檢查四肢可見較多紅色斑疹，部分突出皮膚，雙下肢大腿內(nèi)側(cè)近腹股溝處可見多枚小水泡，部分水泡破潰見澄清分泌物(圖1)，眼部暫時無異常發(fā)生，符合IP診斷標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)榛颊叩乃闹败|干因在出生后或出生后不久進(jìn)行性出現(xiàn)紅斑，水皰和線性色素沉著，初步診斷為IP。

家系調(diào)查：父母非近親結(jié)婚，家族無色素失禁癥疾病史。

2.方法

(1)提取外周血DNA：本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬簽署知情同意書后，采集患兒及其父母外周血標(biāo)本，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝，并采集3名無親緣關(guān)系的表型正常個體外周血作為對照。

采用北京天根生化科技公司微量樣品基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，操作方法按說明書要求進(jìn)行，UV-1800PC型紫外分光光度計(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)檢測DNA樣本，A260/A280和A260/A230比值分別控制在1.8～2.0和2.0～2.5之間。

(2)NEMO基因重排檢測：采用Steffann法(圖2a)，即長鏈多重聚合酶鏈反應(yīng)(multiplex polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增方法(引物Int3s/L2Rev)檢測NEMO基因/△NEMO假基因是否缺失共有序列NEMO△4-10，上游引物分別為Int3s和Rep3s，Int3s位于內(nèi)含子3，Rep3s分別和Int3s下游311-bp片段及外顯子10下游4033-bp片段匹配，下游引物L(fēng)2Rev位于NEMO基因端粒末端。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳條帶大小分析NEMO基因/△NEMO基因重排情況，PCR擴(kuò)增出現(xiàn)1045-bp條帶表明DNA樣本存在共有序列NEMO△4-10缺失。

若DNA樣本存在共有序列NEMO△4-10缺失則增加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)鑒定NEMO基因是否缺失共有序列NEMO△4-10(圖2，引物In2S/L2Rev)，PCR引物設(shè)計原理如圖2；上游引物 In2S只能匹配NEMO真基因內(nèi)含子序列，下游引物L(fēng)2Rev同時匹配NEMO真基因和△NEMO假基因。PCR擴(kuò)增出現(xiàn)2243-bp條帶表明NEMOZ真基因存在共有序列NEMO△4-10缺失。

設(shè)計引物(表1)分別擴(kuò)增各樣本NEMO基因外顯子1、外顯子2和外顯子3-10片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，相關(guān)PCR引物序列見表1。所用測序儀為ABI 3500，利用Sequence Analysis軟件處理ABI3500產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件，然后利用Mutation Surveyor 4.0軟件分析基因的突變情況，測序結(jié)果與NCBI公布的NEMO基因所有外顯子序列進(jìn)行比對，尋找外顯子突變位點(diǎn)。

經(jīng)優(yōu)化，建立如下PCR反應(yīng)體系。

NEMO基因/△NEMO假基因共有序列NEMO△4-10缺失和驗(yàn)證的PCR反應(yīng)體系(25 μl)：5×GC Buffer 5 μl， dNTP 2 μl，上下游引物各 1 μl，PrimSTAR 0.5 μl，DNA模板2 μl(20 ng)ddH2O 13.5 μl。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性30 s，30個循環(huán)(98 ℃10 s，67 ℃ 20 s，68 ℃ 2 min)，68 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 s。

擴(kuò)增NEMO基因外顯子的PCR反應(yīng)體系(50 μl)：5×Buffer 10 μl，dNTP 4 μl， 上下游引物各2 μl， PrimSTAR 1 μl，DNA模板 2 μl(20ng)，dd H2O 29 μl，反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性30 s，30個循環(huán)(98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 4 min)，68 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 s。

表1 相關(guān)引物序列表

結(jié)果

經(jīng)過家系調(diào)查，該患兒父母非近親結(jié)婚，家族內(nèi)成員無IP患病史，故該例IP患兒是散發(fā)病例。

Steffann方法中，患兒基因組DNA用引物Int3s/L2Rev PCR擴(kuò)增出1045-bp條帶(圖3A)，表明NEMO基因/△NEMO基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失，而患兒父母及正常人樣本均未擴(kuò)增出1045-bp條帶；患兒基因組DNA用NEMO基因上游特異性引物In2S和下游引物L(fēng)2Rev PCR擴(kuò)增出2243-bp的特異性條帶(圖3B)，確定NEMO基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失，患兒父母及正常人樣本均未擴(kuò)增出2243-bp的特異性條帶。

患兒基因組DNA經(jīng)引物NEMO-LPCR-e3-e10F/ NEMO-LPCR-e3-e10R PCR擴(kuò)增出12818-bp條帶(圖3D)，表明該IP患兒NEMO基因外顯子4-10是單拷貝缺失；經(jīng)外顯子Sanger測序，該患兒另一拷貝NEMO基因外顯子未發(fā)現(xiàn)任何點(diǎn)突變、微缺失或者微重復(fù)，患兒父母也未發(fā)現(xiàn)NEMO基因外顯子的任何突變，外顯子Sanger測序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該IP患兒的NEMO基因外顯子4-10雜合性缺失是散發(fā)突變，并不是遺傳自父母。

討論

IP又稱Bloch-Sulzberger綜合征，是一種累及多系統(tǒng)，以皮膚損害為主，伴有眼、牙齒、骨骼及中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的、罕見的X染色體連鎖顯性遺傳病。Smahi在2000年第一次驗(yàn)證了NEMO基因突變導(dǎo)致NF-κB的功能受損，影響免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等，最終導(dǎo)致IP發(fā)病；該研究還指出80 %～90 %的IP患者均存在Xq28上的NEMO基因外顯子4-10缺失。NEMO基因大小為23-kb，由10個外顯子組成，第一個外顯子包含3個非編碼可變外顯子[6]。

NEMO基因序列在X染色體上有兩個拷貝，分別為NEMO基因和ΔNEMO假基因。ΔNEMO假基因只包含外顯子3-10，重復(fù)序列始于外顯子3上游282-bp，止于外顯子10下游9.9-kb，外顯子排列的順序與真基因相反。真假基因均具有共有序列NEMO△4-10，共有序列缺失片段位于3號外顯子3′端到10號外顯子區(qū)域的一段MER67B 重復(fù)序列處，大約有1045-bp[7]，該缺失片段既可發(fā)生在NEMO基因內(nèi)也可發(fā)生在ΔNEMO假基因內(nèi)。

該例患兒沒有IP家族史，為了確診其遺傳學(xué)原因，根據(jù)Steffann方法[8]設(shè)計引物：引物Rep3s/L2Rev擴(kuò)增出733-bp條帶，作為內(nèi)參，以檢測PCR體系和條件是否最優(yōu)化；引物Int3s/L2Rev PCR擴(kuò)增出1045-bp的條帶，表明NEMO基因/△NEMO假基因存在共有序列NEMO△4-10片段缺失；該方案不能判斷NEMO真基因是否發(fā)生共有序列NEMOΔ4-10 缺失。因而，本研究后續(xù)采用上游引物In2S和下游引物L(fēng)2Rev，引物In2S特異性結(jié)合NEMO真基因，擴(kuò)增出2243-bp條帶即表明NEMO真基因存在共有序列缺失。為了檢查患兒及家屬是否存在NEMO基因其他基因重排方式，本研究還對患兒及父母NEMO基因所有外顯子進(jìn)行Sanger測序；測序結(jié)果顯示，父母雙方NEMO基因所有外顯子均未檢出任何突變，患兒另外一個拷貝NEMO基因所有外顯子也未檢出任何突變，表明了該例患兒NEMO基因外顯子4-10雜合性缺失，是散發(fā)突變，而非遺傳自父母。此外，對臨床表型輕微或無IP表型的患者，或者未檢出共有序列NEMO△4-10缺失的患者，可以考慮通過測序等方法進(jìn)一步檢測患者是否存在NEMO基因的微小突變。

研究[9]表明了NEMO基因共有序列NEMO△4-10片段缺失是IP患者基因突變的主要方式。本研究雖然只有1例IP患兒，但是經(jīng)過NEMO基因突變篩查和測序驗(yàn)證，證實(shí)了該例IP患兒存在NEMO基因外顯子4-10雜合性缺失，為新生兒IP篩查和確診提供一定的參考價值。

(圖1)

1 Chen AY,Chen K.Dental treatment considerations for a pediatric patient with incontinentia pigmenti (Bloch-Sulzberger syndrome).Eur J Dent,2017,11:264-267.

2 Dangouloff-Ros V,Hadj-Rabia S,Oliveira Santos J,et al.Severe neuroimaging anomalies are usually associated with random X inactivation in leucocytes circulating DNA in X-linked dominant Incontinentia Pigmenti.Mol Genet Metab,2017 Jul 10.pii:S1096-7192(17)30288-3.[Epub ahead of print].

3 Van Asbeck E,Ramalingam A,Dvorak C,et al.Duplication at Xq28 involving IKBKG is associated with progressive macrocephaly,recurrent infections,ectodermal dysplasia,benign tumors,and neuropathy.Clin Dysmorphol,2014,23:77-82.

4 Fusco F,Paciolla M,Napolitano F,et al.Genomic architecture at the Incontinentia Pigmenti locus favours de novo pathological alleles through different mechanisms.Hum Mol Genet,2012,21:1260-1271.

5 Ohnishi H,Kishimoto Y,Taguchi T,et al.Immunodeficiency in Two Female Patients with Incontinentia Pigmenti with Heterozygous NEMO Mutation Diagnosed by LPS Unresponsiveness.J Clin Immunol,2017 Jul 12.[Epub ahead of print].

6 Narayanan MJ,Rangasamy S,Narayanan V.Incontinentia pigmenti (Bloch-Sulzberger syndrome).Handb Clin Neurol,2015,132:271-280.

7 Fusco F,Paciolla M,Pescatore A.Microdeletion/duplication at the Xq28 IP locus causes a de novo IKBKG/NEMO/IKKgamma exon4_10 deletion in families with Incontinentia Pigmenti.Hum Mutat,2009,30:1284-1291.

8 Bal E,Laplantine E,Hamel Y,et al.Lack of interaction between NEMO and SHARPIN impairs linear ubiquitination and NF-κB activation and leads to incontinentia pigmenti.J Allergy Clin Immunol,2017 Feb 27.pii:S0091-6749(17)30321-4.

9 Araki Y,Abe Y,Takeda Y,et al.Incontinentia pigmenti with retinal vascular anomaly and deletion of exons 4-10 in NEMO.J Dermatol,2017,44:976-977.