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1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州 350001

鼠曲草又名佛耳草、清明菜、白艾，系菊科鼠曲草屬植物GnaphaliumaffineD.Don，全草入藥，收載于1977年版《中華人民共和國藥典》一部中[1]。多生于路旁、田邊、山坡草地等處，我國黃河流域以南各省區(qū)均有分布，也見于墨西哥、阿根廷、危地馬拉、玻利維亞等中南美洲國家。據(jù)報(bào)道，鼠曲草全草中含有5%黃酮苷[2]，是鼠曲草主要的活性成分。黃酮類化合物藥理活性豐富，具有抗菌抗氧化[3-7]、改善糖尿病血脂紊亂[8]、止咳祛痰[9]、保肝[10]、鎮(zhèn)痛[11]、抗炎[12-14]，改善氣道炎癥[15]和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥狀[16]的作用，對(duì)高尿酸血癥和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[17]也有一定的治療作用等，在南非國家用鼠曲草來治療呼吸道和腸胃道疾病[18]。

本研究擬采用高效液相色譜技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定鼠曲草中槲皮素、木犀草素和芹菜素的檢測(cè)方法，并將該方法應(yīng)用于鼠曲草不同部位中3種黃酮類化合物的分析檢測(cè)，為鼠曲草總黃酮和黃酮類化合物的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料 鼠曲草購自福建中醫(yī)藥大學(xué)承創(chuàng)堂，蘆丁(≥98%，Rutinhydrate，批號(hào)：100080-201610，中國食品藥品檢定研究院)、槲皮素(≥98%，Quercetin，批號(hào)：C20J6Y1722，上海源葉生物科技有限公司)、木犀草素(≥98%，Luteolin，批號(hào)：C10016987，上海麥克林生化科技有限公司)、芹菜素(≥98%，Apigenin，批號(hào)：K27A6C1，上海源葉生物科技有限公司)。甲醇(色譜純，德國默克公司)、磷酸(分析純，批號(hào)：20160521，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)、乙醇(分析純，批號(hào)：20170311，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、氫氧化鈉(分析純，批號(hào)：1404102，西隴化工股份有限公司)、亞硝酸鈉(分析純，批號(hào)：1608011，上海聯(lián)試化工試劑有限公司)、硝酸鋁(分析純，廠家：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)：20160426)、Na2CO3(分析純，批號(hào)：20130613，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水。

1.2 儀器 Ultimate-3000型高效液相色譜儀(美國戴安公司)、UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津)、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Diamonsil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸(50∶50)；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按槲皮素、木犀草素、芹菜素峰計(jì)，應(yīng)分別不低于5000、6000、7000。色譜圖如圖1所示。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 將槲皮素、木犀草素、芹菜素分別溶解于甲醇中，使其濃度約為10 μg/mL，用紫外-可見分光光度計(jì)在190～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到吸收曲線如圖2所示，因?yàn)榭紤]到同時(shí)檢測(cè)，所以選擇360 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮素6.08 mg于10 mL容量瓶、木犀草素1.47 mg于2 mL容量瓶、芹菜素2.35 mg于5 mL容量瓶，加甲醇溶解，定容置刻度線，得到濃度為0.608 mg/mL槲皮素、0.735 mg/mL木犀草素、0.470 mg/mL芹菜素儲(chǔ)備液，再分別精密吸取1 mL上述儲(chǔ)備液于5 mL容量瓶，加甲醇定容置刻度線，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液作為混合對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備[19]分別稱取5 g花、莖、葉、鼠曲草，按照料液比1∶35加入65%乙醇，超聲波輔助提取兩次(超聲波功率350 W，提取溫度35 ℃)，每次35 min，合并提取液，過濾，濃縮，定容至25 mL容量瓶，搖勻，靜置。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液作為供試品溶液，平行做三份供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定槲皮素、木犀草素、芹菜素，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到3種成分的回歸方程，相關(guān)系數(shù)與線性范圍。見表1。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為0.66%、0.64%、0.94%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于室溫放置 0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰面積的RSD值，結(jié)果槲皮素、木犀草素、芹菜素各組分峰面積的RSD值分別為2.43%、2.87%、2.09%，均小于 3.0%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一樣品5份，按照“2.4”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)得槲皮素、木犀草素、芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.59%、1.13%、1.89%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的鼠曲草樣品2.5 g 共6份，分別置250 mL具塞錐形瓶中，分別加入槲皮素、木犀草素和芹菜素的對(duì)照品溶液適量，按照“2.4”項(xiàng)下的方法處理樣品，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定各待測(cè)成分的量，計(jì)算回收率與RSD值?；厥章试囼?yàn)結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、芹菜素的平均回收率分別為99.18%、100.73%、98.70%，RSD值分別為: 1.92%、2.27%、2.56%。見表2。

2.6 樣品測(cè)定 按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件對(duì)鼠曲草不同部位和全草中的槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量進(jìn)行測(cè)定。色譜圖如圖3所示，其結(jié)果見表3。

表3 鼠曲草中3種黃酮類化合物含量的HPLC法檢測(cè)結(jié)果 /μg/g

注：“□”表示未檢出

3 討論

3.1 色譜條件的確定 將槲皮素、木犀草素、芹菜素配制成混合對(duì)照品，進(jìn)行液相色譜分析，因3種黃酮均含有多個(gè)酚羥基，具有一定的酸性，為保證實(shí)驗(yàn)獲得較好的峰形，采用一定濃度的磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的PH值，改善分離效果。實(shí)驗(yàn)最終以0.2%磷酸溶液作為緩沖劑，可得到較好的色譜峰。實(shí)驗(yàn)以乙腈和磷酸作為流動(dòng)相，但由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，雜峰對(duì)上述3種化合物的峰有干擾且分離度沒有達(dá)到規(guī)定要求，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲醇-水體系較乙腈-水體系更有利于待測(cè)化合物的分離；所以選擇甲醇-0.2%磷酸溶液作為洗脫劑；實(shí)驗(yàn)表明等度洗脫更有利于物質(zhì)的分離，經(jīng)過多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定“2.1”項(xiàng)下所示的色譜條件。該條件既可縮短樣品中槲皮素、木犀草素、芹菜素3種待測(cè)黃酮化合物的分析時(shí)間，又能達(dá)到較好的分離效果。

3.2 不同部位3種黃酮類化合物的含量測(cè)定 從表2和圖3中數(shù)據(jù)可知，用HPLC法同時(shí)測(cè)定鼠曲草全草和花中3種黃酮類化合物，花和鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量均不相同，花中3種黃酮類成分的量均最高，同時(shí)其含量又是木犀草素>槲皮素>芹菜素，莖和葉中未檢測(cè)出這3種成分或量過低沒有達(dá)到檢測(cè)限，從而推測(cè)鼠曲草中槲皮素、木犀草素、芹菜素這3種成分主要分布在花中。

我國鼠曲草資源豐富，分布廣泛，可藥食兩用。鼠曲草中富含黃酮類成分，具有多種藥理活性，是一種極具開發(fā)利用潛質(zhì)的生物資源。但是目前國內(nèi)對(duì)鼠曲草的研究較少，尤其是對(duì)鼠曲草的化學(xué)成分以及定量測(cè)定的研究相對(duì)較少，這是對(duì)鼠曲草利用價(jià)值的極大浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC法分析鼠曲草各部位中3種黃酮類成分的分布情況，方法學(xué)考察表明，所建立的方法線性關(guān)系和重復(fù)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于鼠曲草不同部位槲皮素、木犀草素、芹菜素的定量分析。

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