黃宇何宏勇李軍劉香林梁清甘一波唐第深吳翠蘭潘艷*

（1，廣西玉林市動物疫病預(yù)防控制中心 537000；2，廣西獸醫(yī)研究所 530001；3，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室 530001）

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia Haemolytica）為微溶于血、革蘭氏陰性球桿菌、曼氏桿菌屬的成員。溶血性曼氏桿菌是危害牛羊等反芻動物的病原之一，比其他曼氏桿菌屬成員包含肉芽曼氏桿菌、葡萄糖苷酶曼氏桿菌、反芻獸曼氏桿菌、多源曼氏桿菌的致病性強(qiáng)[1]。國內(nèi)外已有很多研究報道，當(dāng)牛羊感染該菌時經(jīng)濟(jì)損失非常慘重，由于其可引起牛羊肺炎及新生羔羊的敗血癥。現(xiàn)本試驗運(yùn)用細(xì)菌的分離技術(shù)、生化鑒定試驗和16SrRNA序列分析，從黑山羊的肺臟中分離出1株溶血性曼氏桿菌，并進(jìn)行藥物敏感性試驗，旨在為羊病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2017年6月，廣西某黑山羊養(yǎng)殖戶在當(dāng)?shù)刭徺I一批黑山羊，該羊群曾在田間地頭放牧。購買15d后，患病羊開始出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、發(fā)熱等癥狀。該養(yǎng)殖戶給黑山羊使用氟苯尼考等藥物，但不見好轉(zhuǎn)。于是養(yǎng)殖戶將該病死羊送廣西獸醫(yī)研究所就診。該羊體毛粗糙、無光澤，體形偏瘦。剖檢時見胸、腹腔有積水，肝、脾、腎均無肉眼可見病變，肺有出血。

1.2 主要試劑

細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DH5α等均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR儀購自北京天根生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSA）購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離

無菌采取黑山羊肺臟在TSA板進(jìn)行接種，37℃培養(yǎng)24h后挑取單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，再挑取純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4 生化鑒定

將純化的菌落按照常規(guī)方法37℃培養(yǎng)在生化鑒定管中，觀察細(xì)菌的生理生化特性。

1.5 16SrRNA基因擴(kuò)增

用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，其操作步驟按照說明書進(jìn)行。然后以此DNA為模板、細(xì)菌16SrRNA通用型引物[2]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其擴(kuò)增程序為先進(jìn)行95℃5 min；然后進(jìn)行30個循環(huán)95℃30s、52℃40s、 72℃50min； 最后再進(jìn)行72℃10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取7μl的PCR產(chǎn)物在1.5%的凝膠瓊脂糖上進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果。

1.6 序列分析

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆、測序。所得的測序結(jié)果用生物學(xué)軟件MegAlign和Mega 7進(jìn)行分析，并分別作出同源性分析圖和繪制進(jìn)化樹圖。

1.7 gcp基因擴(kuò)增

以細(xì)菌DNA為模板、以gcp基因為目的基因，根據(jù)廣西獸醫(yī)研究所建立檢測溶血性曼氏桿菌的PCR方法進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

1.8 動物致病性試驗

分別將10只健康的昆明鼠隨機(jī)分成2組（試驗組和對照組），試驗組每只小鼠腹腔注射細(xì)菌純培養(yǎng)物0.4ml，另一組每只小鼠注射0.4ml的生理鹽水作為對照組，觀察小鼠的身體狀況，并記錄結(jié)果。

1.9 藥物敏感性試驗

取100μl純培養(yǎng)的細(xì)菌均勻涂在TSA板上，然后貼上藥敏片，再置于37℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果。

2 試驗結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

細(xì)菌在TSA板上生長良好，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性的小桿菌。

2.2 生化鑒定

生化試驗結(jié)果顯示陽性結(jié)果的有葡萄糖、氧化酶、甘露醇、山梨醇、木糖和麥芽糖；陰性結(jié)果有山梨糖、海藻糖、甘露糖和脲酶。這些結(jié)果與陸承平 《獸醫(yī)微生物學(xué)》（第三版）[3]的溶血性曼氏桿菌相符合，初步判斷該分離株為溶血性曼氏桿菌。

2.3 16SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增結(jié)果見圖1，獲得了1500bp條帶大小的目的片段，并命名為MS-1706。

圖1 分離株16SrRNA基因擴(kuò)增電泳圖

2.4 16SrRNA測序結(jié)果分析

將測序結(jié)果與10株溶血性曼氏桿菌參考株進(jìn)行同源性比較，結(jié)果與參考株的同源性為94.5%-100%。在進(jìn)化樹上，分離株MS-1706與參考株NCTC 9380(M75080)、8-3365-5(KLJ051693)等都在同一分支上。說明MS-1706分離株為溶血性曼氏桿菌。

2.5 gcp基因擴(kuò)增

根據(jù)廣西獸醫(yī)研究所建立檢測溶血性曼氏桿菌的PCR方法進(jìn)行檢測該細(xì)菌，擴(kuò)增得到與預(yù)期大小的片段，如圖2。

圖2 分離株gcp基因擴(kuò)增電泳圖

2.6 致病性試驗結(jié)果

試驗組小鼠在注射后6h開始出現(xiàn)行動緩慢，在24h內(nèi)已有80%的小鼠出現(xiàn)死亡。對死亡小鼠進(jìn)行剖解，發(fā)現(xiàn)肺有出血點(diǎn)。同時，從小鼠肺中分離到該菌。

2.7 藥物敏感性試驗結(jié)果

本試驗共用14種藥物做藥物敏感性試驗，結(jié)果分離菌對藥物頭孢噻肟、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星和頭孢曲松呈現(xiàn)出高度敏感；對鏈霉素、慶大霉素、阿莫西林、阿奇霉素和四環(huán)素表現(xiàn)為中敏；對復(fù)方新諾明、多粘菌素B、卡那霉素、青霉素G和氨芐西林表現(xiàn)為耐藥。

3 討論

溶血性曼氏桿菌大多數(shù)是從肺臟中分離的，少部分從鼻拭子中分離。本研究從廣西某養(yǎng)殖戶病死黑山羊的肺臟中分離出一株菌。通過傳統(tǒng)的方法包含細(xì)菌的形態(tài)特征鑒定技術(shù)、生理生化特性初步鑒定該菌為溶血性曼氏桿菌。再結(jié)合新型技術(shù)PCR的方法對16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析以及應(yīng)用廣西獸醫(yī)研究所建立的溶血性曼氏桿菌的診斷方法進(jìn)行檢測，進(jìn)一步確定該菌（MS-1706）即是溶血性曼氏桿菌。馮旭飛等[4]研究報道表明，傳統(tǒng)方法不僅費(fèi)時費(fèi)力，且該菌的分離率較低，較難分離得到該菌。Shangthalingam等[5]報道在2009～2010年間對溶血性曼氏桿菌進(jìn)行病原學(xué)分離和PCR檢測，結(jié)果病原的分離率僅為3%，而PCR檢測率占77%。因此，在做病原學(xué)診斷時，應(yīng)注意傳統(tǒng)方法和新型方法的結(jié)合。

16SrRNA即16Sribosomal RNA，是原核核糖體30S小亞基的組成部分。16SrRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在與所有細(xì)菌的基因組中。該基因具有高度保守性和特異性，該基因檢測技術(shù)已成為檢測和鑒定病原菌有效手段?；?6SrRNA基因序列核苷酸同源性分析顯示，分離株MS-1706與10株溶血性曼氏桿菌參考株的核苷酸同源性為94.5～100%，顯示較高的同源性。為更進(jìn)一步了解分離株MS-1706的分子特征，本研究對其16SrRNA基因繪制核苷酸進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分析顯示，分離株與溶血性曼氏桿菌參考株出在同一分支，且與溶血性曼氏桿菌參考株NCTC 9380(M75080)、8-3365-5(KLJ051693)的親緣關(guān)系較近。原名為溶血性曼氏桿菌的細(xì)菌是一個復(fù)雜的類群，按生化特性可分為A生物型和T生物型，現(xiàn)將A生物型劃分為溶血性曼氏桿菌。據(jù)Lee[6]報道，A生物型含有g(shù)cp基因，而T生物型沒有此基因，通過運(yùn)用廣西獸醫(yī)研究所以gcp為靶基因建立的PCR診斷方法擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段。由上述可知，該分離株為溶血性曼氏桿菌。

本研究通過致病性試驗表明該菌具有很強(qiáng)的致病性。溶血性曼氏桿菌具有多種毒力因子，包含白細(xì)胞介素、脂多糖、脂多糖、白細(xì)胞介素等，而該菌是怎樣引起患畜致病的機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。溶血性曼氏桿菌病的發(fā)生已呈全球分布，引起人們廣泛關(guān)注。馬增軍等[7]在河北從病死綿羊的肺臟、心血等臟器分離出5株溶血性曼氏桿菌；李璞君等[8]從四川死亡山羊的肺組織中分離到1株該菌；王羽等[9]運(yùn)用形態(tài)學(xué)鑒定、生化試驗和PCR等方法從江蘇羊肺中分出1株該菌；李雪霞等[10]從云南奴比山羊羊肺中分離出1株溶血性曼氏桿菌。因此，對于該病的治療原則是盡早發(fā)現(xiàn)，及時治療，否則該病易與其他病原菌如多殺巴氏桿菌、化膿性隱秘桿菌、綿羊肺炎支原體等混合感染而加大治療難度。

對于溶血性曼氏桿菌病，應(yīng)用傳統(tǒng)的藥物治療是預(yù)防和治療該病最主要的手段。Lubbers[11]、Katsuda[12]等研究表明，該菌已經(jīng)對氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類等藥物已產(chǎn)生一定程度的耐藥。本次研究表明，分離菌MS-1706對藥物頭孢噻肟、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星和頭孢曲松這4種呈現(xiàn)出高度敏感；對鏈霉素等5種藥物表現(xiàn)為中敏；對復(fù)方新諾明等5種藥物表現(xiàn)為耐藥，說明該菌對藥物出現(xiàn)多重耐藥。關(guān)于該菌產(chǎn)生的耐藥機(jī)制研究的較少，還有待于更進(jìn)一步的研究。綜上所述，臨床上如何選擇有效用藥是治療本病的關(guān)鍵。本研究為羊溶血性曼氏桿菌病的治療提供理論基礎(chǔ)。

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