劉曉俠,尤忠毓,王玉潔,孫世元

我國(guó)是毛絨制品生產(chǎn)、加工、出口大國(guó),毛絨類(lèi)纖維的總加工量居世界第一[1]。羊絨作為重要的毛絨類(lèi)產(chǎn)品之一,其細(xì)度均勻,手感滑糯柔軟而細(xì)膩,拉力強(qiáng)而富有彈性,質(zhì)感、手感、保暖性等明顯優(yōu)于其他毛絨制品,素有“軟黃金”之稱(chēng)[2-3]。一些不法生產(chǎn)廠商為達(dá)到降低成本提高利潤(rùn)的目的,在加工羊絨制品過(guò)程中往往摻入價(jià)值相對(duì)較低的其他纖維,如綿羊絨、改性綿羊毛、拉細(xì)綿羊毛和羊駝絨等,這些摻假行為不僅損害了消費(fèi)者的利益,更影響了我國(guó)毛絨產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

毛絨類(lèi)纖維現(xiàn)有的鑒別方法,主要是根據(jù)GB/T 16988-2013《特種動(dòng)物纖維與綿羊毛混合物含量的測(cè)定》的規(guī)定,使用投影顯微鏡對(duì)山羊絨[4]、兔毛、羊駝毛等絨毛類(lèi)型的各組分纖維含量的測(cè)定。該鑒別方法過(guò)分依賴(lài)于檢測(cè)人員的工作經(jīng)驗(yàn),而對(duì)羊絨、改性綿羊毛和羊駝絨等形態(tài)結(jié)構(gòu)極其相似的纖維,這種方法顯現(xiàn)出其局限性,已不能滿(mǎn)足毛絨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的圖像識(shí)別法[5]、紅外光譜法[6]、實(shí)時(shí)定量PCR法[7]、基因探針?lè)╗8-9]、靶向蛋白質(zhì)組技術(shù)[10]和生物芯片法[11]等雖各有千秋,卻均因各種原因難以推廣。

隨著各種毛絨混紡織物的大量出口,毛絨類(lèi)纖維的成分鑒定工作已成為維護(hù)商家與消費(fèi)者權(quán)益,增加我國(guó)國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力以及打擊假冒劣偽產(chǎn)品的重要一環(huán),也一直是紡織檢測(cè)行業(yè)具有挑戰(zhàn)性的課題之一,已成為業(yè)界亟待解決的問(wèn)題。

本研究旨在利用基因擴(kuò)增技術(shù),對(duì)毛絨制品實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地定性鑒定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

標(biāo)準(zhǔn)參考材料:從內(nèi)蒙古收集來(lái)的純羊絨,以及上海第一紡織有限公司生產(chǎn)的細(xì)羊毛、羊駝絨。一般沒(méi)有市售的參考纖維混合物,纖維混紡是由兩種或三種不同的參考材料(羊絨/羊毛/羊駝)定量混合制備(表1和表2),這些參考混合物通過(guò)顯微鏡檢查進(jìn)行了分析。

試劑:Bio miga試劑盒;儀器:PCR擴(kuò)增儀(5331型,Ger many),冷凍干燥器(6870 SPEX Sa mplePrep Freezer/Mill?,USA)。

1.2 毛絨制品線粒體DNA的提取與擴(kuò)增

研究和開(kāi)發(fā)動(dòng)物纖維的DNA檢測(cè),關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)在于DNA的提取[3,12]。特別是經(jīng)過(guò)染色、整理等加工處理的毛絨制品,更難獲得高質(zhì)量的可用于進(jìn)一步分析的DNA片段,而PCR技術(shù)只需微量的DNA樣品,就能很好地解決上述問(wèn)題,因此基于線粒體DNA片段的PCR技術(shù)是一種理想的選擇。

纖維在冷凍干燥器用液氮研磨加工成細(xì)小的顆粒。研磨時(shí)注意以下條件:先預(yù)冷5 min,然后以10次/s的速率運(yùn)行,1 min內(nèi)運(yùn)行2個(gè)循環(huán),再冷卻1 min。選用Bio miga試劑盒,按說(shuō)明書(shū)步驟稍作改進(jìn),將粉碎的毛絨制品進(jìn)行蛋白酶、DTT預(yù)處理→高效裂解→柱分離→獲取線粒體DNA等步驟,分別提取羊絨、羊毛,羊駝的線粒體 DNA,并以此為模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,35℃復(fù)性45 s,72℃延伸30 min,經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)后,最后72℃延伸10 min。

表1 試驗(yàn)用毛絨織物

表2 試驗(yàn)用混紡毛絨織物

2 結(jié)果與討論

2.1 引物的設(shè)計(jì)

從Genbank中分別搜索山羊、綿毛和羊駝的Cytb基因,利用Vector NIT軟件中align程序進(jìn)行序列比對(duì),利用比對(duì)的非同源性序列設(shè)計(jì)特異性引物,并確保擴(kuò)增的羊毛、羊絨及羊駝絨的Cytb基因片段長(zhǎng)度不同,設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表3。

表3 不同來(lái)源的Cytb基因片段的引物序列

Cytb基因是編碼線粒體內(nèi)膜細(xì)胞色素b氧化酶基因的一個(gè)亞基,參與氧化磷酸化合成ATP過(guò)程。Cytb基因核苷酸序列總長(zhǎng)為1 140 bp,編碼379個(gè)氨基酸。Cytb基因進(jìn)化速度適中,易用一些通用引物對(duì)所檢測(cè)的物種進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序,較小的一段基因片段包括了科間、屬間、種間乃至種內(nèi)的遺傳信息,適合于分析種間或者屬間的差異被認(rèn)為是解決系統(tǒng)分類(lèi)和進(jìn)化問(wèn)題最可信的遺傳標(biāo)記之一[13],已被廣泛應(yīng)用到動(dòng)物的分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析和起源與進(jìn)化的研究中。

利用以上引物序列分別對(duì)山羊、綿羊及羊駝的線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小不同,可分別鑒別出羊絨、羊毛和羊駝絨。

2.2 羊毛、羊絨及羊駝絨的定性

從理論上分析,如果樣品中僅存在羊絨、羊毛或羊駝纖維,那么用相應(yīng)的引物可以擴(kuò)增出目的條帶,但用其他引物則無(wú)擴(kuò)增結(jié)果。

分別采用羊毛、羊絨及羊駝引物進(jìn)行擴(kuò)增相應(yīng)的毛絨,擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1至圖3。

圖1 羊絨樣品的的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 羊毛樣品的的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 羊駝絨樣品的擴(kuò)增結(jié)果

從圖1、圖2和圖3可知,分別利用羊毛、羊絨和羊駝的Cytb基因片段設(shè)計(jì)的特異性引物,使不同來(lái)源的Cytb基因片段均得到特異性擴(kuò)增。

2.3 羊絨/羊毛混合物的DNA檢測(cè)靈敏度

當(dāng)樣品中羊絨、羊毛及羊駝絨纖維的含量分別為0.5%、1%、5%、10%、20%。利用相應(yīng)的Cyt b引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 Cyt b基因片段的擴(kuò)增結(jié)果

由圖4可知,當(dāng)混合樣品中羊絨比例、羊毛比例或羊駝絨的比例≥0.5%時(shí),利用設(shè)計(jì)的特異性引物,PCR擴(kuò)增技術(shù)均能準(zhǔn)確定性。

2.4 羊絨、羊毛、羊駝混合物定性

理論上分析,如果樣品中同時(shí)存在羊絨、羊毛和羊駝絨纖維,利用設(shè)計(jì)的特異性引物,可以同時(shí)擴(kuò)展出三條長(zhǎng)度不同的條帶,只有當(dāng)羊絨、羊毛或羊駝絨的含量很低時(shí)才有可能導(dǎo)致相應(yīng)條帶的不顯著。

將羊絨,羊毛和羊駝絨纖維按不同比例混合(見(jiàn)表2),采用表3中的引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同來(lái)源的Cytb基因片段的擴(kuò)增結(jié)果

從圖5中可以看出,混合樣品中同時(shí)檢測(cè)多種成分時(shí),羊絨含量?jī)H為0.5%時(shí),就有相應(yīng)的擴(kuò)增條帶,當(dāng)混和樣品中羊駝絨的含量≥5%時(shí),有相應(yīng)的擴(kuò)增條帶。

3 結(jié)論

(1)基于不同生物Cytb基因非同源性序列設(shè)計(jì)特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增定性鑒別羊絨、羊毛和羊駝絨,只要某一毛絨的含量≥0.5%,就可利用DNA技術(shù)定性鑒別出羊絨、羊毛或羊駝絨組分的存在。

(2)對(duì)于羊絨、羊毛和羊駝絨的混合物,當(dāng)羊絨含量≥0.5%,羊駝絨含量≥5% 時(shí),PCR擴(kuò)增技術(shù)定性可同時(shí)鑒別羊絨、羊毛及羊駝絨纖維,避免了人為因素的影響,檢測(cè)準(zhǔn)確性、靈敏度極高,對(duì)解決貿(mào)易糾紛,尤其是國(guó)際性貿(mào)易爭(zhēng)端可以發(fā)揮重要作用。

(3)分別針對(duì)羊絨、羊毛及羊駝絨纖維Cytb基因設(shè)計(jì)特異性引物的擴(kuò)增技術(shù),有效提高了羊絨檢測(cè)的靈敏度,為PCR技術(shù)在毛絨制品方面的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為基于PCR技術(shù)的羊絨、羊毛及羊駝絨纖維定性檢測(cè)研究提供了有力的技術(shù)保障。

[1] 高 泉,丁 楠,楊素英,等.淺談毛絨制品質(zhì)量安全狀況[J].中國(guó)纖檢,2013,(14):29-30.

[2] 孫 梅,沈淦清,王柏華,等.羊絨形態(tài)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性[J].紡織學(xué)報(bào),2016,37(6):18-21.

[3] 張小莉,池海濤,張經(jīng)華,等.羊絨和羊毛纖維檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].毛紡科技,2009,(3):56-59.

[4] 楊素英,高 泉,丁 楠.山羊絨平均直徑測(cè)量(投影顯微鏡法)根數(shù)之探討[J].中國(guó)纖檢,2011,(1):52-54.

[5] 陳 勇,溫演慶,朱譜新.計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)應(yīng)用于紡織檢測(cè)[J].紡織科技進(jìn)展,2007,(6):7-10.

[6] 王彩虹,吳雄英,丁雪梅.基于支持向量機(jī)的近紅外光譜羊毛混紡面料的無(wú)損鑒別技術(shù)[J].毛紡科技,2016,44(4):1-5.

[7] JI W,BAI L,JI M,et al.A method f or quantif ying mixed goat cash mere and sheep wool[J].Forensic Science Inter national,2011,208:139-14.

[8] HA MLYN P F,NELSON G,MCCART HY B J.Wool fiber identification by means of novel species specific DNA probes[J].Jour nal of Textile Institute,1992,83(1):97-103.

[9] NELSON G,HA MLYN P F,HOLDEN L.A species-specific DNA probe for goat fibre identification[J].Textile Research Jour nal,1992,62(3):590-595.

[10]楊阿芳,李珊珊,張 勇,等.基于發(fā)展靶向蛋白質(zhì)組技術(shù)的羊絨纖維組成鑒定及含量分析[J].中國(guó)科技論文,2016,11(6):663-669.

[11]林志武.用生物芯片法快速鑒別羊絨羊毛的展望[J].毛紡科技,2008,(4):28-29.

[12]邵碧英,林志武,陳文炳,等.快速、高效的羊絨羊毛織品DNA提取方法的建立[J].生物技術(shù),2009,19(5):38-39.

[13]ZARDOYA R,MEYER A.Phylogenetic perfor mance of mitochondrial protein-coding genes in resolving relationships a mong vertebrates[J].Molecular Biology and Evolution,1996,13(1):933-942.