張鮮姣, 呂穎穎, 朱紅惠

廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室; 廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室; 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室, 廣州 510070

粘細菌是革蘭氏陰性菌,隸屬于δ 變形菌綱，廣泛分布于各類環(huán)境中[1]。根據(jù)食性，可將其分為嗜細菌和嗜纖維兩種類型?，F(xiàn)分離到的粘細菌大部分屬于嗜細菌型。粘細菌的生活史較為復(fù)雜，在營養(yǎng)缺乏的條件下，粘細菌營養(yǎng)細胞可聚集形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的子實體[2]。粘細菌因其復(fù)雜的生活史及能夠產(chǎn)生豐富多樣的活性次級代謝產(chǎn)物而備受關(guān)注[3]。目前，從粘細菌中已分離到大量具有抗細菌、抗真菌和抗腫瘤作用的活性物質(zhì)[4～8]。隨著抗生素的濫用和細菌耐藥性日益嚴重，亟需從自然界發(fā)掘微生物源天然新藥物。在過去的幾年時間里，研究者從新的粘細菌種屬中發(fā)現(xiàn)了大量的新活性物質(zhì)[6,8～14]。因此，粘細菌已成為天然藥物開發(fā)的重要來源，即粘細菌是繼芽孢菌、放線菌之后，又一藥源微生物新類群。

目前，自然環(huán)境中99%以上的微生物是在現(xiàn)有技術(shù)條件下尚未獲得培養(yǎng)的，被稱為不可培養(yǎng)微生物(viable but nonculturable,VBNC)[15,16]。近年來，研究者在改進微生物培養(yǎng)方法、開發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)方面開展了大量的研究，使以往被認為是不可培養(yǎng)的微生物源源不斷地融入到可培養(yǎng)的行列之中，使得真正深入、有效地研究和發(fā)現(xiàn)微生物生理遺傳等生命規(guī)律成為可能，實現(xiàn)微生物資源的開發(fā)和利用。目前，粘細菌的分離純化是一個耗時耗力且漫長的過程，通常分離1株嗜細菌型粘細菌需要1～2個月；而分離1株嗜纖維型粘細菌則需1～2年的時間。正是由于粘細菌難以分離純化，使得其可利用于活性物質(zhì)篩選的菌種資源遠比其他微生物資源(如芽孢桿菌、放線菌等)少。從1892年發(fā)現(xiàn)第1株粘細菌至今的百余年時間里，獲得的可培養(yǎng)的粘細菌非常少；迄今有效描述的粘細菌只有3個亞目、11個科、26個屬、60多個種。查閱近幾年發(fā)表的新物種發(fā)現(xiàn)，新的粘細菌分離于各類環(huán)境中，如土壤、沼澤和海洋[17]等環(huán)境，但以土壤居多[12,13,18,19]。Garcia等[18]研究發(fā)現(xiàn)亞熱帶、熱帶森林中的土壤和腐木是分離粘細菌、發(fā)現(xiàn)新的粘細菌資源的最好來源。如Yamamoto等[20]從日本屋久島森林土樣中分離到粘細菌2個新屬，并命名為Vulgatibacterincomptusgen. nov., sp. nov.和Labilithrixluteolagen. nov., sp. nov.。研究發(fā)現(xiàn)新的粘細菌通常能產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物。而越南是典型的熱帶地區(qū)，擁有豐富的熱帶原始森林，迄今為止，尚無從越南原始森林中分離粘細菌的相關(guān)報道。因此，從熱帶原始森林土壤或腐木中分離粘細菌，極有可能發(fā)掘大量的粘細菌新資源，可能得到功能新穎、遺傳背景多樣、有重要利用價值的粘細菌資源，從而為發(fā)現(xiàn)粘細菌的新活性物質(zhì)和新功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 本研究所用樣品采自于越南潭道國家公園(Tam Dao National Park, TDNP)、菊芳國家公園(Cuc Phuong National Park, CPNP)和吉仙國家公園(Cat Tien National Park, CTNP)。隨機采集土樣樣品16份，采樣深度為0～10 cm。采集樹皮與腐木樣品22份。樣品采集后立即風干，置于4℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基 WCX培養(yǎng)基：CaCl2·2H2O 0.1%，瓊脂1.5%，pH 7.2。滅菌后加入終濃度為50 μg/mL的放線菌酮；將大腸桿菌劃十字交叉線于平板表面。

CNST瓊脂培養(yǎng)基：KNO30.05%，Na2HPO40.025%，MgSO4·7H2O 0.1%， FeCl30.001%，瓊脂1.5%，pH 7.2。滅菌后加入1 mL經(jīng)過濾除菌的微量元素溶液；將滅菌濾紙鋪于平板上。

VY/2培養(yǎng)基：安琪酵母0.5%，CaCl20.1%，瓊脂1.5 %，pH 7.2。滅菌后加入VB12(終濃度為50 μg/mL)。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，酵母粉0.5%，pH 7.2。

CAS培養(yǎng)基：酶解酵素1.0%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1粘細菌分離 用滅菌的藥匙取少量風干土樣置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入含有放線菌酮(終濃度為200 μg/mL)的無菌水中，浸泡16～20 h。對于樹皮樣品，用剪刀剪碎后置于培養(yǎng)皿中，加入含有放線菌酮(終濃度為400 μg/mL)的無菌水中，浸泡20～24 h。將浸泡過的樣品于56℃處理10 min后，點接于WCX培養(yǎng)基和CNST培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)。1周后，在體式鏡下鏡檢觀察，用滅菌的注射器針頭挑取子實體或者菌膜于新鮮的WCX培養(yǎng)基和VY/2培養(yǎng)基；連續(xù)觀察1個月左右。

1.2.2粘細菌純化 通過反復(fù)轉(zhuǎn)接子實體或者菌膜于新鮮的WCX培養(yǎng)基和VY/2培養(yǎng)基上，直至無雜菌生長。再將菌落轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基，30℃ 150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，如果培養(yǎng)基變渾濁，說明有雜菌生長；如果培養(yǎng)基澄清，說明獲得了純化的菌株。并將菌株保藏于30%甘油及CAS培養(yǎng)基中，置于-80℃長期保存。

1.2.3粘細菌鑒定 根據(jù)子實體和菌落的形態(tài)、顏色以及營養(yǎng)細胞和粘孢子的形態(tài)特征，將分離到的菌株進行大致歸類。

用CTAB法提取菌株DNA，采用細菌通用引物(27F和1492R)擴增16S rRNA基因，PCR反應(yīng)體系為(25 μL)：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，引物27F/1492R(10 μmoL)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，交至美吉測序公司測序。將所得序列在Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net)進行對比分析，結(jié)合形態(tài)特征，確定菌株的種屬關(guān)系。

1.2.4越南粘細菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 選取代表性菌株及相近的模式菌株16S rRNA基因序列，采用ClustalX做多序列比對分析，再用MEGA軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，完成越南原始森林可培養(yǎng)粘細菌的多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 越南可培養(yǎng)粘細菌分離純化

從越南16個土樣和22個樹皮、腐木樣品中共分離到70株粘細菌，經(jīng)純化后獲得6個屬的32株，分別是粘球菌屬(Myxococcus)14株、珊瑚球菌屬(Corallococcus)7株、侏囊菌屬(Nanncystis)6株、蜂窩囊菌屬(Melittangium)3株、原囊菌屬(Archangium)1株、軟骨霉狀菌屬(Chondromyces)1株。其中，從土樣中分離到了5個屬的13株粘細菌，分別是粘球菌屬3株、珊瑚球菌屬2株、侏囊菌屬4株、蜂窩囊菌屬3株、原囊菌屬1株；而從樹皮、腐木樣品中分離到了4個屬，分別是粘球菌屬、珊瑚球菌屬、侏囊菌屬、軟骨霉狀菌屬。軟骨霉狀菌是一類較為罕見且難以分離的類群，多生長于腐木及樹皮上。本研究從3個樹皮樣品中觀察到了軟骨霉狀菌花朵狀的子實體結(jié)構(gòu)，僅純化到1株。

從分離培養(yǎng)基上可以觀察到形態(tài)各異、顏色鮮艷的子實體(圖1，彩圖見圖版五)。有單生(圖1A)、球形(圖1B、F)、有聚集成鏈狀或者成堆(圖1C、D、E、G、H、I)；而顏色有黃色、橙色、黃棕色及桔紅色等。根據(jù)子實體的形態(tài)和顏色，大體可以將粘細菌歸類到屬。

圖1 部分粘細菌子實體圖Fig.1 Morphological characteristics of fruiting body of some myxobacteria strains. A：h11x1 珊瑚球菌(Corallococcus sp.)； B：h2x1 粘球菌(Myxococcus sp.)；C：2j2 原囊菌(Archangium sp.)；D：sex2原囊菌(Archangium sp.)；E：sjx2 侏囊菌(Nanncystis sp.)；F：h4x1粘球菌(Myxococcus sp.)；G：sh1珊瑚球菌(Corallococcus sp.)；H：h52l2 蜂窩囊菌(Melittangium sp.)；I：sax3 軟骨霉菌(Chondromyces sp.)。 (彩圖見圖版五)

2.2 越南可培養(yǎng)粘細菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將所獲粘細菌菌株進行16S rDNA基因PCR擴增、測序，所得序列在Ezbiocloud (http://www.ezbiocloud.net) 進行比對分析。并挑選25株代表性菌株及相近菌模式序列進行聚類分析，再采用MAGE的Neighbor-Joining法構(gòu)建進化樹(圖2)。從發(fā)育樹上可發(fā)現(xiàn)，25株粘細菌大體分為5個分支。第Ⅰ分支屬于粘球菌屬(Myxococcus)，第Ⅱ分支屬于珊瑚球菌屬(Corallococcus)，第Ⅲ分支屬于原囊菌屬(Archangium)，第Ⅳ分支屬于蜂窩囊菌屬(Melittangium)，第Ⅴ分支屬于侏囊菌屬(Nannocystis)。從16S rDNA進化樹上看，各菌株在屬的水平上分類地位較為明確。

2.3 軟骨霉狀菌屬子實體形成過程

分離純化時，在3個樹皮樣品中觀察到典型的軟骨霉狀菌的子實體結(jié)構(gòu)(圖3,彩圖見圖版五)，并對子實體的形成進行了連續(xù)觀察。首先在培養(yǎng)基上長出透明的孢子囊柄和橘色透明的孢子囊球，然后孢子囊球長成花朵狀；再在花朵狀的孢子囊上依次長出透明的孢子囊柄和橘色透明的孢子囊球，以此往復(fù)，形成復(fù)雜的子實體團。

圖2 25株粘細菌及模式菌株基因16S rDNA基因NJ進化樹Fig.2 Phylogentic tree of 25 myxobacteria strains and reference strains based on 16S rDNA genes.

圖3 菌株sax3 Chondromyces sp.子實體形成圖Fig.3 The process of fruiting body of strain sax3 (Chondromyces sp.). A:第10天；B：第14天；C：第17天；D：第20天；E、F：第30天。 (彩圖見圖版五)

軟骨霉狀菌純化難度大，挑取時極易沾取到雜菌，且其生長緩慢，通常14 d左右才能形成子實體。經(jīng)過多次挑取，發(fā)現(xiàn)總有雜菌污染。將混合菌劃線于LB平板上，經(jīng)分離，鑒定此雜菌為假單胞菌(Pseudomonassp.)。同時發(fā)現(xiàn)，在有假單胞菌存在時才能觀察到軟骨霉狀菌形成花狀子實體，一旦缺乏則只見輻射狀菌膜(圖4，彩圖見圖版五)?？梢姶司艽龠M軟骨霉狀菌子實體形成。

圖4 軟骨霉狀菌sax3菌落圖Fig.4 Morphological characteristics of colony of Chondromyces sp. strain sax3. A.純的軟骨霉狀菌; B.假單胞菌與軟骨霉狀菌共培養(yǎng)。 (彩圖見圖版五)

3 討論

粘細菌的典型生境是有機質(zhì)豐富、中性或偏堿性(pH 6～8)的環(huán)境，包括土壤、腐基質(zhì)豐富的腐木、樹皮、廄肥和食草動物的糞便。Dawid[1]曾對全球范圍內(nèi)土壤中粘細菌的分布進行了深入研究，他從1 398個樣品中分離了11個屬的20 000個菌株。目前，研究者對粘細菌資源的挖掘多數(shù)來自于各類土壤環(huán)境。隨著大量活性次級代謝產(chǎn)物從海洋菌株中發(fā)現(xiàn)，海洋微生物資源挖掘已成為研究的新熱點，粘細菌也不例外。從海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了大量的耐鹽、嗜鹽以及新的粘細菌資源[17,21～23]。相反，對于粘細菌易生長的腐基質(zhì)豐富的腐木和樹皮樣品分離研究報道極少。李越中等[24]對我國粘細菌資源進行調(diào)查時，采集了腐木及樹皮樣品，進行了分離純化。河北大學劉超等[25]對大連、武漢地區(qū)進行粘細菌資源多樣性研究時，對12份樹皮樣品進行分離，但未純化到粘細菌?？梢妼τ诟尽淦悠范?，粘細菌的分離難度更大。究其原因，主要是此類樣品容易滋生霉菌，且粘細菌子實體易被覆蓋，難以挑取。本研究從22個越南樹皮樣品中分離到4個屬的19株粘細菌，分別是粘球菌屬、珊瑚球菌屬、侏囊菌屬、軟骨霉狀菌屬?？梢?，越南原始森林存在著豐富的粘細菌資源。越南屬于熱帶亞熱帶氣候，全年高溫多雨，森林面積占總面積的50%，動植物資源豐富，可為各類微生物提供豐富營養(yǎng)條件和棲息場所。而粘細菌喜生于有機質(zhì)豐富的環(huán)境，因此熱帶森林的土壤和腐木是分離粘細菌的最好來源之一。本研究從越南原始森林的土壤及腐木、樹皮樣品中分離到多株較為罕見的蜂窩囊菌屬及軟骨霉菌屬的粘細菌菌株，這與越南獨特的地理位置和穩(wěn)定的熱帶優(yōu)越生態(tài)系統(tǒng)密不可分。

而在分離軟骨霉狀菌時，經(jīng)多次純化仍然不純。將混合菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基上，分離到1株假單孢菌。同時發(fā)現(xiàn)，在有假單胞菌存在時軟骨霉狀菌要比其單獨生長時長勢更好?？梢?，此假單胞菌能促進軟骨霉狀菌的生長。郭秋菊等[26]在分離純化軟骨霉狀菌時，曾分離到1株能促進軟骨霉狀菌生長的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)。這說明，環(huán)境中確實存在著能夠促進粘細菌生長發(fā)育的助長菌。由此給粘細菌的分離帶來了新思路，即可以利用助長菌與粘細菌共培養(yǎng)技術(shù)來促進粘細菌快速形成子實體或促使未能被培養(yǎng)的粘細菌形成子實體。而何種菌能促進粘細菌子實體生長以及如何促其生長，則有待進一步的研究。

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