張建霞，張寧，李子涵

(山東中醫(yī)藥大學，濟南　250000)

近年來隨著二胎政策的全面放開，高齡女性生育二胎的要求增加，其面臨的不孕和高流產風險成為國內外學者探討的熱點。卵母細胞的質量是直接影響正常妊娠和造成反復流產的主要因素。人成熟的卵母細胞是人體含有線粒體最多的細胞，內含有超過10萬個線粒體。線粒體在卵母細胞中，不僅是“能量工廠”，也是卵母細胞內除細胞核以外唯一攜帶DNA的細胞器，在促進卵母細胞的成熟、精卵結合和胚胎發(fā)育過程中的轉錄與翻譯提供能量等方面有重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞線粒體與卵母細胞激活、鈣振蕩、凋亡程序啟動等生命過程密切相關[1]。且在哺乳動物的胚胎中，因精子的線粒體在受精的過程中被損壞了，胚胎中的線粒體全部依賴于卵母細胞[2]。針對ART中存在胚胎質量優(yōu)良卻移植失敗的現(xiàn)象和線粒體遺傳疾病，現(xiàn)對卵母細胞線粒體病變在生殖領域的治療進行綜述。

一、卵母細胞線粒體簡介

1.結構和空間分布：線粒體是雙層膜的細胞器，電鏡下由內膜和外膜、基質和嵴構成。不同細胞內的線粒體有不同的結構，卵母細胞線粒體多呈圓形。在卵母細胞成熟過程中，其空間分布可作為評估卵母細胞質量的一項指標。在生發(fā)泡期(germinal vesicle，GV期)，線粒體處于幼稚狀態(tài)，多呈圓形、少嵴，分布在細胞質中；在生發(fā)泡破裂期(germinal vesicle breakdown，GVBD)，線粒體已成熟，聚集于細胞核周圍，呈長梭形，多嵴；第二次減數(shù)分裂(Meiosis，MⅡ)，線粒體沿紡錘體分布，以輔助紡錘體的形成和染色體的分離。

2.線粒體DNA(mtDNA)：人成熟卵母細胞中每個線粒體含有1～2個mtDNA，而mtDNA拷貝數(shù)范圍在3萬～100萬[3]，在卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)與受精、胚胎發(fā)育潛能成正相關[4]。與細胞核DNA相比，mtDNA 因缺乏組蛋白的保護和必要的DNA損傷修復系統(tǒng)[5]，且處于高自由基的環(huán)境中，更容易突變或受損，從而影響受精率和胚胎發(fā)育潛能。因卵母細胞成熟后(MⅡ期)mtDNA停止復制，直至囊胚期才恢復，卵胞漿中的線粒體對胚胎的發(fā)育顯得尤為重要。

3.代謝途徑：哺乳動物的卵母細胞線粒體主要是通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑產生ATP[6]。卵母細胞中，線粒體在限制最低水平活性氧(reactive oxygen species，ROS)的條件下，迅速有效地為細胞“定點”提供能量，低劑量的ROS能調控卵母細胞成熟，若線粒體能量產生過程中釋放過多ROS，卵母細胞處于氧化應激狀態(tài)，會造成mtDNA的氧化損傷、突變和缺失，從而影響卵母細胞成熟與受精。

二、影響卵母細胞線粒體的因素

1.高齡：年齡是導致卵母細胞質量下降的直接因素[7]，主要表現(xiàn)在兩點：卵母細胞的數(shù)量隨著年齡的增長逐漸減少，mtDNA拷貝數(shù)下降、突變和缺失增加；卵母細胞的質量逐漸降低，即卵母細胞老化，分為排卵前老化和排卵后老化。排卵前卵母細胞依靠卵泡壁顆粒細胞和卵丘細胞提供能量，而排卵后卵母細胞自身線粒體開始激活，線粒體嵴增多，通常認為年齡與排卵前老化相關。

2.糖尿病、肥胖：肥胖和糖尿病患者體內卵母細胞處于氧化應激狀態(tài)，李俐琳等[8]用動物實驗研究了肥胖對小鼠卵母細胞體內老化的機制，證實肥胖會促進卵母細胞排卵后老化，其中最主要的原因還是氧自由基對卵母細胞的損傷。肥胖小鼠卵母細胞內線粒體相關內質網(wǎng)膜(MAM)相關蛋白IP3R1和PACS-2的增加也會導致線粒體異常[9]。這表明MAM含量的增多可以成為卵母細胞線粒體異常的一個指標，為肥胖導致的卵母細胞的線粒體損傷提供新的治療靶點。

三、卵母細胞線粒體缺陷引起的疾病

1.反復種植失敗和流產：高齡婦女的抗氧化能力下降，自由基減少，ROS堆積，同時伴隨供能的ATP減少，導致卵母細胞減數(shù)分裂過程中染色體分離障礙，形成非整倍體胚胎，而非整倍體胚胎是反復種植失敗和流產的主要因素。

2.卵巢儲備功能減退(decreased ovarian reserve，DOR)：Slotkin等[10]認為ATP水平低下可激活卵的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號途徑，導致原始卵泡的異常激活、丟失增多，卵泡過早衰竭逐漸發(fā)展為DOR。

3.線粒體遺傳性疾病:線粒體遺傳性疾病是母系家族性疾病，是由于卵母細胞中的mtDNA突變引起[11]，其臨床表現(xiàn)多樣，包括：線粒體腦肌病、線粒體遺傳性糖尿病、胃腸綜合征、肌張力障礙等[12]。

四、卵母細胞線粒體病變在生殖領域的治療現(xiàn)狀

1.卵胞質移植(ooplasmic transfer，OT)：將供體卵母細胞的部分細胞質經顯微操作技術移植到受體卵母細胞內，再對重構卵進行胞質內單精子注射，稱為OT，尤其是年輕供者卵母細胞胞漿中的線粒體對高齡女性受者卵母細胞可能發(fā)揮補充作用。OT技術早已提出并被首次使用在大齡不孕不育患者中，且獲得了成功[13]。但有研究顯示外源性線粒體雖然對受體卵胞質有一定活性和功能，但有功能的卵胞質被引入的同時也會造成受精卵的異質性[14]，造成極大潛在安全隱患。最近，一項隨訪研究報道，年齡在13至18歲的OT出生兒童身體大致健康，基本認知能力正常，但有的小孩會伴有輕微的皮膚問題、輕微視覺障礙、輕度哮喘和慢性偏頭痛[15]。該項研究顯示大量捐贈者卵胞質移植入受體卵母細胞，可能不是最可行的方法。

2.線粒體替代療法[16](mitochondrial replacement therapy，MRT)：用外源性健康的線粒體補充或替代發(fā)育阻滯的卵母細胞或受精卵中的異常線粒體。(1)原核移植(pronuclear transfer，PNT)：是先使攜帶異常線粒體的卵母細胞受精，然后將受精卵的細胞核移植到捐贈者去核的卵細胞內，再植入攜帶異常線粒體的母體內。2010年首次報道了PNT，此移植后的胚胎中3%～8%可發(fā)育到卵裂期，且遺留少量受體卵母細胞的mtDNA，其安全性和有效性還無法得到保證[17]。2016年Hyslop等[18]在該PNT的基礎上進行了改進，在卵母細胞減數(shù)分裂完成后立刻(ICSI后8 h內，早期PNT)進行PNT，而不是在受精卵第一次有絲分裂前(ICSI后16 h，晚期PNT)進行PNT。改進后，遺留的mtDNA比絕大多數(shù)卵裂期的PNT減少至2%，此方法降低了線粒體遺傳病的發(fā)生。(2)紡錘體移植(spindle transfer，ST)：是將母親和捐獻者卵母細胞中MⅡ期細胞核先移走，再將母親卵細胞的核注入捐獻者卵細胞中，用獲得的新卵母細胞與精子受精。紐約新希望生殖中心Zhang等[19]在2016年9月首次利用ST將捐獻者的卵母細胞線粒體取代攜帶Leigh syndrome變異基因的卵母細胞線粒體，幫助一對夫妻順利生產出健康男嬰?？茖W家們對該男嬰的線粒體進行了檢測，結果顯示含有變異基因的線粒體不到1%，該比例不會造成任何健康問題。他們還會繼續(xù)對該男嬰跟蹤檢測，以確保保持該比例。該技術減少了mtDNA的突變量，但因該方法首次使用且考慮mtDNA的異質性漂移，持續(xù)追蹤該男孩的健康狀況很有意義。

3.自體生殖細胞線粒體移植(autologous germiline mitochondrial energy transfer，AUGMENT)：自體生殖細胞包括卵母干細胞(oogonial stem cells，OSCs)和成熟卵母細胞。據(jù)報道[20]人類的OSCs需要通過皮質活檢從卵巢中分離出來，再通過差異離心的方法離心出卵母干細胞的線粒體，再結合ICSI技術把線粒體注入卵母細胞來改善卵母細胞的質量，可解決卵胞質移植出現(xiàn)的細胞異質性問題，但是否通過了遺傳瓶頸且適合下一代目前未得到證明[21]。通過自體卵母細胞線粒體移植使有缺陷卵母細胞恢復高質量的線粒體，已經應用于少數(shù)不孕不育夫婦[22]。相比于OSCs，利用IVF、未成熟卵體外培養(yǎng)成熟(IVM)和原始卵泡體外激活術(IVA)剩余的成熟卵母細胞更簡單易獲取，且通過了線粒體基因瓶頸[23]，有望移植后改善卵母細胞線粒體的質量。

4.自體間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)線粒體卵母細胞移植：MSC是來源于中胚層的一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞[24]，廣泛存在于全身結締組織和器官間質中。它不僅能夠向多種組織和細胞分化，而且易于分離、培養(yǎng)、擴增，易于外源基因的導入和表達，在體外長期培養(yǎng)時能始終保持多向分化的潛能。與成體細胞線粒體相比，干細胞線粒體具有球形、嵴數(shù)目少、ATP通過糖酵解轉化等與卵母細胞線粒體相似的特征[25]。據(jù)此姚元慶[26]在2017年“上海市中西醫(yī)結合學會生殖醫(yī)學專業(yè)委員會”上分享了新的研究思路和臨床策略，將自體脂肪組織MSC線粒體移植到高齡不孕女性的卵母細胞，來糾正線粒體功能不全，改善ART的臨床結局，已在小鼠身上證實了線粒體注射后，老齡MⅡ卵細胞的mtDNA拷貝數(shù)顯著升高。它的優(yōu)勢在于：采取自體線粒體移植不存在線粒體異質性；其次，避免第三方基因組所帶來的倫理問題；第三，不需要第三方供卵，提高臨床應用的可行性。目前該方法已應用在動物上，證明自體間充質干細胞線粒體移植能夠改善高齡卵母細胞質量，相關在人體上的研究正在后期進行中。

5.口服藥物：(1)西藥：飲食中補充線粒體營養(yǎng)物能有效改善成熟卵母細胞和胚胎線粒體的能量[27]，α-亞麻酸通過增加卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)和降低氧化應激反應提高卵母細胞的發(fā)育潛能。輔酶Q10可保護線粒體不受化學損傷，增加卵母細胞線粒體ATP合成，減少ROS水平，減少非整倍體卵母細胞的產生。有實驗數(shù)據(jù)表明52周鼠齡的ICR鼠，其補充輔酶Q10能明顯增加卵母細胞的數(shù)量和線粒體活性，是提高質量受損的卵母細胞線粒體功能的一個途徑[27]。(2)中藥：林飛等[28]提出線粒體在某種意義上反應了中醫(yī)“氣”的作用，即氣的物質屬性可能是線粒體，有共同的物質起源、都是構成生命體的微小物質、都負載著生命現(xiàn)象、功能相似等。邱林等[29]總結出中醫(yī)藥通過對線粒體的保護來影響能量代謝。郭穎等[30]實驗得出：二至天癸顆?？赡芡ㄟ^改善小鼠胚胎線粒體膜電位來提高受精率、卵裂率，從而改善卵母細胞的質量和早期胚胎的發(fā)育潛能。

五、總結

卵母細胞線粒體作為卵母細胞的能量工廠，其結構和功能異常是妊娠失敗的重要因素。隨著科學家對卵母細胞線粒體病變的研究深入，其治療方案逐步接近自然生理狀態(tài)，包括中醫(yī)藥對人的整體改善作用，以期待中西醫(yī)結合來提高卵母細胞線粒體的質量，對輔助生育技術有新的突破。

【參考文獻】

[1]Van Blerkom J. Mitochondrial function in the human oocyte and embryo and their role in developmental competence[J].Mitochondrion，2011，11：797-813.

[2]Luo SM，Ge ZJ，Wang ZW，et al. Unique insights into maternal mitochondrial inheritance in mice[J].Proc Nati Acad Sci U S A，2013，110：13038-13043.

[3]Van Blerkom J. Mitochondria as regulatory forces in oocytes，preimplantation embryos and stem cells[J/OL].Reprod Biomed Online，2008，16：553-569.

[4]Ge H，Tollner TL，Hu Z，et al. The importance of mitochondrial metabolic activity and mitochondrial DNA replication during oocyte maturation in vitro on oocyte quality and subsequent embryo developmental competence[J].Mol Reprod Dev，2012，79：392-401.

[5]Fu X，Cheng J，Hou Y，et al. The association between the oocyte pool and aneuploidy：a comparative study of the reproductive potential of young and aged mice[J].J Assist Reprod Genet，2014，31：323-331.

[6]王元芬，郝建秀，王輝，等.線粒體功能在卵母細胞成熟中的作用綜述[J].解放軍醫(yī)學院學報，2017，38：987-989.

[7]楊華，劉鋒，盧克煥.年齡、線粒體與女性生殖能力的關系[J].武警醫(yī)學，2008，19：272-274.

[8]李俐琳，任姿，曾海濤，等. 肥胖引起的線粒體功能及抗氧化異常促進小鼠卵母細胞排卵后老化[J].中國病理生理雜志，2012，28：1841-1846.

[9]趙麗紅. 食源肥胖鼠卵母細胞線粒體相關內質網(wǎng)膜結構功能的研究[D]. 北京：中國農業(yè)大學，2017.

[10]Slotkin EK，Patwardhan PP，Vasudeva SD，et al. MLN0128，an ATP-Competitive mTOR Kinase Inhibitor，with Potent In vitro and In vivo Antitumor Activity as Potential Therapy for Bone and Soft-Tissue Sarcoma[J].Mol Cancer Ther，2015，14：395-406.

[11]Chinnery PF，Turnbull DM. Epidemiology and treatment of mitochondrial disorders[J].Am J Med Genet，2001，106：94-101.

[12]Chinnery PF，Elliott HR，Hudson G，et al. Epigenetics，epidemiology and mitochondrial DNA diseases[J].Int J Epidemiol，2012，41：177-187.

[13]Cohen J，Scott R，Schimmel T，et al. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs[J].Lancet，1997，350：186-187.

[14]St John JC. Ooplasm donation in humans：the need to investigate the transmission of mitochondrial DNA following cytoplasmic transfer[J].Hum Reprod，2002，17：1954-1958.

[15]Chen SH，Pascale C，Jackson M，et al. A limited survey-based uncontrolled follow-up study of children born after ooplasmic transplantation in a single center[J/OL].Reprod Biomed Online，2016，33：737-744.

[16]Wolf DP，Mitalipov N，Mitalipov S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine[J].Trends Mol Med，2015，21：68-76.

[17]Craven L，Tuppen HA，Greggains GD，et al. Pronuclear transfer in human embryos to prevent transmission of mitochondrial DNA disease[J].Nature，2010，465：82-85.

[18]Hyslop LA，Blakeley P，Craven L，et al. Towards clinical application of pronuclear transfer to prevent mitochondrial DNA disease[J].Nature，2016，534：383386.

[19]Zhang J，Liu H，Luo S，et al. Live birth derived from oocyte spindle transfer to prevent mitochondrial disease[J/OL].Reprod Biomed Online，2017，34：361-368.

[20]Woods DC，Tilly JL. Autologous germline mitochondrial energy transfer(AUGMENT)in human assisted reproduction[J].Semin Reprod Med，2015，33(6)：410-421.

[21]Gosden RG，Johnson MH. Can oocyte quality be augmented？[J/OL].Reprod Biomed Online，2016，32：551-555.

[22]Oktay K，Baltaci V，Sonmezer M，et al. Oogonial Precursor Cell-Derived Autologous Mitochondria Injection to Improve Outcomes in Women With Multiple IVF Failures Due to Low Oocyte Quality：A Clinical Translation[J].Reprod Sci，2015，22：1612-1617.

[23]Kristensen SG，Pors SE，Andersen CY. Improving oocyte quality by transfer of autologous mitochondria from fully grown oocytes[J].Hum Reprod，2017，32：725-732.

[24]張凱，王毅，邢國勝. 間充質干細胞的生物學特性及多向分化潛能[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12：539-542.

[25]Lonergan T，Bavister B，Brenner C. Mitochondria in stem cells[J].Mitochondrion，2007，7：289-296.

[26]姚元慶.高齡對卵母細胞線粒體的影響及線料體示多植技術的新探索.上海市中西醫(yī)結合學會生殖醫(yī)學專業(yè)委員會資料匯編[C].上海；2017.

[27]Bentov Y，Esfandiari N，Burstein E，et al. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome of infertility treatment in older patients[J].Fertil Steril，2010，93：272-275.

[28]林飛，郭麗麗，王階. 基于線粒體的功能闡釋中醫(yī)“氣”的作用[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2014，34：903-906.

[29]邱林，李美紅，夏洽思，等. 中醫(yī)藥對線粒體保護機制的研究進展[J].湖南中醫(yī)雜志，2017，33：214-215.

[30]郭穎，連方. 二至天癸顆粒對初老小鼠胚胎線粒體膜電位及發(fā)育潛能的影響[J].山東醫(yī)藥，2016，56：43-45.