方治偉，李論

（江漢大學(xué)，湖北武漢430056）

SSR（Simple Sequence Repeats）又稱作微衛(wèi)星序列、簡單重復(fù)序列，是一類廣泛存在于真核及原核生物體內(nèi)的一種具有高多態(tài)性的DNA片段，一般包含一個長度為1～6bp不等的重復(fù)單元，重復(fù)次數(shù)不等。由于SSR的等位基因型眾多，且在基因組上廣泛分布，并且具有分散度高、多態(tài)性良好的特點[1-3]，因此被大量用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、指紋圖分析以及多樣性評價等研究中[4-7]。SSR兩側(cè)區(qū)域相對較為保守，因此可以在側(cè)翼區(qū)域設(shè)計特異性擴增引物，并通過常規(guī)的PCR擴增對其進行檢測，并基于擴增產(chǎn)物對其進行分型。本文總結(jié)了目前的常見分型方法以及分型難點，并對最新的分型技術(shù)進行解析。

1 SSR分型的技術(shù)難點

SSR高度多態(tài)性是DNA復(fù)制過程中DNA聚合酶的滑脫造成的，這種滑脫會造成重復(fù)次數(shù)的增加或減少，從而產(chǎn)生與模板不同長度的擴增子序列[8-9]。SSR長度、重復(fù)次數(shù)以及重復(fù)單元的堿基組成均可影響滑脫的形成，且三堿基重復(fù)單元和四堿基重復(fù)單元的滑脫率低于二堿基重復(fù)單元的滑脫率[10]，這種滑脫現(xiàn)象在體外PCR過程中同樣存在。由于目前所有的SSR分型技術(shù)都是在提取基因組總DNA后采用特異的引物擴增目標SSR位點，然后基于擴增產(chǎn)物做SSR分型，因而DNA聚合酶滑脫的影響無處不在[11-13]。PCR-free文庫可以大幅度減少滑脫的影響。在一次PCR反應(yīng)中，DNA聚合酶即可以滑脫一個重復(fù)單元，也可以滑脫多個重復(fù)單元。因此PCR擴增造成的虛假SSR基因型與模板真實基因型一起形成具有連續(xù)長度差異的PCR產(chǎn)物。若PCR滑脫率過高，則會使真實的基因型僅占PCR總產(chǎn)物的一小部分，從而無法準確鑒定目標SSR的真實基因型。目前已有的研究認為，SSR重復(fù)單元的長度、堿基組成、DNA聚合酶的保真性以及PCR反應(yīng)體系中的離子濃度均可影響滑脫的嚴重程度[14]。

2 傳統(tǒng)的SSR分型技術(shù)

早期的SSR分型技術(shù)多是基于凝膠電泳開展，包括瓊脂糖電泳[15]、聚丙烯酰胺凝膠電泳以及毛細管電泳[16]，這些方法通過檢測PCR產(chǎn)物的大小來確定目標SSR位點的長度信息。這些方法的優(yōu)點是操作簡單、便捷，對實驗儀器和實驗操作的要求低。理論上，聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳可以給出相對具體的SSR位點的長度信息，且誤差較小，分型的準確性相對很高，因而是目前廣泛采用的分型方法，如小麥、玉米、大豆等基因組上SSR標記位點的開發(fā)等[17-19]?；陔娪镜姆椒ǚ中蜁r有兩個問題無法避免：（1）凝膠電泳的方法無法獲得絕對的長度信息；（2）由于凝膠電泳的分辨率較低，因而當同一個SSR位點在兩個樣品間的差異較小時（如僅差一個2堿基重復(fù)單元），則電泳方法可能無法準確鑒定出該差異。由于無法排除DNA聚合酶滑脫的影響，因此也不能用于雜合位點的SSR分型。

3 基于Sanger測序的方法

作為經(jīng)典的第一代測序方法，Sanger測序是目前所有測序技術(shù)中準確性最高的一種方法，常常被用于高通量測序發(fā)現(xiàn)的變異位點的驗證，被稱作測序的金標準[20]。Sanger法采用邊合成邊測序的方法，通過熒光信號測定DNA上的每個堿基，由于反應(yīng)體系中的每個堿基都是被3’端修飾的，因而在PCR反應(yīng)中一次只能引入一個堿基，因而低復(fù)雜序列的測序準確性依然很高，因而也非常適用于SSR的測序[21]。該方法雖然準確性很高，但通量低、成本高，需要先挑選出單克隆的菌落，且難以進行大規(guī)模的SSR分型。且當滑脫率較高時，測得序列有可能是DNA聚合酶滑脫造成的虛假類型。

4 基于全基因組測序的SSR分型方法

目前二代測序通過對同一個位點的多次覆蓋來保證測序的準確性，目前已知的測序錯誤率僅為1%[22]。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，測序成本不斷下降，測序通量大幅度提高，測序周期大幅度縮短，因而其應(yīng)用范圍不斷拓寬，并被用于基因組水平的SSR鑒定和開發(fā)中。目前，已有多個物種的SSR標記位點被開發(fā)出來，包括大麥、橡膠樹等[23-24]。隨著海量基因組測序數(shù)據(jù)不斷被公布，新的SSR鑒定和分型方法也被開發(fā)出來[10]。Carlson等報道了一種在全基因組水平上鑒定SSR的方法，且可鑒定出復(fù)合SSR位點。Gymrek等開發(fā)了一種基于短reads測序鑒定SSR的方法，該方法還可用于雜合位點的判斷[25]。目前，全基因組測序的方法更多的是用于SSR標記的開發(fā)，以及全基因組水平SNP等變異的分析中，在基于SSR位點開展的樣品間差異分析中報道較少。

5 基于擴增子測序的分型方法

多重PCR技術(shù)的發(fā)展使得一次擴增多個靶位點成為可能。而擴增子測序技術(shù)的發(fā)展使得大規(guī)模高通量的SSR分型成為可能。目前，擴增子測序技術(shù)被大量用于遺傳病篩查、基因診斷等研究中[26-27]。最近，李論等采用多重PCR技術(shù)和擴增子測序技術(shù)相結(jié)合的方法，實現(xiàn)了對8個水稻品種中3000個SSR位點快速準確分型，并開發(fā)出了一套名為AMP-SSR的軟件用于高通量SSR分型的研究[28]。該方法首先在全基因組水平篩選候選的SSR分子標記位點，然后提交到網(wǎng)站做多重PCR引物的設(shè)計和合成。提取基因組總DNA后進行多重PCR的擴增并構(gòu)建測序文庫。采用S5等高通量測序儀完成DNA測序后，結(jié)合生物學(xué)信息分析技術(shù)對每個擴增位點做SSR分型。這一研究大大突破了傳統(tǒng)分型方法的局限，并在單堿基水平上實現(xiàn)了對SSR的大規(guī)模分型，且具有快速，準確，低成本的優(yōu)勢，有望在遺傳多樣性研究，高精準的基因定位以及新品種的分子輔助選育方面廣泛應(yīng)用；同時，在水稻新品種審定、種子執(zhí)法等需要對大量樣品做快速準確篩查的場合中將更具優(yōu)勢。同時該研究還比較了Illumina的MiSeq測序平臺和ptoton的S5測序平臺分型的準確性，證明其有很好的平臺間的擴展性。

6 結(jié)語

SSR分型技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了最初的凝膠電泳、毛細管電泳、一代測序、二代測序以及高通量擴增子測序階段，雖然基于電泳的分型方法依然是SSR分型領(lǐng)域的主流，但新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)將大大提高SSR分型的準確性和速度，擴增子測序技術(shù)以其高通量、高準確性、方便快捷的特點必將成為SSR分型的主流方法，這也將大大促進SSR的理論和應(yīng)用研究。

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