林怡婷 丁羚昱 初 明 王月丹

（北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系 北京 100191）

“自噬”可能是2016年生物醫(yī)學領(lǐng)域最為令人關(guān)注的熱詞之一，因為日本科學家大隅良典憑借發(fā)現(xiàn)自噬過程及其調(diào)控的具體機制而獲得了這一年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

1 自噬現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其研究概況

1963年，比利時生物化學與細胞生物學家de Duve發(fā)現(xiàn)細胞的溶酶體中存在著大量的細胞內(nèi)源性物質(zhì)，甚至還可以從中找到完整的細胞器。根據(jù)這個現(xiàn)象，de Duve推測細胞可能會通過某種機制，將大量的細胞內(nèi)源性物質(zhì)傳輸?shù)饺苊阁w中。進一步的生物化學和顯微形態(tài)學的分析研究表明，在細胞中存在著一種囊泡，專門負責將細胞內(nèi)容物運輸進入溶酶體中進行降解。為此，de Duve首先創(chuàng)造性地將這種現(xiàn)象命名為“auotophagy”（自噬），并將在自噬過程中具有運輸功能的囊泡命名為自噬體?！癆utophagy”一詞來源于古希臘語，就是“自己把自己吃掉”（self-eating）的意 思［1］。 雖然 ，de Duve因為發(fā)現(xiàn)過氧化體和溶酶體等細胞結(jié)構(gòu)，而在1974年與阿爾伯特·克勞德及喬治·帕拉德一起獲得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，但是，長期以來有關(guān)自噬的生理意義及其確切的調(diào)控機制一直都是細胞生物學研究的熱點，相關(guān)的研究成果不斷涌現(xiàn)。

在自噬誘發(fā)與調(diào)控的研究方面，1967年，de Duve和Deter在大鼠正常肝臟細胞中觀察到饑餓狀態(tài)可以促進細胞自噬活動的現(xiàn)象，從而證實了胰高血糖素可以誘導細胞自噬的發(fā)生［2］。之后，人們發(fā)現(xiàn)胰島素［3］及一些代謝或降解產(chǎn)物（例如氨基酸［4］和 3-甲基腺嘌呤［5］等小分子）均可以抑制肝細胞的自噬，而一些細胞內(nèi)的蛋白激酶和磷酸酶參與自噬的調(diào)節(jié)過程［6］，因此證實自噬是一種適應性的代謝與能量再生過程。

在自噬的生理學功能方面，也取得了很多的研究成果。de Duve首先發(fā)現(xiàn)多數(shù)具有生命活動的細胞都可以通過一種非特異性的分離機制，在溶酶體中消化其自身的細胞質(zhì)成分，特別是對細胞器這一類的大體積物質(zhì)，這是細胞清除細胞內(nèi)異常蛋白或細胞器的一種選擇性的蛋白降解機制［1］。此后，通過基于細胞形態(tài)學分析的研究，滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［7］、線粒體［8］和過氧化物酶體［9］等多種細胞器經(jīng)過自噬被吞噬消化清除的現(xiàn)象，均被發(fā)現(xiàn)。而Seglen等則利用放射性探針細胞內(nèi)注射的技術(shù)，在自噬早期和中期，發(fā)現(xiàn)并定義了吞噬泡及自噬內(nèi)涵體等自噬的過程產(chǎn)物［10］。這些研究還進一步證實，在酵母及高等生物的真核細胞中，自噬過程是有選擇性的，可以被線粒體膜電位變化等因素而誘導發(fā)生［11］，參與昆蟲變態(tài)等重要的生理過程［8］，是生物生長發(fā)育所必需的一個關(guān)鍵生命活動環(huán)節(jié)。

1988年，日本科學家 Yoshinori Ohsumi（大隅良典）開始以酵母細胞作為研究自噬現(xiàn)象的細胞模型，聚焦細胞囊泡蛋白與自噬機制的研究。但在研究中，他發(fā)現(xiàn)酵母細胞體積極小，不易于觀察其中囊泡的運輸和變化過程。為解決此問題，Ohsumi設(shè)計、構(gòu)建并培養(yǎng)了具有囊泡降解蛋白缺陷的突變型酵母細胞。1997年，通過誘發(fā)這些酵母細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象和上調(diào)囊泡蛋白表達的研究，Ohsumi發(fā)現(xiàn)了一系列在自噬過程中具有關(guān)鍵作用的基因——自噬相關(guān)基因（autophagy－related gene，Atg）。后來，他還在人類細胞的研究中，證實了ATG在自噬過程也具有十分關(guān)鍵的作用［12］，闡明了自噬在各種生理及病理過程中的作用及其機制，為深入研究自噬的具體機制打下了堅實的基礎(chǔ)，并因此獲得了2016年諾貝爾生理學及醫(yī)學獎。

2 自噬的概念及其分型

自噬現(xiàn)象是從酵母到哺乳動物等真核細胞在進行細胞內(nèi)物質(zhì)代謝時，都具有的一種高度保守性的溶酶體降解途徑。目前，一般普遍認為，自噬是指真核細胞將其細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)和細胞器等成分，通過一定的機制運輸?shù)饺苊阁w中，進行隔離和降解的過程。在正常的生理狀態(tài)下，細胞通過自噬的過程及時清除細胞內(nèi)發(fā)生損傷或衰老失能的細胞器，以及長半衰期的蛋白質(zhì)、在合成或折疊過程中發(fā)生錯誤的蛋白質(zhì)分子等可能影響細胞穩(wěn)態(tài)和生理功能的物質(zhì)，從而保持細胞自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的平衡［13］。

現(xiàn)在的研究結(jié)果表明，細胞的自噬可以根據(jù)發(fā)生的機制和負責運輸?shù)募毎麅?nèi)容物不同，而分為巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）及分子伴侶介導的自噬（chaperon mediated autophagy）3種不同的類型。其中，分子伴侶介導的自噬是指在具有選擇性遞送功能的LAMP2A等分子伴侶的協(xié)助下，底物直接進入到溶酶體中被降解的過程。微自噬則是指溶酶體膜通過自身的變形，直接將胞漿中的底物攝取到溶酶體中進行降解的過程，細胞質(zhì)成分直接被溶酶體內(nèi)陷所吞噬。巨自噬是細胞內(nèi)最常見的一種自噬形式，其發(fā)生的過程可以分為4個階段：①分隔膜的形成，②自噬小體的形成，③自噬體的運輸、融合，④自噬體的降解［14］。其中，只有在巨自噬的過程中，才會有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體形成，從而選擇性或非選擇性地將細胞質(zhì)成分包裹起來并運輸?shù)酵砥趦?nèi)體與溶酶體融合，降解并回收再利用其中的營養(yǎng)物質(zhì)。同時，巨自噬也是細胞內(nèi)最普遍和最具有代表性的細胞物質(zhì)自我降解途徑，通常也被簡稱為“自噬”，作為自噬現(xiàn)象的代表。所以，一般情況下，在不明確說明時，文獻中提到的“自噬”是指巨自噬。

3 自噬的過程及其調(diào)控

自噬的基本過程與自噬的類型有關(guān)，分子伴侶介導的自噬和微自噬的過程相對簡單，在此不再贅述。以下主要以巨自噬作為代表，闡述自噬的過程與調(diào)控。

哺乳動物細胞的自噬往往是由吞噬泡的形成開始的，然后其中的分隔膜通過延伸和閉合，從而包裹一部分細胞質(zhì)形成雙膜的自噬體。當自噬體與內(nèi)體或溶酶體對接和融合，形成自噬內(nèi)涵體或自溶酶體時，即達到自噬體的成熟。此時，自溶酶體內(nèi)的酸性水解酶能破壞和降解自噬體內(nèi)膜及其內(nèi)容物，其產(chǎn)物則會被細胞再次循環(huán)利用。

自噬的功能對細胞來說，具有雙重性：一方面，自噬可以幫助細胞回收生物大分子，應對如營養(yǎng)匱乏、生長因子耗竭、低氧或缺氧等細胞代謝應激；還能幫助細胞清除錯誤折疊的蛋白質(zhì)或有缺陷細胞器，防止異常蛋白的積聚并清除胞內(nèi)的病原體，發(fā)揮監(jiān)控和防御作用。另一方面，自噬的過度活躍則可能會導致細胞的自噬應激，對細胞器造成損傷，促進自噬性細胞死亡（也被稱為Ⅱ型程序型細胞死亡），或通過激活凋亡/壞死通路使細胞死亡。

現(xiàn)在已知的很大部分與自噬相關(guān)的基因來自于大隅良典對酵母細胞的研究，這些基因被命名為自噬相關(guān)基因（Autophagy-related gene，ATG）［15］。在酵母細胞中，與自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)組成了以下幾種復合物：由 ATG1、ATG13、ATG17、ATG29、ATG31等組成的ATG1蛋白復合物；由ATG2和ATG18組成的蛋白復合物，其具有能夠結(jié)合PI（3）P的功能；由ATG12、ATG5、ATG16等組成的蛋白復合物；由 ATG6、ATG14、Vps15、Vps34 等組成的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）蛋白復合物。除此之外，能夠被磷脂酰激醇修飾的ATG8及ATG9在自噬過程中也發(fā)揮了重要的作用［16］。在哺乳動物中起作用的自噬核心復合物有以下幾種，與酵母細胞有一定類似性：ULK復合物——在自噬起始過程中起作用；PI3K復合物——在自噬小體形成過程中發(fā)揮作用；ATG12-ATG5復合物和ATG3-ATG8復合物——2個類似于泛素化連接的復合物。

ULK1/2是自噬發(fā)生過程中處于最上游的調(diào)控基因，主要定位于細胞漿，哺乳動物中的ULK復合物包含 ULK1/2、Atg13、Atg101和 FIP200幾個部分等［17］。在自噬發(fā)生的初期，ULK復合物開始組裝并與自噬雙層膜結(jié)合，這對自噬小體的形成至關(guān)重要。在之后的自噬雙層膜延伸過程中，Atg12-Atg5-Atg16組成的類似于泛素連接的蛋白復合物發(fā)揮了十分重要的作用。首先，Atg12在Atg7的作用下與Atg7形成共價連接。之后，Atg12在Atg10的幫助下，將Atg7取代，形成Atg12-Atg10共價結(jié)合蛋白。最后，在Atg5作用下，Atg12和Atg5形成Atg12-Atg5共價結(jié)合蛋白。由于Atg16本身是二聚體，該蛋白通過與Atg5結(jié)合形成同源的Atg12-Atg5復合物二聚體，并在自噬雙層形成過程中對雙層膜的延伸彎曲起至關(guān)重要的作用。Atg8在哺乳動物中的同源蛋白是LC3，LC3是檢測自噬變化的標志性蛋白，這是由于它在自噬小體雙層膜延伸至自噬小體膜結(jié)構(gòu)閉合的過程中起著關(guān)鍵的作用［18］。在自噬小體形成的過程中，LC3在Atg4B的作用下，第120位的甘氨酸發(fā)生分解使LC3被截短并與Atg7形成共價復合體。隨后，Atg3替換掉Atg7，并在Atg12-Atg5-Atg16復合物的協(xié)助下與磷脂酰激醇（PE）連接，從而形成LC3-PE復合體。LC3-PE定位于自噬小體雙層膜的兩側(cè)，參與自噬小體雙層膜的延伸。除此之外，LC3-PE還能與一些自噬底物的連接分子結(jié)合，將底物包裹至自噬小體內(nèi)，發(fā)揮識別的作用。高等動物細胞內(nèi)主要有 4類PI3K復合物［19］，其中主要在自噬過程中發(fā)揮作用的是第3類PI3K復合物，由催化亞基Vps34和調(diào)節(jié)亞基Vps15組成，能催化磷脂酰肌醇生成 PI（3）P［20］。 Beclin 1蛋白與Vps34結(jié)合的翻譯后修飾能夠調(diào)節(jié)Vps34的活性。在細胞處于營養(yǎng)充足的條件下，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Bcl-2能與Beclin 1結(jié)合并抑制Vps34的活性［21］。Vps34的活性可以受到許多調(diào)節(jié)蛋白作用的調(diào)控，從而影響自噬過程的發(fā)生。

總之，自噬過程的調(diào)節(jié)非常復雜和精細，至今仍然是廣受研究者關(guān)注和不斷進行探索的熱點領(lǐng)域之一，有很多的確切機制，還有待更多的研究進行闡明和揭示。

4 自噬在細胞生理及病理狀態(tài)下的作用及其意義

自噬通過消除受損和衰老的細胞器及長壽命蛋白、合成錯誤或折疊錯誤的蛋白質(zhì)等，維持細胞自穩(wěn)狀態(tài)。這個過程不僅為細胞提供營養(yǎng)，也為細胞提供必不可少的保護和監(jiān)管［13］。

當細胞處于營養(yǎng)匱乏、缺氧、病原體感染、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、嚴重組織損傷等情況下，自噬通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian rapamycin，mTOR）依賴性通路和mTOR非依賴性通路被激活。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）信號通路的效應器，mTOR能整合代謝信號，包括氨基酸和生長因子及氧和能量水平，以協(xié)調(diào)細胞生長、增殖和代謝過程以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。通常情況下，mTOR具有抑制自噬的作用。在細胞處于低能量水平時，5′-AMP活化蛋白激酶 （AMPK）激活，抑制mTORC1活性，通過mTOR依賴的途徑調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生，并通過ULK1的磷酸化直接調(diào)節(jié)自噬，實現(xiàn)對自噬作用的雙重活化。在缺氧情況下，HIF1α轉(zhuǎn)錄因子可激活BNIP3和BNIP3L等多種缺氧反應基因的表達，這些基因也可以增加線粒體自噬的發(fā)生。而BNIP3也能通過抑制mTORC的活性結(jié)合，進一步促進自噬的發(fā)生［22］。

此外，當細胞處于饑餓狀態(tài)下，c-Jun N末端蛋白激酶1（JNK1）可通過磷酸化Bcl-2并以此破壞其與BECN1的相互作用［23］，而誘導自噬的發(fā)生。氧化應激時，死亡相關(guān)蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶（DAPK）活化，可以磷酸化 VPS34導致自噬體形成，以VPS34依賴的方式促進自噬的發(fā)生。

自噬具有維持細胞穩(wěn)態(tài)的功能，也能作為不同壓力下的保護機制，維持細胞的生理功能，它是細胞適應在各種環(huán)境下生存的必要條件。因此，在感染、神經(jīng)退行性疾病、心血管和免疫疾病、糖尿病和惡性腫瘤等疾病狀態(tài)下，自噬都是一種常見的細胞生物學現(xiàn)象，在這些疾病的發(fā)生發(fā)展中，扮演著十分重要的角色。以下以自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系為例，簡要闡述自噬在這些疾病病理生理變化過程中的作用和意義。

自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段發(fā)揮著不同的作用。在腫瘤的發(fā)生階段，自噬主要發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用，主要體現(xiàn)在以下4個方面：①通過線粒體自噬等方式，降解并清除功能紊亂的細胞器?，F(xiàn)在的研究證據(jù)表明，自噬是唯一一種能在細胞內(nèi)運送、在溶酶體內(nèi)降解及清除線粒體這樣大而完整細胞器的機制。當細胞線粒體發(fā)生異常時，膜通透性增加，會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），從而激活自噬并清除受損的線粒體，達到抑制腫瘤細胞發(fā)生的作用。②通過自噬途徑，誘導非凋亡性細胞死亡。例如，干擾自噬基因ATG5的表達，能有效地阻止依托泊苷（etoposide）誘導的 bax-/-和bak-/-小鼠胚胎纖維母細胞（MEFs）的死亡。某些腫瘤細胞由于在凋亡通路上存在著一些特異基因的突變，不能通過凋亡形式引發(fā)程序性細胞死亡，但人們?nèi)匀豢赏ㄟ^誘導其自噬途徑的活化而將其清除。③自噬通過抑制炎癥反應，阻止腫瘤的發(fā)生。壞死細胞能釋放出的核苷酸和組蛋白等內(nèi)介素的成分，這些危險相關(guān)分子模式（DAMPs）信號通過激活Toll樣受體促進炎癥的發(fā)生，并在組織損傷修復和炎癥發(fā)生及持續(xù)過程中發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導的作用。這些炎癥信號如果長期存在，將會導致局部免疫微環(huán)境的紊亂。因此，如果組織損傷不能在一定時間內(nèi)得到修復，腫瘤就有趁虛而入的可能。④細胞通過自噬，維持染色體的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明，Beclin1等位基因的缺失與染色體的增加或缺失有關(guān)。自噬能通過避免或減少染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生而減少或者避免腫瘤細胞的產(chǎn)生。

但是，在一些腫瘤進展的階段，自噬又可能發(fā)揮一定的促進作用，主要包括如下機制：①自噬為腫瘤細胞提供保護，并促進其存活。例如，在一些Ras基因被激活的腫瘤中，例如胰腺癌，腫瘤細胞依賴于自噬上調(diào)的方式存活生長。而缺氧環(huán)境中，非折疊蛋白反應（UPR）能誘導自噬基因MAP1LC3B和ATG的活化，導致自噬，并保護腫瘤細胞在缺氧微環(huán)境中的生存［27］。②自噬抑制腫瘤細胞的凋亡，維持其生存。例如，自噬能通過上調(diào)高級糖化產(chǎn)物受體（AGER）的產(chǎn)生，而減少胰腺癌細胞的凋亡。③自噬增強腫瘤細胞對放療、化療或其他療法的抵抗力和耐受性。化療或放療可以導致腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生大量受損細胞器及異常蛋白質(zhì)等有害成分，從而殺傷腫瘤細胞。但是，此時腫瘤細胞可通過提升自噬的活性而及時清除這些對腫瘤細胞有害的細胞內(nèi)物質(zhì)，并用于提供細胞應急狀態(tài)下所必需的營養(yǎng)物和能量，修復受損的細胞結(jié)構(gòu)與功能，進而保護腫瘤細胞免于發(fā)生凋亡性細胞死亡，以維持腫瘤細胞的持續(xù)增殖。例如，在抗癌藥硼替佐米（Bortezomib）誘導的乳腺癌細胞株MCF-7細胞死亡時，細胞自噬活性的增加使MCF-7細胞對Bortezomib產(chǎn)生更高的耐藥性。

5 自噬研究的未來與展望

隨著大隅良典獲得諾貝爾獎，自噬現(xiàn)象及其機制的研究，再次受到人們的廣泛關(guān)注，僅在我國2016年批準立項的與自噬相關(guān)的科研項目就多達72項，資助總金額高達上千萬元。相信這些研究有助于進一步揭示自噬的發(fā)生機制及其在細胞生命活動中的作用，為延長人類壽命和促進生命健康，發(fā)揮積極的促進作用。