胡龍江 周音頻 曹運(yùn)蘭 呂湛 藍(lán)運(yùn)競 寧琳 向立權(quán) 肖鵬

(1.重慶市涪陵中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 涪陵 408000；2.貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 貴陽 550002；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 南充 637000)

目前，Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成為全球化的流行性疾病，其慢性進(jìn)行性病程及產(chǎn)生的多種急慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。最近流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國T2DM的患病率已達(dá)9.7%，糖尿病前期人群已達(dá)15.5%。因此，闡明T2DM的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的有效防治方法是目前醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題和熱點(diǎn)。最近研究證實(shí)，T2DM的發(fā)生與機(jī)體固有免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，T2DM的免疫防治作為新興治療途徑而備受關(guān)注。NLRP3炎性小體能感受代謝性應(yīng)激信號的刺激，從而導(dǎo)致caspase-1活化及一系列炎性因子的產(chǎn)生，與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而當(dāng)機(jī)體炎性因子如白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)增加時，機(jī)體的抗炎因子如轉(zhuǎn)化生長因子(transfor-ming growth factor-β,TGF-β)亦會發(fā)生變化。本文就以核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-bmding oligomerization domain-like receptor protein3,NLRP3)炎性小體為中心的NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-18/IL-1β-TGF-β信號通路在T2DM發(fā)生發(fā)展過程中的作用進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年3月～2017年3月，在我院健康體檢中心收集健康對照組30例，內(nèi)分泌科收集T2DM組40例，年齡30～80歲，對照組符合肝心腎肺檢查均正常，排除T2DM(診斷依據(jù)為1999年WHO制定的糖尿病診斷分型標(biāo)準(zhǔn))、急性和慢性感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、痛風(fēng)、近期創(chuàng)傷、正在使用抗炎藥物者及其他代謝性疾病，排除家族中有傳染病及遺傳病史者。T2DM組符合患初診T2DM(診斷依據(jù)同上)，未使用降糖、降脂藥物治療者，亦未正規(guī)采用飲食及運(yùn)動療法者,排除1型糖尿病(在30歲以前診斷為糖尿病并使用胰島素治療)、內(nèi)分泌相關(guān)糖尿病及T2DM合并急性并發(fā)癥(如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病乳酸酸中毒)、嚴(yán)重慢性并發(fā)癥(如心肝腎功能不全、急性和慢性感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、痛風(fēng))和近期創(chuàng)傷、正在使用抗炎藥物者以及其他代謝性疾病者。所有操作程序由涪陵中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選對象均對本研究內(nèi)容知曉并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑 Step One Plus 熒光定量PCR測定儀(新加坡ABI公司)，PTC-2000PCR測定儀(美國MJR公司)，Neofuge1600R臺式高速冷凍離心機(jī)(香港力康科技有限公司)，AllegraTM64R高速臺式離心機(jī)(美國BECKMAN公司)，LAS 4000mini 凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)，NANODROP2000超微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司)，電泳裝置(美國Bio-rad公司)，酶標(biāo)儀(美國Emax公司)，HB-100恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(重慶帝凡商貿(mào))；人淋巴細(xì)胞分離液由北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供，PrimeScriptTMRT reagent Kit、RNAiso plus試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒均由Takara公司提供，Anti-NLRP3 antibody、Anti-TMS1 antibody、Anti-Caspase-1 antibody均由abcam公司提供，western及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均由上海碧云天生物有限公司提供，人IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒均由上海廣銳生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基本資料及臨床生化資料采集 收集所有研究對象的性別、年齡、吸煙史、血壓、身高、體重等基本資料，并計(jì)算出平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)、體重指數(shù)(body mass index,BMI)，所有研究對象均隔夜空腹8h以上，次日清晨空腹抽取肘靜脈血20ml，取2ml全血離心獲得血漿后置-80℃冰箱備用。剩余全血應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液，采用Ficoll-Hypaque密度梯度分離法分離出T2DM組和對照組人PBMCs備用，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。在我院檢驗(yàn)科檢測所有入選對象的FPG、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋的膽固醇(Low density liporotein cholesterol, LDLC)、極低密度脂蛋白膽固醇(very low density lipoprotein cholesterol，VLDLC)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)等生化資料。

1.3.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 應(yīng)用RNAiso plus試劑盒提取人PBMCs總RNA，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，采用分光光度儀測定RNA濃度及純度，均符合要求后，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列見表1，由Takara公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.3 RT-qPCR反應(yīng) 應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系按照說明書配制，反應(yīng)條件為95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，50個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，作擴(kuò)增及溶解曲線，每個樣本均設(shè)置3個復(fù)孔，取均值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用Ct值計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量：△△Ct=(CtT2DM組-CtGAPDH)-(Ct對照組-CtGAPDH)，病例組目的基因mRNA的相對表達(dá)量= 2-△△Ct。

1.3.4 Western blot 按照western及IP細(xì)胞裂解液說明書操作提取人PBMCs總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。取40μg蛋白進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳(條件：80V 30min，100V 60min)，裁剪適合寬度的PDVF膜，甲醛浸泡15s，轉(zhuǎn)膜60min，BSA封閉液室溫封閉4h，浸入含蛋白NLRP3(1:100)、ASC(1:1000)，Caspase-1(2.5μg/ml)、內(nèi)參蛋白GAPDH(1:500)的一抗稀釋液中， 4℃孵育過夜，次日TBST緩沖液洗膜5min，5次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:5000)，室溫孵育1h，TBST緩沖液洗膜5min(6次，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白/內(nèi)參蛋白GAPDH。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取均值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3.5 ELISA檢測 采用人IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒，嚴(yán)格參照說明書操作，反應(yīng)終止后，酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值(OD值)，根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度及測定的OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組血漿樣本濃度，每個血漿樣本均設(shè)置2個復(fù)孔，取均值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本情況及血脂、血糖水平變化比較 兩組性別、年齡、吸煙、MAP、TC、LDLC無顯著性差異(均P>0.05)；T2DM組BMI、FPG、HbA1c、TG、VLDLC高于對照組，HDLC低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

Table2Comparisonoftheplasmalevelsofglucose,lipoproteinsandgeneraldata

變量對照組T2DM組性別(男/女)16/1426/14吸煙(是/否)5/256/34年齡(歲)59．40±8．8061．65±8．95BMI(kg/m2)24．24±2．5526．00±2．90①M(fèi)AP(mmHg＂)90．83±11．6494．67±10．80FPG(mmol/L)4．70±0．637．15±2．59①HbA1c(×10-2)5．77±0．366．94±0．70①TG(mmol/L)1．29±0．551．84±1．21①TC(mmol/L)4．27±1．054．12±1．21HDLC(mmol/L)1．24±0．301．09±0．23①LDLC(mmol/L)2．73±0．862．37±0．82VLDLC(mmol/L)0．59±0．250．84±0．55①

注：與對照組比較，①P<0.05

2.2 兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較 T2DM組IL-1β、IL-18、TGF-β高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.3 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平比較 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平在PBMCs中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Table3ComparisonoftheplasmalevelsofIL-1β,IL-18andTGF-βbetweenT2DMgroupandcontrolgroup

變 量對照組T2DM組IL?1β(ng/L)IL?18(ng/L)TGF?β(ng/L)12 53±2 7950 02±10 181538 33±262 1922 86±1 66①144 14±14 20①2131 38±302 10①

注：與對照組比較，①P<0.05

2.4 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1水平比較 T2DM組NLRP3、ASC、Caspase-1 在PBMCs中的表達(dá)均較對照組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

2.5 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA水平與各變量的Spearman相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，NLRP3mRNA在對照組、T2DM組均無相關(guān)性；ASCmRNA在對照組無相關(guān)性，在T2DM組與TC呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.466(P=0.038)；Caspase-1mRNA在對照組與FPG呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.394(P=0.031)，在T2DM組與BMI呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.463(P=0.040)。

圖1 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平比較Figure 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1mRNA in T2DM group and control group注：與對照組比較，①P<0.05

圖2 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1水平比較Figure 2 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 in T2DM group and control group注：與對照組比較，①P<0.05

2.6 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1與各變量的Spearman相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，NLRP3在對照組與性別呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.429(P=0.020)，在T2DM組無相關(guān)性；ASC在對照組與FPG呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.405(P=0.026)，在T2DM組與MAP、FPG、TC、IL-1β、IL-18呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.465(P=0.039)、0.626(P=0.003)、0.564(P=0.010)、0.502(P=0.024)和0.480(P=0.032)；Caspase-1在對照組與MAP、FPG呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.447(P=0.013)、0.396(P=0.030)，在T2DM組與吸煙、FPG、LDLC 、IL-1β呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.546(P=0.013)、0.585(P=0.007)、0.662(P=0.010)和0.624(P=0.003)。

圖3 兩組Western blot檢測結(jié)果

Figure3ResultsofWesternblotinT2DMgroupandcontrolgroup

2.7 IL-1β、IL-18、TGF-β之間Spearman相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，IL-1β在T2DM組與TGF-β呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.564(P=0.010)，3者之間在對照組無相關(guān)性。

3 討論

T2DM是一種由胰島β細(xì)胞受損分泌胰島素減少和胰島素抵抗導(dǎo)致的慢性炎性疾病，但T2DM 發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。近年來，隨著固有免疫研究的迅速進(jìn)展，有關(guān)固有免疫細(xì)胞炎性途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在自身免疫炎癥性疾病中的作用越來越受到關(guān)注。NLRP3炎性小體是由NLRP3、ASC和無活性的caspase-1前體(pro-caspase-1)組成的多蛋白復(fù)合體，是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的一員，是炎性免疫反應(yīng)的重要組成部分，是炎癥-免疫的橋梁。其活化需要NLRP3氨基端熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)，通過PYD-PYD 之間的相互作用結(jié)合ASC，再由ASC 通過CARD-CARD之間相互作用招募無活性的pro-caspase-1，最后炎癥小體生成，并對caspase-1進(jìn)行自身激活，活化后的caspase-1 將對pro-IL-1β、pro-IL-18等底物進(jìn)行切割，以促進(jìn)炎性因子IL-1β 和IL-18 的成熟及分泌[1-3]。

IL-18是活化的單核巨噬細(xì)胞分泌的一種前炎癥因子，在T2DM的發(fā)生發(fā)展過程中起中心介質(zhì)作用，在T2DM前期即出現(xiàn)升高，可作為T2DM發(fā)生、病情變化及預(yù)后的預(yù)測因子，并且與T2DM心血管并發(fā)癥有關(guān)[4]，是T2DM并發(fā)心血管事件的一個預(yù)測因子。IL-1β是NLRP3炎性小體活化后產(chǎn)生的主要炎性分子。正常情況下，短暫的血糖水平升高引起急性、低劑量IL-1β產(chǎn)生，刺激胰島β細(xì)胞增殖和胰島素分泌，抑制食欲，減少攝食，從而維持外周血糖水平的穩(wěn)定[5]。但是在慢性高血糖狀態(tài)下，T2DM患者體內(nèi)IL-1β持續(xù)升高，其受體表達(dá)上調(diào)，一方面 IL-1β可引起β 細(xì)胞凋亡，其功能衰退及胰島素抵抗[6-7]；另一方面，IL-1β 和其他炎性因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等協(xié)同干擾體內(nèi)葡萄糖代謝平衡[8]。因此，IL-1β在T2DM 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[9]，被認(rèn)為是T2DM的重要驅(qū)動者。而糖代謝紊亂作為危險信號進(jìn)一步激活I(lǐng)L-1β 的平臺NLRP3 炎性小體。TGF-β是一類蛋白質(zhì)超家族，在機(jī)體通過抑制白細(xì)胞的募集，降低巨噬細(xì)胞的功能[10]，減少單核巨噬細(xì)胞的趨化聚集，維持外周調(diào)節(jié)T細(xì)胞的作用，抑制T細(xì)胞向Th1和Th2增殖、激活和分化[11]等機(jī)制抑制炎性反應(yīng)。但其過度表達(dá)，將會促進(jìn)T2DM并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制包括促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成與積聚，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解[12-13]，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增生、遷移、分化[13-14]，誘導(dǎo)血管重構(gòu)[12-13]，刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitors, PAI)等細(xì)胞因子而促進(jìn)血栓形成[13]，促纖維化作用增加纖維帽厚度等。

本研究顯示，初診T2DM 患者血漿中的炎性因子IL-1β、IL-18 和抗炎因子TGF-β水平顯著高于對照組，提示T2DM患者存在慢性炎癥反應(yīng)；初診T2DM 患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA的表達(dá)與對照組比較無顯著性差異，但ASCmRNA及 Caspase-1mRNA在T2DM組分別與TC、BMI呈正相關(guān)，提示雖然T2DM患者NLRP3炎性小體在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)無顯著性增加，但T2DM患者的血脂代謝異常、肥胖因素已經(jīng)存在促進(jìn)NLRP3炎性小體表達(dá)的傾向；初診T2DM 患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)均較對照組顯著增高，并且ASC在T2DM組與MAP、FPG、TC呈正相關(guān)， Caspase-1在T2DM組與吸煙、FPG、LDLC呈正相關(guān)，一方面提示T2DM患者炎性小體在翻譯水平的表達(dá)明顯增加，為NLRP3蛋白復(fù)合體在T2DM患者中激活創(chuàng)造物質(zhì)條件；另一方面提示T2DM患者高血壓、高血糖、TC、LDLC、吸煙是激活NLRP3炎性小體在翻譯水平表達(dá)增加的危險因素，但激活NLRP3炎性小體在翻譯水平表達(dá)增加的危險因素不盡相同。NLRP3炎性小體表達(dá)增加后，T2DM患者體內(nèi)高血糖[15]、活性氧(ROS)[15]、硫氧還原蛋白結(jié)合蛋白[16]、神經(jīng)酰胺濃聚物[17]、胰島淀粉樣多肽[18]等物質(zhì)將通過半通道依賴途徑[19]、溶酶體依賴途徑[20]、ROS的依賴途徑[21-22]等模式激活NLRP3炎性小體。另外，在T2DM組，ASC還與IL-1β、IL-18呈正相關(guān)， Caspase-1還與IL-1β呈正相關(guān)，且IL-1β與TGF-β呈正相關(guān)，提示NLRP3炎性小體的激活，進(jìn)一步導(dǎo)致IL-1β 和IL-18等炎性分子的表達(dá)增加，而IL-1β的表達(dá)增加將促使抗炎因子TGF-β的過度表達(dá)，IL-1β 和IL-18等炎性分子的表達(dá)增加及TGF-β等抗炎因子的過度表達(dá)，在T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

由此可見，高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、肥胖是激活NLRP3炎性小體表達(dá)的重要危險因素，NLRP3炎性小體激活后進(jìn)一步促進(jìn)IL-1β、IL-18等炎性分子的表達(dá)及TGF-β等抗炎因子的表達(dá)，NLRP3 炎性小體是糖代謝紊亂誘導(dǎo)T2DM 發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。加強(qiáng)對血脂、血壓、血糖水平的控制及煙、減肥，阻斷NLRP3炎性小體的表達(dá)及活化途徑，可能對T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。進(jìn)一步研究NLRP3炎性小體激活及其調(diào)控機(jī)制，研究IL-18、IL-1β、TGF-β在T2DM發(fā)生發(fā)展過程中的作用，有望進(jìn)一步明確T2DM及其并發(fā)癥在細(xì)胞和分子水平的發(fā)病機(jī)制，為T2DM的臨床診斷、療效觀察、預(yù)后判斷提供新的實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)，為T2DM及其并發(fā)癥的治療和預(yù)防提供新的突破點(diǎn)。

4 結(jié)論

高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、肥胖是激活NLRP3炎性小體表達(dá)的重要危險因素。以NLRP3炎性小體為中心的NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-18/IL-1β-TGF-β信號通路可能在初診T2DM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

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