張言敏，孫輝，李玉軍

（1.青島大學醫(yī)學部 病理系，山東 青島 266071；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院腫 瘤外科，山東 濰坊 261000；3.青島大學附屬醫(yī)院 病理科，山東 青島 266000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其中三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）特指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）表達均為陰性的乳腺癌，其發(fā)病率占所有乳腺癌的10%～20%[1]。與非三陰性乳腺癌（non-tri-negative breast cancer， NTNBC）比較，TNBC具有侵襲性強、預后差、易復發(fā)及內分泌治療不敏感等特點，已成為醫(yī)療領域廣泛研究的對象[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的10年存活率平均為60%，一期乳腺癌治療后的存活率達80%，零期乳腺癌治療后的存活率更接近100%，因此乳腺癌的早期診斷并及時治療非常重要[3]。由于TNBC的治療相比于NTNBC更為棘手，所以早期診斷出乳腺癌的同時并發(fā)現(xiàn)TNBC的意義更為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白（E-cadhenrin，E-Cad）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在健康人群和乳腺癌患者中表達有差異，且在TNBC和NTNBC中，E-Cad、EGFR以及組織中叉頭框蛋白A1（fork head box protein A1，F(xiàn)OXA1）的表達也有不同[4-5]，但關于血清中E-Cad和EGFR的研究較少，國內外鮮有報道。因此，本研究通過收集乳腺癌患者和健康人群血液樣本，比較血清中E-Cad和EGFR的差異，并通過受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價血清E-Cad和EGFR對乳腺癌及TNBC的臨床診斷價值，同時預測血清中ECad和EGFR的診斷界值。FOXA1在TNBC的發(fā)病、治療和預后等方面起到重要作用，故通過檢測乳腺癌患者組織中FOXA1的表達，進一步研究TNBC和NTNBC中FOXA1的表達差異，為TNBC的早期診斷、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 患者組選取2015年7月-2016年8月我院經病理檢測確診為浸潤性乳腺癌的247例女性患者。其中，三陰性乳腺癌患者（TNBC組）49例（19.80%），中位年齡47歲（23～71歲）。非三陰性乳腺癌患者（NTNBC組）198例（80.20%），中位年齡51歲（26～75歲）。研究符合倫理委員會相關規(guī)定，經本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2 非患者組隨機選取來我院體檢的健康人群50例，將血清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 E-Cad和EGFR的檢測取患者清晨空腹靜脈血3 ml，4 000 r/min、4℃離心15 min，常規(guī)分離血清，備用進行細胞因子的檢測。血清可溶性E-Cad和EGFR的含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，試劑盒由上海鈺博生物科技有限公司提供。E-Cad和EGFR檢測均采用雙抗體夾心ELISA法，各孔加入標準品或樣品100 μl，37℃避光孵育90 min，然后棄去孔內液體，甩干后直接加入生物素化抗體工作液，繼續(xù)孵育1 h，然后洗板3次，最后1次洗板甩干后加入酶結合物工作液，孵育30 min后洗板5次，甩干后加入底物溶液，標準孔出現(xiàn)梯度時，加入終止液，使用酶標儀于450 nm處測定光密度值，繪制標準曲線并計算樣本中E-Cad和EGFR的含量。

1.2.2 ROC曲線的建立及界值預測采用SPSS 19.0軟件進行非參數(shù)法建立E-Cad和EGFR的ROC曲線，計算ROC曲線下面積；并以Youden指數(shù)最大值作為臨界點，計算血清中E-Cad和EGFR的界值，以及靈敏度和特異性。

1.2.3 FOXA1的檢測取TNBC組和NTNBC組乳腺癌患者病理石蠟標本及正常乳腺組織標本，分別進行連續(xù)切片6張（8 μm/張）。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行操作，用5%血清進行室溫封閉40 min后，分別加入1∶1 000的FOXA1單克隆抗體4℃過夜孵育。隔天加入1∶1 000的二抗37℃孵育30 min，PBS清洗后加入SP后進行恒溫反應30 min，加入DAB顯色液進行顯色，中性樹膠封片后用×10、×40物鏡顯微鏡進行觀察。陽性染色：FOXA1的陽性表達主要表現(xiàn)為細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒?！?0顯微鏡下觀察，隨機選擇5個高倍視野，采用IPP軟件進行圖像掃描分析，收集數(shù)據(jù)并計算圖片中FOXA1蛋白表達的平均光密度。用于反應組織中FOXA1蛋白的表達含量。平均光密度=累積光密度與面積的比值。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）或中位數(shù)及四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用方差分析或Kruskal-WallisH檢驗，方差分析采用LSD-t檢驗，秩和檢驗兩兩比較采用Mann-WhineyU檢驗，采用ROC曲線評價血清E-Cad和EGFR對乳腺癌或TNBC的臨床診斷價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同人群中E-Cad和EGFR表達情況

3組人群E-Cad、EGFR秩和檢驗分析結果顯示，3組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與非患者組比較，NTNBC組和TNBC組血清中E-Cad、EGFR表達升高（P＜0.01）；與NTNBC組比較，TNBC組血清中E-Cad表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），EGFR表達升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。見附表。

2.2 血清E-Cad、EGFR對乳腺癌和TNBC診斷的ROC曲線

結果可見，E-Cad和EGFR對于診斷乳腺癌的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.965（95%CI：0.944，0.986），0.758（95%CI：0.686，0.830）。當 E-Cad 和EGFR的界值分別為1010.7和107.9 ng/ml時，Youden指數(shù)最大為0.807和0.385，此時，診斷乳腺癌的敏感性為92.7%和78.5%，特異性為88.0%和60%。由于NTNBC組和TNBC組血清中E-Cad表達差異無統(tǒng)計學意義，所以只對EGFR診斷TNBC進行研究（見圖1B），ROC 曲線下面積為 0.776（95%CI：0.703，0.848）。當EGFR界值為139.5 ng/ml時，Youden指數(shù)最大為0.473，此時，診斷TNBC的敏感性為79.6%，特異性為67.7%。見圖1。

附表 不同人群中E-Cad和EGFR表達比較 [M（P25，P75），ng/ml]

圖1 血清E-Cad、EGFR對乳腺癌和TNBC診斷的ROC曲線

2.3 FOXA1的檢測結果

3組人群FOXA1平均光密度表達分析結果顯示，3組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=6.432，P=0.000）。與非患者組FOXA1蛋白含量（0.31±0.04）比較，NTNBC組FOXA1蛋白含量（1.67±0.11）和TNBC組組織中FOXA1蛋白含量（0.87±0.12）表達均上升（P＜0.01）；與NTNBC組比較，TNBC組組織中FOXA1表達降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。

圖2 各組FOXA1蛋白表達情況 （×400）

3 討論

乳腺癌作為一種惡性腫瘤，嚴重危害女性身體健康，未及時診斷乳腺癌會拖延治療的最佳時間和治療效果，因此在乳腺癌研究中，除化療或手術外，盡早發(fā)現(xiàn)及確診腫瘤已成為其治療的關鍵[6]。血清指標檢查是早期無創(chuàng)性診斷腫瘤的常用手段，能夠極大提高診斷方法的順應性，為盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤提供重要參考[7]。E-Cad是一種細胞黏附分子，具有維持組織結構完整等功能，在腫瘤侵襲轉移中起到重要作用[8]。LIANG等的研究結果表明[9]，相對于健康人群，乳腺癌患者血清中可溶性E-Cad表達升高；LI等的研究表明[10]，與NTNBC患者比較，TNBC組織中E-Cad表達降低，但未見NTNBC患者與TNBC患者血清中ECad含量比較的研究。EGFR是一類跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，并調控細胞增殖作用，高表達的EGFR可促進乳腺癌細胞增殖、轉移，并促進腫瘤血管生成[11]。TAS等的研究表明[12]，乳腺癌患者血清中EGFR表達升高，且與NTNBC患者比較，TNBC中EGFR表達較高。本研究結果表明，乳腺癌患者血清中E-Cad和EGFR表達相對健康人群升高，且在TNBC患者中EGFR表達高于NTNBC患者，而E-Cad表達無差異。ROC曲線結果表明，血清E-Cad和EGFR均具有一定的乳腺癌診斷價值，E-Cad（曲線下面積為0.965）診斷價值高于EGFR（曲線下面積為0.758），但在乳腺癌患者中，由于TNBC和NTNBC患者血清中E-Cad表達無差異，不具備TNBC診斷價值，而EGFR具有中等的TNBC診斷價值。本研究以Youden指數(shù)作為評價準確度的指標，當E-Cad和EGFR的界值分別為1010.7和107.9 ng/ml時，對于乳腺癌具有較高的診斷價值。當EGFR的界值為139.5 ng/ml時，適用于三陰性乳腺癌的診斷。

ER在乳腺癌的臨床進展、診斷及治療中均有著極其重要的作用，研究表明ER已成為評價患者是否需要內分泌治療的重要指標。但由于ER在三陰性乳腺癌中呈現(xiàn)陰性表達，TNBC患者對內分泌治療敏感性較低，因此TNBC臨床治療效果常常不佳[13-14]。FOXA1是一類由472個氨基酸殘基組成的轉錄輔助因子，主要受體內激素調控。ER可誘導乳腺癌細胞表達FOXA1，同時FOXA1又可促進ER轉錄復合物與染色質的結合上調ER表達，從而提高內分泌治療的效果[15]。研究表明，F(xiàn)OXA1與乳腺癌患者的預后存在相關性，可作為評價治療效果良好的標志物[16]。DREW等的研究結果表明，與NTNBC患者比較，TNBC中FOXA1表達陽性率降低[17]，但相關研究文獻較少，缺乏文獻支持。本研究結果表明，TNBC患者FOXA1表達降低，表明FOXA1可作為TNBC的診斷指標，更為重要的是，F(xiàn)OXA1有可能成為治療TNBC的關鍵靶點。但本研究還未對FOXA1與患者化療效果及預后的相關性展開研究，這可作為下一步的研究方向。

研究健康人群、TNBC與NTNBC患者血清中E-Cad、EGFR，并結合ROC曲線探討血清E-Cad和EGFR的臨床診斷意義，并預測診斷界值，為臨床TNBC的診斷提供無創(chuàng)、便捷的血清檢測手段；并通過檢測FOXA1的表達，為NTNBC的診斷和靶點治療提供參考。

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