邱裕佳，馬義勇，李光然，段思騰，李宇，王偉

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000）

自體神經(jīng)移植一直以來被認(rèn)為是治療周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是因其來源受限、造成供區(qū)功能障礙等缺點(diǎn)，使其臨床應(yīng)用受到一定的限制[1]。組織工程及干細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展避免上述問題，為周圍神經(jīng)損傷的治療帶來新的希望。成肌細(xì)胞因其取材方便、增殖能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)、成瘤風(fēng)險低、自體移植無倫理限制及低免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[2]。新近研究表明，成肌細(xì)胞能夠被睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）體外誘導(dǎo)去分化[3]，且去分化成肌細(xì)胞能夠被視黃酸（retinoic acid，RA）誘導(dǎo)成具有神經(jīng)表型的細(xì)胞[4]。目前，關(guān)于類神經(jīng)分化的研究雖較多，但是相關(guān)機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)元限制性沉默因子（neuron-restrictive silencer factor，REST）在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育分化過程中發(fā)揮重要作用，能與靶基因特異結(jié)合而抑制神經(jīng)元的分化[5-6]；REST與類神經(jīng)分化存在怎樣的聯(lián)系，目前尚未見相關(guān)報道。本研究采用CNTF聯(lián)合RA誘導(dǎo)成肌細(xì)胞類神經(jīng)分化，并初步探討該過程與REST可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

C2C12細(xì)胞株（美國ATCC公司），胎牛血清FBS（美國Sera Pro公司），DMEM/F12、胰蛋白酶、青鏈霉素（美國Hy Clone公司），Neurobasal培養(yǎng)基、B27（美國Gibco公司），表皮生長因子EGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF、CNTF（美國Pepro Tech公司），谷氨酰胺、RA、DAPI染料（美國Sigma公司），肝素（PBS國產(chǎn)），兔抗NSE多克隆抗體，兔抗SOX1多克隆抗體，兔抗GFAP多克隆抗體，兔抗Desmin多克隆抗體，兔抗Myogenin多克隆抗體，兔抗P21多克隆抗體，兔抗actin多克隆抗體（美國ABCAM公司），山羊抗兔二抗（美國Earthox公司），蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），蛋白Maker（美國Thermo Fisher公司）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher），超凈工作臺（海爾公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），紫外分光光度計（瑞士Tecan公司），熒光顯微鏡（德國Leica公司），全自動電泳儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 成肌細(xì)胞去分化及類神經(jīng)誘導(dǎo)分化按5×105個/ml接種C2C12于培養(yǎng)皿，以成肌細(xì)胞生長培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）培養(yǎng)，待生長到70%匯合時開始誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)方案見附表。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察分別于誘導(dǎo)第0、3、5、8及11天時倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、生長狀況等相關(guān)變化，記錄并采集圖片。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞細(xì)胞以PBS漂洗3次去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min后PBS漂洗3次，0.1% Triton-100室溫通透胞膜10 min，1%牛血清白蛋白室溫封閉60 min，加入稀釋的一抗 NSE（1︰ 500）、Sox1（1︰ 500）、GFAP（1︰500）4℃孵育過夜（18～20 h），二抗（1︰500）室溫孵育2 h，DAPI染料（10 μg/ml）染核5 min，熒光防淬滅劑封片。以PBS代替一抗作為陰性對照組。熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。為進(jìn)一步鑒定神經(jīng)球，取聯(lián)合誘導(dǎo)11 d的神經(jīng)球細(xì)胞以胰酶消化后吹打成單個懸浮細(xì)胞，并以神經(jīng)生長培養(yǎng)基+2% FBS培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞貼壁后予以神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin（1︰100）熒光染色鑒定。

1.2.4 Western blot檢測特異性蛋白表達(dá)水平取各組細(xì)胞加入裂解液裂解30 min后，以離心半徑3 cm，12 000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法蛋白定量后調(diào)整至同等濃度，每孔上樣30 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1%BSA封閉1 h，加 入 TBST稀 釋 一 抗 NSE（1︰ 500）、Sox1（1︰1 000）、GFAP（1 ︰ 1 000）、Desmin（1 ︰ 1 000）、Myogenin（1 ︰ 1000）、P21（1 ︰ 500）、REST（1 ︰500）、β-actin（1︰ 5 000）4℃過夜，TBST 洗膜 3次，加入二抗（1︰1 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL顯色顯影拍照。

附表 成肌細(xì)胞類神經(jīng)分化誘導(dǎo)方案

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析誘導(dǎo)后陽性細(xì)胞胰酶消化聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，收集單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，4%多聚甲醛4℃固定30 min，0.1% Triton-100室溫通透10 min，加入稀釋好的一抗（NSE，1︰500），對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動物IgG，輕輕吹打混勻，4℃孵育2 h。冷PBS離心洗滌去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。加入稀釋的熒光素標(biāo)記的二抗（1︰100）。吹打混勻，4℃孵育30 min，避光。冷PBS離心洗滌后重懸浮于500 μl PBS中，混勻，上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)球形成過程

未誘導(dǎo)成肌細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則形；誘導(dǎo)3 d后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，未見細(xì)胞融合形成肌管；誘導(dǎo)5 d后，誘導(dǎo)組細(xì)胞折光性增加，體形拉長；誘導(dǎo)8 d左右，誘導(dǎo)組細(xì)胞開始聚集呈團(tuán)簇樣生長，隨著培養(yǎng)時間延長，于誘導(dǎo)第11天左右，部分團(tuán)塊細(xì)胞可呈懸浮生長，表現(xiàn)出神經(jīng)球樣生長特性。見圖1。

2.2 CNTF誘導(dǎo)成肌細(xì)胞去分化

CNTF誘導(dǎo)成肌細(xì)胞3 d后，Western blot檢測結(jié)果顯示，CNTF誘導(dǎo)后成肌細(xì)胞分化相關(guān)蛋白Myogenin及P21表達(dá)均低于對照組（t=6.811和6.665，P=0.002和0.003）。表明CNTF成功誘導(dǎo)成肌細(xì)胞去分化，本結(jié)果與以往研究報道一致[3]。見圖2。

2.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定誘導(dǎo)神經(jīng)球

對聯(lián)合誘導(dǎo)后的神經(jīng)球行免疫熒光染色，可見誘導(dǎo)組細(xì)胞能夠被神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)特異性標(biāo)志物NSE、SOX1、GFAP標(biāo)記，且神經(jīng)球部分呈現(xiàn)熒光高亮。對照組中未見神經(jīng)球形成，且細(xì)胞不能被熒光標(biāo)記（見圖3）。神經(jīng)球離散后接種細(xì)胞生長狀態(tài)良好，部分細(xì)胞可伸出突觸，且熒光染色顯示重新接種后的細(xì)胞仍 帶有神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin（見圖4）。

圖1 成肌細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)球的變化過程 （×100）

圖2 CNTF誘導(dǎo)后成肌細(xì)胞分化相關(guān)蛋白變化 （n =3）

圖3 誘導(dǎo)神經(jīng)球 （免疫熒光染色×100）

圖4 神經(jīng)球離散后接種細(xì)胞 （免疫熒光染色×200）

圖5 聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)特異性標(biāo)志物及成肌細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)變化 （n =3）

2.4 聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)特異性標(biāo)志物及成肌細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)變化

對聯(lián)合誘導(dǎo)后的神經(jīng)球行Western blot檢測，結(jié)果顯示，聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞GFAP、SOX1、NSE表達(dá)高于對照組（t=5.192、3.401和6.303，P=0.007、0.003和0.003），且成肌細(xì)胞標(biāo)志物Desmin表達(dá)低于對照組（t=3.646，P=0.022）。說明聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞由成肌細(xì)胞類型向類神經(jīng)細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化。見圖5。

2.5 聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

對聯(lián)合誘導(dǎo)后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析表面標(biāo)志物NSE，結(jié)果顯示聯(lián)合誘導(dǎo)后熒光標(biāo)記陽性細(xì)胞率最高達(dá)84%，明顯高于對照組（t=45.81，P=0.000）。見圖6。

2.6 聯(lián)合誘導(dǎo)后REST蛋白水平變化

聯(lián)合誘導(dǎo)后的神經(jīng)球行Western blot檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞REST表達(dá)水平低于對照組（t=4.110，P=0.015）。REST是參與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控基因，REST水平降低利于細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞類型分化[5-6]。由此可得出聯(lián)合誘導(dǎo)成肌細(xì)胞類神經(jīng)分化可能是通過干預(yù)REST基因的表達(dá)變化來實(shí)現(xiàn)。見圖7。

圖6 聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果 （n =3）

圖7 聯(lián)合誘導(dǎo)后REST蛋白水平變化 （n =3）

3 討論

隨著誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)[7]，細(xì)胞治療在神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域中越來越受到關(guān)注。目前大量研究已證實(shí)，從胚胎干細(xì)胞到各種類型的成體干細(xì)胞再到誘導(dǎo)多能干細(xì)胞均在神經(jīng)修復(fù)中展示良好的應(yīng)用前景[8-12]；但是上述各種細(xì)胞存在各種問題，例如倫理爭議、取材困難、基因表達(dá)不穩(wěn)定等[13]，目前還不能作為十分理想的神經(jīng)修復(fù)的細(xì)胞來源，由此拓寬神經(jīng)損傷細(xì)胞治療的細(xì)胞選擇范圍十分必要。成肌細(xì)胞是骨骼肌中具有增殖分化潛能的細(xì)胞，1961年由MUAOR首次從青蛙骨骼肌纖維中分離出來[14]。成肌細(xì)胞具有多向分化潛能[15]且取材方便、增殖能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)、成瘤風(fēng)險低、自體移植無倫理限制及低免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)[2]，已成為細(xì)胞治療在神經(jīng)損傷修復(fù)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

新近研究表明，成肌細(xì)胞在外源性CNTF的作用下能夠達(dá)到去分化狀態(tài)[3]，且成肌細(xì)胞能夠被小分子化合物reversine誘導(dǎo)去分化進(jìn)而被RA誘導(dǎo)為類神經(jīng)樣細(xì)胞[4]。RA能夠調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在改變干細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)錄特征上充當(dāng)著開關(guān)作用，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究中[16-18]。本研究采用CNTF聯(lián)合RA誘導(dǎo)成肌細(xì)胞類神經(jīng)分化，試圖獲得成肌細(xì)胞類神經(jīng)分化的新方法。研究結(jié)果表明，CNTF能夠成功誘導(dǎo)成肌細(xì)胞去分化，聯(lián)合RA及神經(jīng)生長微環(huán)境后成肌細(xì)胞能夠形成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，并表達(dá)NSE、SOX1、GFAP，且成肌細(xì)胞標(biāo)志物Desmin表達(dá)降低，說明聯(lián)合誘導(dǎo)后細(xì)胞表型已發(fā)生轉(zhuǎn)變，細(xì)胞已由肌源性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭惿窠?jīng)樣細(xì)胞。將神經(jīng)球離散后接種再次檢測仍然表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志nestin，說明誘導(dǎo)后細(xì)胞表型穩(wěn)定，需要注意的是nestin陽性細(xì)胞的形狀并不完全一致，可能因?yàn)橹匦陆臃N后神經(jīng)球細(xì)胞可能分化為不同類型神經(jīng)樣細(xì)胞；此外，部分細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后仍存在成肌細(xì)胞樣特性，可能與表觀遺傳記憶有關(guān)[19]。為進(jìn)一步探討上述聯(lián)合誘導(dǎo)過程可能涉及內(nèi)在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)REST作為調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一直以來備受關(guān)注，WATANABE等將REST-VP16重組轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入C2C12獲得神經(jīng)元樣表型且具有電生理活動的細(xì)胞[20]；GOPALAKRISHNAN等通過該方式在小鼠小腦中獲得特定亞型的谷氨酸能神經(jīng)元[21]。由此本研究聯(lián)合誘導(dǎo)后成肌細(xì)胞形成的神經(jīng)球的REST表達(dá)進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后形成的神經(jīng)球與對照組比較REST表達(dá)下調(diào)，說明REST參與成肌細(xì)胞類神經(jīng)分化過程，可能是該過程的調(diào)控機(jī)制之一。

通過基因調(diào)控的方式可獲得特定表型細(xì)胞，但因改變內(nèi)源性基因序列，使得其臨床應(yīng)用受到阻礙。本研究以非基因調(diào)控方式轉(zhuǎn)變成肌細(xì)胞為類神經(jīng)細(xì)胞表型為神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞的選擇提供嘗試。近期國外學(xué)者通過高通量篩選的方式已找到針對調(diào)控REST表達(dá)的化合物[22]，若能以化合物調(diào)控REST表達(dá)實(shí)現(xiàn)將非神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞干細(xì)胞或者特定類型神經(jīng)細(xì)胞，將能做到盡可能避免外源性的基因及因子的引入，極大地促進(jìn)神經(jīng)損傷的治療，更是為臨床細(xì)胞治療的應(yīng)用提供了保障。

綜上所述，本研究初步證實(shí)CNTF聯(lián)合RA可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞類神經(jīng)分化，為神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞的選擇提供新的嘗試；并進(jìn)一步探討該誘導(dǎo)過程可能與REST調(diào)控有關(guān)，為下一步研究更為優(yōu)良的種子細(xì)胞提供思路和方向。

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