邱裕佳，馬義勇，李光然，段思騰，李宇，王偉

（錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000）

自體神經(jīng)移植一直以來被認為是治療周圍神經(jīng)損傷修復的“金標準”，但是因其來源受限、造成供區(qū)功能障礙等缺點，使其臨床應用受到一定的限制[1]。組織工程及干細胞治療技術的發(fā)展避免上述問題，為周圍神經(jīng)損傷的治療帶來新的希望。成肌細胞因其取材方便、增殖能力強、易于培養(yǎng)、成瘤風險低、自體移植無倫理限制及低免疫排斥等優(yōu)點而備受關注[2]。新近研究表明，成肌細胞能夠被睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）體外誘導去分化[3]，且去分化成肌細胞能夠被視黃酸（retinoic acid，RA）誘導成具有神經(jīng)表型的細胞[4]。目前，關于類神經(jīng)分化的研究雖較多，但是相關機制尚不清楚。神經(jīng)元限制性沉默因子（neuron-restrictive silencer factor，REST）在神經(jīng)細胞的發(fā)育分化過程中發(fā)揮重要作用，能與靶基因特異結(jié)合而抑制神經(jīng)元的分化[5-6]；REST與類神經(jīng)分化存在怎樣的聯(lián)系，目前尚未見相關報道。本研究采用CNTF聯(lián)合RA誘導成肌細胞類神經(jīng)分化，并初步探討該過程與REST可能存在的關系。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

C2C12細胞株（美國ATCC公司），胎牛血清FBS（美國Sera Pro公司），DMEM/F12、胰蛋白酶、青鏈霉素（美國Hy Clone公司），Neurobasal培養(yǎng)基、B27（美國Gibco公司），表皮生長因子EGF、堿性成纖維細胞生長因子bFGF、CNTF（美國Pepro Tech公司），谷氨酰胺、RA、DAPI染料（美國Sigma公司），肝素（PBS國產(chǎn)），兔抗NSE多克隆抗體，兔抗SOX1多克隆抗體，兔抗GFAP多克隆抗體，兔抗Desmin多克隆抗體，兔抗Myogenin多克隆抗體，兔抗P21多克隆抗體，兔抗actin多克隆抗體（美國ABCAM公司），山羊抗兔二抗（美國Earthox公司），蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），蛋白Maker（美國Thermo Fisher公司）。

細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher），超凈工作臺（海爾公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），紫外分光光度計（瑞士Tecan公司），熒光顯微鏡（德國Leica公司），全自動電泳儀（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 成肌細胞去分化及類神經(jīng)誘導分化按5×105個/ml接種C2C12于培養(yǎng)皿，以成肌細胞生長培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）培養(yǎng)，待生長到70%匯合時開始誘導分化，誘導方案見附表。

1.2.2 細胞形態(tài)學觀察分別于誘導第0、3、5、8及11天時倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞數(shù)量、形態(tài)、生長狀況等相關變化，記錄并采集圖片。

1.2.3 細胞免疫熒光鑒定誘導后的細胞細胞以PBS漂洗3次去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min后PBS漂洗3次，0.1% Triton-100室溫通透胞膜10 min，1%牛血清白蛋白室溫封閉60 min，加入稀釋的一抗 NSE（1︰ 500）、Sox1（1︰ 500）、GFAP（1︰500）4℃孵育過夜（18～20 h），二抗（1︰500）室溫孵育2 h，DAPI染料（10 μg/ml）染核5 min，熒光防淬滅劑封片。以PBS代替一抗作為陰性對照組。熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。為進一步鑒定神經(jīng)球，取聯(lián)合誘導11 d的神經(jīng)球細胞以胰酶消化后吹打成單個懸浮細胞，并以神經(jīng)生長培養(yǎng)基+2% FBS培養(yǎng)1 d，待細胞貼壁后予以神經(jīng)干細胞標志物nestin（1︰100）熒光染色鑒定。

1.2.4 Western blot檢測特異性蛋白表達水平取各組細胞加入裂解液裂解30 min后，以離心半徑3 cm，12 000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法蛋白定量后調(diào)整至同等濃度，每孔上樣30 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，1%BSA封閉1 h，加 入 TBST稀 釋 一 抗 NSE（1︰ 500）、Sox1（1︰1 000）、GFAP（1 ︰ 1 000）、Desmin（1 ︰ 1 000）、Myogenin（1 ︰ 1000）、P21（1 ︰ 500）、REST（1 ︰500）、β-actin（1︰ 5 000）4℃過夜，TBST 洗膜 3次，加入二抗（1︰1 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL顯色顯影拍照。

附表 成肌細胞類神經(jīng)分化誘導方案

1.2.5 流式細胞術分析誘導后陽性細胞胰酶消化聯(lián)合誘導組細胞并制成單細胞懸液，收集單細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，4%多聚甲醛4℃固定30 min，0.1% Triton-100室溫通透10 min，加入稀釋好的一抗（NSE，1︰500），對照管加入對應于一抗的正常實驗動物IgG，輕輕吹打混勻，4℃孵育2 h。冷PBS離心洗滌去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。加入稀釋的熒光素標記的二抗（1︰100）。吹打混勻，4℃孵育30 min，避光。冷PBS離心洗滌后重懸浮于500 μl PBS中，混勻，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)球形成過程

未誘導成肌細胞呈長梭形或不規(guī)則形；誘導3 d后，細胞生長狀態(tài)良好，未見細胞融合形成肌管；誘導5 d后，誘導組細胞折光性增加，體形拉長；誘導8 d左右，誘導組細胞開始聚集呈團簇樣生長，隨著培養(yǎng)時間延長，于誘導第11天左右，部分團塊細胞可呈懸浮生長，表現(xiàn)出神經(jīng)球樣生長特性。見圖1。

2.2 CNTF誘導成肌細胞去分化

CNTF誘導成肌細胞3 d后，Western blot檢測結(jié)果顯示，CNTF誘導后成肌細胞分化相關蛋白Myogenin及P21表達均低于對照組（t=6.811和6.665，P=0.002和0.003）。表明CNTF成功誘導成肌細胞去分化，本結(jié)果與以往研究報道一致[3]。見圖2。

2.3 細胞免疫熒光鑒定誘導神經(jīng)球

對聯(lián)合誘導后的神經(jīng)球行免疫熒光染色，可見誘導組細胞能夠被神經(jīng)細胞相關特異性標志物NSE、SOX1、GFAP標記，且神經(jīng)球部分呈現(xiàn)熒光高亮。對照組中未見神經(jīng)球形成，且細胞不能被熒光標記（見圖3）。神經(jīng)球離散后接種細胞生長狀態(tài)良好，部分細胞可伸出突觸，且熒光染色顯示重新接種后的細胞仍 帶有神經(jīng)干細胞標志物nestin（見圖4）。

圖1 成肌細胞誘導為神經(jīng)球的變化過程 （×100）

圖2 CNTF誘導后成肌細胞分化相關蛋白變化 （n =3）

圖3 誘導神經(jīng)球 （免疫熒光染色×100）

圖4 神經(jīng)球離散后接種細胞 （免疫熒光染色×200）

圖5 聯(lián)合誘導后細胞神經(jīng)特異性標志物及成肌細胞標志物表達變化 （n =3）

2.4 聯(lián)合誘導后細胞神經(jīng)特異性標志物及成肌細胞標志物表達變化

對聯(lián)合誘導后的神經(jīng)球行Western blot檢測，結(jié)果顯示，聯(lián)合誘導后細胞GFAP、SOX1、NSE表達高于對照組（t=5.192、3.401和6.303，P=0.007、0.003和0.003），且成肌細胞標志物Desmin表達低于對照組（t=3.646，P=0.022）。說明聯(lián)合誘導后細胞由成肌細胞類型向類神經(jīng)細胞類型轉(zhuǎn)化。見圖5。

2.5 聯(lián)合誘導后細胞流式細胞儀檢測結(jié)果

對聯(lián)合誘導后的細胞用流式細胞儀分析表面標志物NSE，結(jié)果顯示聯(lián)合誘導后熒光標記陽性細胞率最高達84%，明顯高于對照組（t=45.81，P=0.000）。見圖6。

2.6 聯(lián)合誘導后REST蛋白水平變化

聯(lián)合誘導后的神經(jīng)球行Western blot檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合誘導后細胞REST表達水平低于對照組（t=4.110，P=0.015）。REST是參與神經(jīng)細胞發(fā)育的重要調(diào)控基因，REST水平降低利于細胞向神經(jīng)細胞類型分化[5-6]。由此可得出聯(lián)合誘導成肌細胞類神經(jīng)分化可能是通過干預REST基因的表達變化來實現(xiàn)。見圖7。

圖6 聯(lián)合誘導后細胞流式細胞術檢測結(jié)果 （n =3）

圖7 聯(lián)合誘導后REST蛋白水平變化 （n =3）

3 討論

隨著誘導多能干細胞的發(fā)現(xiàn)[7]，細胞治療在神經(jīng)損傷修復領域中越來越受到關注。目前大量研究已證實，從胚胎干細胞到各種類型的成體干細胞再到誘導多能干細胞均在神經(jīng)修復中展示良好的應用前景[8-12]；但是上述各種細胞存在各種問題，例如倫理爭議、取材困難、基因表達不穩(wěn)定等[13]，目前還不能作為十分理想的神經(jīng)修復的細胞來源，由此拓寬神經(jīng)損傷細胞治療的細胞選擇范圍十分必要。成肌細胞是骨骼肌中具有增殖分化潛能的細胞，1961年由MUAOR首次從青蛙骨骼肌纖維中分離出來[14]。成肌細胞具有多向分化潛能[15]且取材方便、增殖能力強、易于培養(yǎng)、成瘤風險低、自體移植無倫理限制及低免疫排斥等優(yōu)點[2]，已成為細胞治療在神經(jīng)損傷修復領域的新熱點。

新近研究表明，成肌細胞在外源性CNTF的作用下能夠達到去分化狀態(tài)[3]，且成肌細胞能夠被小分子化合物reversine誘導去分化進而被RA誘導為類神經(jīng)樣細胞[4]。RA能夠調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子的表達，在改變干細胞形態(tài)及轉(zhuǎn)錄特征上充當著開關作用，已被廣泛應用于細胞誘導分化的研究中[16-18]。本研究采用CNTF聯(lián)合RA誘導成肌細胞類神經(jīng)分化，試圖獲得成肌細胞類神經(jīng)分化的新方法。研究結(jié)果表明，CNTF能夠成功誘導成肌細胞去分化，聯(lián)合RA及神經(jīng)生長微環(huán)境后成肌細胞能夠形成神經(jīng)球樣結(jié)構，并表達NSE、SOX1、GFAP，且成肌細胞標志物Desmin表達降低，說明聯(lián)合誘導后細胞表型已發(fā)生轉(zhuǎn)變，細胞已由肌源性細胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭惿窠?jīng)樣細胞。將神經(jīng)球離散后接種再次檢測仍然表達神經(jīng)干細胞標志nestin，說明誘導后細胞表型穩(wěn)定，需要注意的是nestin陽性細胞的形狀并不完全一致，可能因為重新接種后神經(jīng)球細胞可能分化為不同類型神經(jīng)樣細胞；此外，部分細胞經(jīng)誘導后仍存在成肌細胞樣特性，可能與表觀遺傳記憶有關[19]。為進一步探討上述聯(lián)合誘導過程可能涉及內(nèi)在機制，發(fā)現(xiàn)REST作為調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一直以來備受關注，WATANABE等將REST-VP16重組轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入C2C12獲得神經(jīng)元樣表型且具有電生理活動的細胞[20]；GOPALAKRISHNAN等通過該方式在小鼠小腦中獲得特定亞型的谷氨酸能神經(jīng)元[21]。由此本研究聯(lián)合誘導后成肌細胞形成的神經(jīng)球的REST表達進行檢測分析，結(jié)果顯示誘導后形成的神經(jīng)球與對照組比較REST表達下調(diào)，說明REST參與成肌細胞類神經(jīng)分化過程，可能是該過程的調(diào)控機制之一。

通過基因調(diào)控的方式可獲得特定表型細胞，但因改變內(nèi)源性基因序列，使得其臨床應用受到阻礙。本研究以非基因調(diào)控方式轉(zhuǎn)變成肌細胞為類神經(jīng)細胞表型為神經(jīng)組織工程種子細胞的選擇提供嘗試。近期國外學者通過高通量篩選的方式已找到針對調(diào)控REST表達的化合物[22]，若能以化合物調(diào)控REST表達實現(xiàn)將非神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細胞干細胞或者特定類型神經(jīng)細胞，將能做到盡可能避免外源性的基因及因子的引入，極大地促進神經(jīng)損傷的治療，更是為臨床細胞治療的應用提供了保障。

綜上所述，本研究初步證實CNTF聯(lián)合RA可誘導成肌細胞類神經(jīng)分化，為神經(jīng)組織工程種子細胞的選擇提供新的嘗試；并進一步探討該誘導過程可能與REST調(diào)控有關，為下一步研究更為優(yōu)良的種子細胞提供思路和方向。

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