沈彤，張賽，涂悅，陳旭義，吳煥成

[1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 推拿科，天津 300193；2.武警后勤學(xué)院

附屬醫(yī)院腦科中心（天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室），天津 300162；3.天津市北辰醫(yī)院 腦系科，天津 300400]

隨著社會經(jīng)濟(jì)、交通運輸業(yè)等的快速發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）的發(fā)生率也逐年增高，其高致殘率和致死率給社會和家庭可造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。而TBI后的繼發(fā)性腦水腫是導(dǎo)致患者殘疾和死亡的重要原因之一，因此有效控制腦水腫是治療TBI的關(guān)鍵手段[1]。近年有研究顯示，十二井穴放血對改善TBI后腦水腫有一定療效，但相關(guān)機制尚不明確。線粒體是機體能量代謝的重要場所，線粒體功能障礙與細(xì)胞毒性腦水腫以及神經(jīng)功能損傷程度密切相關(guān)，這提示線粒體或許是井穴放血療法發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要靶點之一[2-4]。本實驗擬通過皮質(zhì)撞擊致傷（controlled cortical impact injury，CCI）構(gòu)建不同損傷程度TBI大鼠模型，探討井穴放血療法對腦水腫的影響，并進(jìn)一步檢測線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)以及線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)的變化，從而為研究井穴放血療法治療TBI的機制提供更多基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性SD大鼠56只，7～8周齡，體重220～250 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心。RNA/DNA共提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），實時熒光定量PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子控制性腦皮質(zhì)撞擊儀（eCCI，美國Custom &Design公司），Nano Drop 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司），real-time PCR儀（Step One Plus，美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及TBI模型的復(fù)制將大鼠按隨機數(shù)字表法隨機等分為7組，即輕度TBI組（L組）、輕度TBI加井穴放血組（L+B組）、中度TBI組（M組）、中度TBI加井穴放血組（M+B組）、重度TBI組（H組）、重度TBI加井穴放血組（H+B組）和對照組，每組8只。各TBI組經(jīng)1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg麻醉后，暴露右側(cè)頂骨，顱鉆鉆孔直徑約4.5 mm，調(diào)整eCCI打擊臂至與垂直方向呈20°夾角，使用3 mm直徑打擊帽打擊大腦皮質(zhì)。參數(shù)如下：打擊速率為5 m/s，打擊后最低點持續(xù)時間為0.2 s，輕度、中度、重度TBI組的打擊深度分別為1、3和4 mm[5]。對照組僅開骨窗后縫合皮膚，不進(jìn)行打擊。

1.3.2 十二井穴放血用1 ml注射器針頭于大鼠雙側(cè)前肢趾端的十二井穴點刺出血，出血量為每穴10 μl，每12 h進(jìn)行1次放血，穴位定位方法采用比較解剖學(xué)，參考人體相應(yīng)穴位解剖標(biāo)志。

1.3.3 神經(jīng)功能損傷評分及標(biāo)本采集7組大鼠均于術(shù)后第72 h行mNSS評分[6]，分?jǐn)?shù)越高說明癥狀越嚴(yán)重，最嚴(yán)重為18分，0分為正常。評價完成后采用頸椎離斷法處死大鼠，各組均取損傷灶周邊同一部位腦皮質(zhì)約10 mg，進(jìn)行后續(xù)DNA和RNA的提取，剩余腦組織進(jìn)行干濕比重測量。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定相關(guān)基因表達(dá)及線粒體DNA拷貝數(shù)按照說明書，提取腦組織的基因組DNA和總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR測定線粒體生物合成相關(guān)基因的表達(dá)變化，包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator-1alpha，PGC-1α）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），以及可代表mtDNA拷貝數(shù)的線粒體單拷貝基因環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）。方法如下：配制PCR反應(yīng)體系，包括2×Ultra SYBR Mixture，cDNA 10 ng或基因組DNA 50 ng，以及相應(yīng)體積的引物和滅菌雙蒸水，每個基因設(shè)置3個重復(fù)孔。反應(yīng)條件采用兩步法：95℃10 min預(yù)變性，隨后95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40個循環(huán)測定Ct值，以0.3℃梯度逐步升溫行熔解曲線分析。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.3.5 腦組織含水量測定取腦后僅保留左右大腦半球，立即稱重，所得質(zhì)量為濕重。隨后將大腦放入烘箱中，75℃烘烤48 h，稱重后所得質(zhì)量為干重。含水量=（濕重-干重）/濕重。

表1 設(shè)計引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評分

TBI后大鼠的mNSS評分均高于對照組，且隨著TBI嚴(yán)重程度的增加，評分依次增高（P＜0.05），且輕、中度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后mNSS評分與相應(yīng)的L和M組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同組別各指標(biāo)比較 （n =8，±s）

表2 不同組別各指標(biāo)比較 （n =8，±s）

組別 mNSS評分/分 PGC-1α TFAM mtDNA拷貝數(shù) 腦組織含水量L 組 5.75±1.751） 2.56±0.711） 2.40±0.971） 5.50±1.421） 0.788±0.0161）L+B 組 4.00±1.191）2） 3.13±0.871） 3.07±0.721） 7.82±3.201）2） 0.776±0.0121）M組 8.88±1.731） 2.49±0.781） 2.76±1.351） 5.03±3.361） 0.791±0.0091）M+B 組 6.63±2.131）2） 3.74±1.011）2） 3.41±1.481） 7.42±2.901）2） 0.780±0.0071）2）H組 10.63±2.071） 4.61±2.041） 3.64±0.711） 3.67±1.821） 0.797±0.0121）H+B 組 10.00±1.201） 5.47±1.951） 4.48±2.321） 4.00±1.831） 0.799±0.0151）

續(xù)表2

2.2 各基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)變化

TBI模型大鼠的PGC-1α和TFAM基因表達(dá)水平以及mtDNA拷貝數(shù)均高于對照組（P＜0.001）；輕度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后，mtDNA拷貝數(shù)高于相應(yīng)的未應(yīng)用放血療法的大鼠（P＜0.05），中度TBI組大鼠在應(yīng)用放血療法后PGC-1α基因表達(dá)水平和mtDNA拷貝數(shù)升高（P＜0.05），輕、重度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后，雖然PGC-1α和TFAM基因表達(dá)水平均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 腦組織含水量

TBI后各組大鼠腦組織含水量與對照組比較均增加，且中度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后腦組織含水量與相應(yīng)的M組比較降低（P＜0.05），見表2。

3 討論

腦水腫TBI后常見的并發(fā)癥之一，常于發(fā)病后第2天達(dá)到高峰，主要由創(chuàng)傷造成的腦組織缺血、缺氧以及Na+-K+離子泵的功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞水腫引起，其可造成顱內(nèi)壓急劇增高，從而進(jìn)一步使腦的血液灌注減少，病情加重，甚至導(dǎo)致腦疝威脅生命[7]。井穴位于人體的四肢末端，是十二經(jīng)脈氣血起始之處，《醫(yī)宗金鑒-刺灸心法要訣》中指出：“商陽主刺卒中風(fēng)，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中沖、關(guān)沖、少澤、商陽，使氣血流行，乃起死回生救急之妙穴”。放血療法最早的記載可見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，如“刺絡(luò)者，刺小絡(luò)之血脈也”；“菀陳則除之，出惡血也”，并明確地提出刺絡(luò)放血可以治療癲狂、頭痛、暴喑、熱喘及衄血等病證，與單純灸法比較，起除淤效果更佳。

本實驗結(jié)果表明，井穴放血可有效減輕輕度和中度TBI大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，并降低TBI后腦水腫的嚴(yán)重程度，提示TBI后應(yīng)用井穴放血療法可發(fā)揮腦保護(hù)作用。與苗笑梅和張靜莎等的研究結(jié)果類似，苗笑梅等[8]發(fā)現(xiàn)，十二井穴刺絡(luò)放血可以降低神經(jīng)功能缺陷評分，減輕腦水腫，對創(chuàng)傷性大鼠腦組織有保護(hù)作用，張靜莎等[9]也發(fā)現(xiàn)，手十二井穴放血有改善重型顱腦創(chuàng)傷患者意識狀態(tài)的作用趨勢，但上述兩項研究均未深入探討相關(guān)機制。細(xì)胞內(nèi)線粒體可通過氧化磷酸化為細(xì)胞活動提供能量，當(dāng)創(chuàng)傷導(dǎo)致線粒體功能障礙時，可引起細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積并影響Na+-H+交換，促進(jìn)腦水腫的發(fā)生[10]。為此本課題組進(jìn)而檢測腦組織中線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)的變化，以期探索井穴放血療法發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點。

結(jié)果表明，TBI后組織中mtDNA拷貝數(shù)增加，提示創(chuàng)傷在造成線粒體損傷后，mtDNA發(fā)生代償性擴增。一方面，mtDNA是獨立存在于細(xì)胞器中的環(huán)狀基因組DNA，其在基因組之中的個數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)，由于線粒體DNA缺少組蛋白的保護(hù)，使其容易受到氧化應(yīng)激、炎癥等危險因素的損害，造成及線粒體功能障礙[11-12]，TBI后，損傷本身及壞死的腦組織可誘導(dǎo)活性氧族（ROS）及炎癥因子的釋放增多[13]，使機體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)從而造成mtDNA損傷。另一方面，ROS在造成DNA損傷的同時，本身亦可以作為第二信使，觸發(fā)TFAM和NRF的表達(dá)，促進(jìn)線粒體擴增，從而降低功能障礙mtDNA所占比例，代償能量供應(yīng)水平的下降[14-15]。當(dāng)應(yīng)用井穴放血后，可見大鼠的PGC-1α基因以及下游的TFAM基因表達(dá)進(jìn)一步升高，且mtDNA拷貝數(shù)提高，表明井穴放血可能是通過激活PGC及下游通路，促進(jìn)mtDNA的生物合成，從而增強創(chuàng)傷腦組織的能量供應(yīng)，改善腦水腫程度，發(fā)揮腦保護(hù)作用。同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)，對于重度TBI大鼠，單獨應(yīng)用井穴放血療法時，雖然可一定程度上促進(jìn)mtDNA拷貝數(shù)的增加，但并未改善神經(jīng)功能損傷癥狀及腦水腫程度，這可能是由于重型TBI因損傷嚴(yán)重，會同時累及多條通路，多因素綜合作用導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生，而單獨應(yīng)用井穴放血療法尚不足以展現(xiàn)改善腦水腫的作用，提示在重型TBI時應(yīng)多種治療策略共同施治，輔以井穴放血療法，或許能展現(xiàn)出更好的治療效果。

綜上所述，本實驗通過構(gòu)建TBI大鼠模型，初步探討井穴放血對腦水腫及線粒體生物合成基因的影響，為解釋井穴放血發(fā)揮腦保護(hù)作用的機制提供基礎(chǔ)研究。但TBI的發(fā)病是多因素共同造成，其發(fā)生發(fā)展也涉及其他多條通路及靶基因，這仍有待挖掘。若能進(jìn)一步探討井穴放血對其他通路的影響，或許可為TBI的臨床治療乃至開發(fā)井穴放血的新用途提供幫助。

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