沈彤，張賽，涂悅，陳旭義，吳煥成

[1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 推拿科，天津 300193；2.武警后勤學院

附屬醫(yī)院腦科中心（天津市神經創(chuàng)傷修復重點實驗室），天津 300162；3.天津市北辰醫(yī)院 腦系科，天津 300400]

隨著社會經濟、交通運輸業(yè)等的快速發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）的發(fā)生率也逐年增高，其高致殘率和致死率給社會和家庭可造成嚴重負擔。而TBI后的繼發(fā)性腦水腫是導致患者殘疾和死亡的重要原因之一，因此有效控制腦水腫是治療TBI的關鍵手段[1]。近年有研究顯示，十二井穴放血對改善TBI后腦水腫有一定療效，但相關機制尚不明確。線粒體是機體能量代謝的重要場所，線粒體功能障礙與細胞毒性腦水腫以及神經功能損傷程度密切相關，這提示線粒體或許是井穴放血療法發(fā)揮腦保護作用的重要靶點之一[2-4]。本實驗擬通過皮質撞擊致傷（controlled cortical impact injury，CCI）構建不同損傷程度TBI大鼠模型，探討井穴放血療法對腦水腫的影響，并進一步檢測線粒體生物合成相關基因表達以及線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)的變化，從而為研究井穴放血療法治療TBI的機制提供更多基礎支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性SD大鼠56只，7～8周齡，體重220～250 g，購自軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心。RNA/DNA共提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），實時熒光定量PCR試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

電子控制性腦皮質撞擊儀（eCCI，美國Custom &Design公司），Nano Drop 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司），real-time PCR儀（Step One Plus，美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及TBI模型的復制將大鼠按隨機數(shù)字表法隨機等分為7組，即輕度TBI組（L組）、輕度TBI加井穴放血組（L+B組）、中度TBI組（M組）、中度TBI加井穴放血組（M+B組）、重度TBI組（H組）、重度TBI加井穴放血組（H+B組）和對照組，每組8只。各TBI組經1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg麻醉后，暴露右側頂骨，顱鉆鉆孔直徑約4.5 mm，調整eCCI打擊臂至與垂直方向呈20°夾角，使用3 mm直徑打擊帽打擊大腦皮質。參數(shù)如下：打擊速率為5 m/s，打擊后最低點持續(xù)時間為0.2 s，輕度、中度、重度TBI組的打擊深度分別為1、3和4 mm[5]。對照組僅開骨窗后縫合皮膚，不進行打擊。

1.3.2 十二井穴放血用1 ml注射器針頭于大鼠雙側前肢趾端的十二井穴點刺出血，出血量為每穴10 μl，每12 h進行1次放血，穴位定位方法采用比較解剖學，參考人體相應穴位解剖標志。

1.3.3 神經功能損傷評分及標本采集7組大鼠均于術后第72 h行mNSS評分[6]，分數(shù)越高說明癥狀越嚴重，最嚴重為18分，0分為正常。評價完成后采用頸椎離斷法處死大鼠，各組均取損傷灶周邊同一部位腦皮質約10 mg，進行后續(xù)DNA和RNA的提取，剩余腦組織進行干濕比重測量。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定相關基因表達及線粒體DNA拷貝數(shù)按照說明書，提取腦組織的基因組DNA和總RNA，并將RNA逆轉錄成cDNA。qRT-PCR測定線粒體生物合成相關基因的表達變化，包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorgamma coactivator-1alpha，PGC-1α）、線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM），以及可代表mtDNA拷貝數(shù)的線粒體單拷貝基因環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）。方法如下：配制PCR反應體系，包括2×Ultra SYBR Mixture，cDNA 10 ng或基因組DNA 50 ng，以及相應體積的引物和滅菌雙蒸水，每個基因設置3個重復孔。反應條件采用兩步法：95℃10 min預變性，隨后95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40個循環(huán)測定Ct值，以0.3℃梯度逐步升溫行熔解曲線分析。應用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

1.3.5 腦組織含水量測定取腦后僅保留左右大腦半球，立即稱重，所得質量為濕重。隨后將大腦放入烘箱中，75℃烘烤48 h，稱重后所得質量為干重。含水量=（濕重-干重）/濕重。

表1 設計引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 神經功能損傷評分

TBI后大鼠的mNSS評分均高于對照組，且隨著TBI嚴重程度的增加，評分依次增高（P＜0.05），且輕、中度TBI組大鼠在應用井穴放血療法后mNSS評分與相應的L和M組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同組別各指標比較 （n =8，±s）

表2 不同組別各指標比較 （n =8，±s）

組別 mNSS評分/分 PGC-1α TFAM mtDNA拷貝數(shù) 腦組織含水量L 組 5.75±1.751） 2.56±0.711） 2.40±0.971） 5.50±1.421） 0.788±0.0161）L+B 組 4.00±1.191）2） 3.13±0.871） 3.07±0.721） 7.82±3.201）2） 0.776±0.0121）M組 8.88±1.731） 2.49±0.781） 2.76±1.351） 5.03±3.361） 0.791±0.0091）M+B 組 6.63±2.131）2） 3.74±1.011）2） 3.41±1.481） 7.42±2.901）2） 0.780±0.0071）2）H組 10.63±2.071） 4.61±2.041） 3.64±0.711） 3.67±1.821） 0.797±0.0121）H+B 組 10.00±1.201） 5.47±1.951） 4.48±2.321） 4.00±1.831） 0.799±0.0151）

續(xù)表2

2.2 各基因表達及mtDNA拷貝數(shù)變化

TBI模型大鼠的PGC-1α和TFAM基因表達水平以及mtDNA拷貝數(shù)均高于對照組（P＜0.001）；輕度TBI組大鼠在應用井穴放血療法后，mtDNA拷貝數(shù)高于相應的未應用放血療法的大鼠（P＜0.05），中度TBI組大鼠在應用放血療法后PGC-1α基因表達水平和mtDNA拷貝數(shù)升高（P＜0.05），輕、重度TBI組大鼠在應用井穴放血療法后，雖然PGC-1α和TFAM基因表達水平均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 腦組織含水量

TBI后各組大鼠腦組織含水量與對照組比較均增加，且中度TBI組大鼠在應用井穴放血療法后腦組織含水量與相應的M組比較降低（P＜0.05），見表2。

3 討論

腦水腫TBI后常見的并發(fā)癥之一，常于發(fā)病后第2天達到高峰，主要由創(chuàng)傷造成的腦組織缺血、缺氧以及Na+-K+離子泵的功能障礙導致細胞水腫引起，其可造成顱內壓急劇增高，從而進一步使腦的血液灌注減少，病情加重，甚至導致腦疝威脅生命[7]。井穴位于人體的四肢末端，是十二經脈氣血起始之處，《醫(yī)宗金鑒-刺灸心法要訣》中指出：“商陽主刺卒中風，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中沖、關沖、少澤、商陽，使氣血流行，乃起死回生救急之妙穴”。放血療法最早的記載可見于《黃帝內經》，如“刺絡者，刺小絡之血脈也”；“菀陳則除之，出惡血也”，并明確地提出刺絡放血可以治療癲狂、頭痛、暴喑、熱喘及衄血等病證，與單純灸法比較，起除淤效果更佳。

本實驗結果表明，井穴放血可有效減輕輕度和中度TBI大鼠神經功能損傷癥狀，并降低TBI后腦水腫的嚴重程度，提示TBI后應用井穴放血療法可發(fā)揮腦保護作用。與苗笑梅和張靜莎等的研究結果類似，苗笑梅等[8]發(fā)現(xiàn)，十二井穴刺絡放血可以降低神經功能缺陷評分，減輕腦水腫，對創(chuàng)傷性大鼠腦組織有保護作用，張靜莎等[9]也發(fā)現(xiàn)，手十二井穴放血有改善重型顱腦創(chuàng)傷患者意識狀態(tài)的作用趨勢，但上述兩項研究均未深入探討相關機制。細胞內線粒體可通過氧化磷酸化為細胞活動提供能量，當創(chuàng)傷導致線粒體功能障礙時，可引起細胞內乳酸堆積并影響Na+-H+交換，促進腦水腫的發(fā)生[10]。為此本課題組進而檢測腦組織中線粒體生物合成相關基因表達及mtDNA拷貝數(shù)的變化，以期探索井穴放血療法發(fā)揮腦保護作用的靶點。

結果表明，TBI后組織中mtDNA拷貝數(shù)增加，提示創(chuàng)傷在造成線粒體損傷后，mtDNA發(fā)生代償性擴增。一方面，mtDNA是獨立存在于細胞器中的環(huán)狀基因組DNA，其在基因組之中的個數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)，由于線粒體DNA缺少組蛋白的保護，使其容易受到氧化應激、炎癥等危險因素的損害，造成及線粒體功能障礙[11-12]，TBI后，損傷本身及壞死的腦組織可誘導活性氧族（ROS）及炎癥因子的釋放增多[13]，使機體進入氧化應激狀態(tài)從而造成mtDNA損傷。另一方面，ROS在造成DNA損傷的同時，本身亦可以作為第二信使，觸發(fā)TFAM和NRF的表達，促進線粒體擴增，從而降低功能障礙mtDNA所占比例，代償能量供應水平的下降[14-15]。當應用井穴放血后，可見大鼠的PGC-1α基因以及下游的TFAM基因表達進一步升高，且mtDNA拷貝數(shù)提高，表明井穴放血可能是通過激活PGC及下游通路，促進mtDNA的生物合成，從而增強創(chuàng)傷腦組織的能量供應，改善腦水腫程度，發(fā)揮腦保護作用。同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)，對于重度TBI大鼠，單獨應用井穴放血療法時，雖然可一定程度上促進mtDNA拷貝數(shù)的增加，但并未改善神經功能損傷癥狀及腦水腫程度，這可能是由于重型TBI因損傷嚴重，會同時累及多條通路，多因素綜合作用導致腦水腫的發(fā)生，而單獨應用井穴放血療法尚不足以展現(xiàn)改善腦水腫的作用，提示在重型TBI時應多種治療策略共同施治，輔以井穴放血療法，或許能展現(xiàn)出更好的治療效果。

綜上所述，本實驗通過構建TBI大鼠模型，初步探討井穴放血對腦水腫及線粒體生物合成基因的影響，為解釋井穴放血發(fā)揮腦保護作用的機制提供基礎研究。但TBI的發(fā)病是多因素共同造成，其發(fā)生發(fā)展也涉及其他多條通路及靶基因，這仍有待挖掘。若能進一步探討井穴放血對其他通路的影響，或許可為TBI的臨床治療乃至開發(fā)井穴放血的新用途提供幫助。

[1] 江金文, 劉會云, 李美華. AQP4與創(chuàng)傷性腦水腫的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志, 2017, 44(2): 213-217.

[2] 胡捷先, 陳獻華. 腦缺血后谷氨酸通路及其調控的研究進展[J].復旦學報(醫(yī)學版), 2016, 43(6): 724-731.

[3] 付浩, 楊小颯, 余東堃, 等. 凋亡抑制劑zVAD對腦缺血再灌注小鼠外周血線粒體DNA拷貝數(shù)的影響[J]. 遵義醫(yī)學院學報,2016, 39(6): 593-596.

[4] MALAKHOVA L, BEZLEPKIN V G, ANTIPOVA V, et al. The increase in mitochondrial DNA copy number in the tissues of gamma-irradiated mice[J]. Cell Mol Biol Lett, 2005, 10(4): 721-732.

[5] 付浩, 孫中磊, 楊小颯, 等. 腦皮質撞擊法致創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型的構建[J]. 遵義醫(yī)學院學報, 2017, 40(1): 38-41.

[6] CHEN J, SANBERG P R, LI Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J]. Stroke, 2001, 32(11): 2682-2688.

[7] 宋海燕, 王仙麗, 伊生勇. 惡性腦梗死伴腦水腫的研究進展[J].武警后勤學院學報（醫(yī)學版）, 2016, 25(7): 593-596.

[8] 苗笑梅, 程世翔, 楊震, 等. 十二井穴刺絡放血聯(lián)合亞低溫治療對顱腦創(chuàng)傷急性期大鼠腦水腫的影響[J]. 中國應用生理學雜志,2015, 31(3): 249-253.

[9] 張靜莎, 郭義, 耿連岐. 手十二井穴刺絡放血、薏苡仁鼻飼聯(lián)合亞低溫對重型顱腦創(chuàng)傷影響的臨床療效評價的初步研究[J]. 世界中醫(yī)藥, 2016, 11(3): 510-514.

[10] 朱志安, 張紅, 高遠征. 創(chuàng)傷性腦水腫腦組織乳酸及線粒體SOD、MDA水平的變化[J]. 中國臨床神經外科雜志, 2000,5(2): 48-50.

[11] JOKINEN R, MARTTINEN P, STEWART J B, et al. Tissuespecific modulation of mitochondrial DNA segregation by a defect in mitochondrial division[J]. Hum Mol Genet, 2016, 25(4): 706-714.

[12] 向軍軍, 賴菁菁, 胡躍強. 近3年線粒體介導細胞凋亡的研究進展[J]. 中西醫(yī)結合心腦血管病雜志, 2016, 14(13): 1497-1499.

[13] KAWABORI M, YENARI M A. Inflammatory responses in brain ischemia[J]. Curr Med Chem, 2015, 22(10): 1258-1277.

[14] LUNA B, BHATIA S, YOO C, et al. Bayesian network and mechanistic hierarchical structure modeling of increased likelihood of developing intractable childhood epilepsy from the combined effect of mtDNA variants, oxidative damage, and copy number[J]. J Mol Neurosci, 2014, 54(4): 752-766.

[15] 付浩, 胡文靜, 王志宏, 等. 腦缺血再灌注小鼠線粒體DNA拷貝數(shù)與神經功能損傷相關性研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2017, 26(1): 4-6.