李睿瓊，侯立江，盧云澤，劉曼雙，許盛寶

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥是人類重要的糧食作物之一，對保障我國的糧食安全有至關(guān)重要的作用。小麥屬于喜涼作物，高溫氣候?qū)π←溕a(chǎn)影響較大[1-5]。小麥灌漿期對高溫脅迫尤為敏感，灌漿期遭遇高溫脅迫往往會造成小麥減產(chǎn)[2,5-8]。隨著全球變暖的不斷加劇以及“干熱風”等極端天氣的頻繁出現(xiàn)，小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展遭受巨大挑戰(zhàn)[9]。研究表明，氣溫每升高1 ℃，小麥平均減產(chǎn)6%[1]。因此，研究小麥耐熱機制，培育小麥耐熱品種已經(jīng)成為一個刻不容緩的課題。

高溫對小麥粒重的影響主要有兩個方面：(1)高溫脅迫使小麥籽粒衰老加速，灌漿時間縮短，最終造成粒重降低[10-12]；(2)高溫脅迫會降低與淀粉合成相關(guān)酶的活性[13,14]，抑制淀粉合成。淀粉是小麥籽粒的主要組成部分，是小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的決定性因素之一[15]。高溫對淀粉積累的影響被認為是熱脅迫下小麥粒重下降的關(guān)鍵問題，研究高溫脅迫對淀粉積累的影響對于理解與改良小麥耐熱性具有重要意義[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，相比于直鏈淀粉，小麥籽粒支鏈淀粉的合成在熱脅迫下受到的抑制更為嚴重，淀粉積累的減少主要是由于支鏈淀粉的下降[16-17]。高溫會引起小麥籽?？偟矸酆椭ф湹矸鄣臏p少，但目前關(guān)于高溫對籽粒直鏈淀粉影響的研究有不同的結(jié)果。趙輝等認為，35 ℃高溫對小麥籽粒直鏈淀粉含量幾乎無影響[18]；但周續(xù)蓮等對花后10～25 d的春小麥進行35 ℃高溫處理后，發(fā)現(xiàn)籽粒直鏈淀粉含量升高[19]。此外，高溫脅迫對小麥籽粒的淀粉顆粒形成也會造成顯著影響[20-22]，改變了籽粒淀粉的組分、淀粉顆粒大小及粒度分布。小麥籽粒的淀粉顆粒分為兩類：一種是A 型淀粉粒，直徑大于10 μm，呈凸透鏡狀，該淀粉粒的形成起始于籽粒發(fā)育初期；另一種是B 型淀粉粒，直徑小于10 μm，呈圓球狀[23-24]。小麥灌漿初期遭遇熱脅迫后B型淀粉粒比例降低，A型淀粉粒比例升高[21]。高溫下A型和B型淀粉顆粒均減少，但后者更明顯，造成A型和B型淀粉粒比例升高[22]。不同實驗的供試品種(系)對高溫脅迫的應(yīng)對策略不同，這可能是造成這些研究結(jié)果不一的原因之一。

目前，有關(guān)高溫對不同耐熱性小麥籽粒淀粉顆粒影響的研究還未見報道。本實驗以3個耐熱性不同的小麥品種(系)[44(耐熱)、94(熱敏感)和中國春(熱敏感)]為材料，在開花后15 d進行熱脅迫(晝/夜溫度37/17 ℃，14/10 h)至成熟，探究熱脅迫對不同耐熱性小麥淀粉積累的影響，以期進一步揭示小麥的耐熱機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

本實驗室前期對從ICARDA(International Center for Agricultural Search in the Dry Areas，國際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心)引進的多個小麥品系進行了多年多點分期播種，并以千粒重減少率為標準鑒定了這些品系的耐熱性。本研究選取其中耐熱的44號小麥品系(以下簡稱44)和熱敏感的94號小麥品系(以下簡稱94)以及中國春(公認的熱敏感小麥，簡稱CS)為實驗材料。

2016年9-12月在西北農(nóng)林科技大學(xué)溫室將小麥種植于塑料盆缽(26 cm×26 cm×20 cm)中，每盆裝營養(yǎng)土2.6 kg，播種9粒小麥，每個實驗材料種植8盆，按常規(guī)栽培措施進行管理，小麥生長中控制白粉病和蚜蟲，保持良好水分供應(yīng)。選取開花時間和生長一致的小麥在開花后12 d轉(zhuǎn)移到人工氣候培養(yǎng)箱(型號RDN-1000D-4，寧波東南儀器有限公司)進行2 d生長適應(yīng)(24/17 ℃，14/10 h)后，每份材料的一半(4盆)小麥植株轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)箱，進行熱脅迫處理(37/17 ℃，14/10 h)至成熟；另一半小麥植株仍留在原培養(yǎng)箱，作為對照。小麥品系44播種時間為2016年9月14日，開花時間為2016年12月11日，對照組處理時間為2016年12月26日-2017年1月20日，熱脅迫處理時間為2016年12月26日至2017年1月18日；小麥品系94播種時間為2016年9月30日，開花時間為2017年1月3日，對照組處理時間為2017年1月18日至2017年2月14日，熱脅迫處理時間為2017年1月18日至2017年2月10日；CS春播種時間為2016年9月14日，開花時間為2016年12月12日，對照組處理時間為2016年12月27日至2017年1月21日，熱脅迫處理時間為2017年1月27日至2017年2月13日。日期記錄有前后1 d的誤差。取成熟穗用于實驗分析。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 生育期與粒重統(tǒng)計

主莖抽穗后每天觀察、掛牌標注每穗開花期，穗軸完全變黃時記錄成熟期，剪下成熟穗用于后續(xù)研究。選單穗分別脫粒稱重，計算平均千粒重。

1.2.2 小麥籽粒淀粉顆粒的觀察和粒徑的統(tǒng)計

取各小麥品種(系)對照和熱脅迫處理的穗中部籽粒。用解剖刀在籽粒中部橫向斷開，使籽粒產(chǎn)生自然裂開的橫斷面，取厚度約3 mm的橫切片，直接將橫切片用黑色雙面膠粘在掃描電鏡樣品臺上，自然斷裂的橫斷面向上，使用離子濺射儀鍍金膜后，用JEOL JSM-6360LV掃描電鏡對籽粒橫斷面胚乳淀粉進行觀察并拍照。均勻選取籽粒橫截面各部分(約15個視野)進行觀察拍照，每個材料的熱脅迫處理與對照至少取三個樣品進行觀察統(tǒng)計。

每個材料每種處理下約拍攝50張照片(×700)，使用圖像分析軟件Image J測量每張圖片中所有的完整可見淀粉顆粒(除去極小和變形的淀粉顆粒)最大直徑。為了比較各實驗材料不同條件下淀粉顆粒粒徑的變化趨勢，從測得的所有粒徑數(shù)據(jù)中按比例選取相同的數(shù)據(jù)量(約1 000個左右)繪制粒徑曲線圖。

1.2.3 籽?？偟矸酆康臏y定

將小麥籽粒置于研缽內(nèi)研磨成粉，過0.5 mm篩，取100 mg使用總淀粉試劑盒(K-TSTA,Megazyme,Wicklow,Ireland)測定總淀粉含量[25]，每個樣品三次重復(fù)。

1.2.4 直鏈淀粉/支鏈淀粉比例的測定

將小麥籽粒置于研缽內(nèi)研磨成粉，過180 μm篩，取20.0～25.0 mg用直鏈淀粉/支鏈淀粉淀粉試劑盒(K-AMYL,Megazyme,Wicklow,Ireland)測定籽粒直鏈淀粉的含量(%，w/w)[26]，并計算出直/支比，每個樣品三次重復(fù)。

1.2.5 每千粒直鏈淀粉和支鏈淀粉積累量的計算

直鏈淀粉積累量=千粒重×總淀粉含量×直鏈淀粉的含量

支鏈淀粉積累量=千粒重× 總淀粉含量×(1-直鏈淀粉的含量)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理；T測驗用于檢測差異顯著性；用Excel 2013制作淀粉顆粒粒徑分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌漿期高溫對小麥籽粒發(fā)育的影響

熱脅迫后，各品種(系)的灌漿期都不同程度縮短，其中熱敏感材料94和中國春縮短幅度較大，但差異不顯著(表1)。熱脅迫導(dǎo)致熱敏感材料94和中國春的粒重顯著下降，但并未引起耐熱材料44粒重發(fā)生顯著變化。這表明熱脅迫對熱敏感小麥的灌漿過程產(chǎn)生了顯著影響。

2.2 灌漿期高溫對小麥籽粒淀粉含量及直/支比的影響

與對照相比，熱脅迫下，耐熱材料44及熱敏感材料94和CS的籽粒總淀粉含量分別下降1.39%、5.89%和5.98%，其中44變化不顯著，94和CS變化均極顯著(表2)。這表明熱脅迫對熱敏感小麥品種的淀粉積累造成顯著影響。

熱脅迫后，耐熱材料44的直鏈淀粉含量較對照極顯著減少，而兩個熱敏感材料94和CS均極顯著增加；44的直/支比間顯著下降，而熱敏感材料均極顯著上升(表2)。這說明熱脅迫對耐熱性不同小麥的直鏈和支鏈淀粉合成的影響顯著不同。

表1 不同小麥品種(系)在熱脅迫和對照條件下的灌漿期時間、千粒重和灌漿速率Table 1 Grain filling duration,thousand kernel weight and filling rate under heat stress

*和**分別表示同一材料不同處理間差異顯著。表2、表3同。

* and ** indicate the significant difference between heat stress and control for a same material at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same in table 2 and table 3.

2.3 灌漿期高溫對小麥籽粒直鏈淀粉與支鏈淀粉積累量的影響

熱脅迫后小麥籽粒直鏈淀粉和支鏈淀粉積累量較對照都極顯著下降，其中支鏈淀粉降幅較大。不同耐熱性小麥材料支鏈淀粉積累量對熱脅迫的反應(yīng)不同(表3)，熱脅迫后耐熱材料44僅減少2.03%，熱敏感材料94和CS分別下降20.25%和32.7%。這表明高溫脅迫下小麥籽粒支鏈淀粉合成的減少是千粒重降低的主要因素，而且支鏈淀粉變化程度與品種(系)耐熱性相關(guān)。

2.4 灌漿期高溫對小麥籽粒淀粒粒徑的影響

三個小麥材料的籽粒淀粉粒徑在2～35 μm的范圍內(nèi)變化(圖1)。對照條件下，熱敏感材料粒徑為8～14μm的淀粉粒極少；耐熱材料44的淀粉粒中A型和B型淀粉粒之間的分界不明顯，粒徑為8～14 μm的淀粉顆粒明顯多于熱敏感品種(系)。熱脅迫后，耐熱品系44的淀粉粒徑?jīng)]有明顯改變；而熱敏感材料94和CS的A型淀粉顆粒的粒徑明顯減小，粒徑為8～14 μm的淀粉粒增多(圖1和圖2)。這些結(jié)果表明，不同耐熱性小麥的淀粉粒徑分布對熱脅迫的反應(yīng)存在顯著差異。

表2 對照和熱脅迫條件下供試小麥總淀粉含量、直鏈淀粉比例和直/支比Table 2 Changes in starch composition under heat stress

*：P<0.05;**:P<0.01.

圖1 熱脅迫對小麥籽粒淀粉顆粒粒徑的影響

表3 熱脅迫后小麥材料籽粒中直鏈淀粉及支鏈淀粉積累量的變化Table 3 Changes of amylose and amylopectin weight per 1 000 grains of each wheat lines after heat stress

**：P<0.01.

黑色箭頭指示熱脅迫條件下中間大小(8～14 μm)的淀粉粒。A：對照條件下小麥材料44的籽粒淀粉顆粒；B：熱脅迫條件下小麥材料44的籽粒淀粉顆粒；C：對照條件下小麥材料94的籽粒淀粉顆粒；D：熱脅迫條件下小麥材料94的籽粒淀粉顆粒； E：對照條件下CS的籽粒淀粉顆粒；F：熱脅迫條件下CS的籽粒淀粉顆粒。

The black arrows indicate the intermediate granules. A:Grain starch granules of wheat material 44 under control condition;B:Grain starch granules of wheat material 44 under heat stress; C:Grain starch granules of wheat material 94 under control condition;D:Grain starch granules of wheat material 94 under heat stress; E:Grain starch granules of Chinese Spring wheat under control condition;D:Grain starch granules of Chinese spring wheat under heat stress.

圖2熱處理對小麥籽粒胚乳淀粉顆粒的影響

Fig.2Grainstarchgranulealterationsinheatstress

3 討 論

淀粉是小麥籽粒的主要組成部分，其變化直接影響小麥的粒重與品質(zhì)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫處理后，小麥籽粒的總淀粉、直鏈淀粉含量均呈下降趨勢。但不同耐熱性小麥的直/支比變化存在差異，耐熱小麥的直/支比下降，而熱敏感小麥表現(xiàn)則相反，推測可能熱敏感小麥籽粒中支鏈淀粉比直鏈淀粉下降更為顯著。本研究結(jié)果表明，支鏈淀粉合成過程更容易受到熱脅迫影響，這與前人的研究結(jié)果一致[12,16-17,20]。

熱脅迫對小麥籽粒淀粉顆粒的大小也有影響[16,27]。Wang等發(fā)現(xiàn)，在熱脅迫下，A型淀粉顆粒數(shù)量和粒徑均有所降低，B型淀粉顆粒的粒徑變小，數(shù)量增多[17,20]，這與HURKMAN等[20]的研究結(jié)果一致。在本研究中，熱脅迫處理后，熱敏感小麥的A型淀粉顆粒粒徑降低，但一些中間型淀粉顆粒(8～14 μm)的數(shù)量顯著增加；而耐熱小麥品系淀粉粒粒徑?jīng)]有明顯改變。A型顆粒的合成在開花后4 d開始，生長和發(fā)育階段持續(xù)約20 d；而B型顆粒合成始于開花后10 d，開花后20 d開始有明顯的顆粒生長[28]。Evers[29]觀察發(fā)現(xiàn)，A型淀粉粒先形成一個核，然后再一層一層裝配，直至形成大的A型淀粉粒。因此，本研究推測這些中間型淀粉顆粒應(yīng)屬于A型淀粉顆粒，熱脅迫阻礙了其裝配增大過程，一方面導(dǎo)致A型淀粉粒粒徑減小，另一方面導(dǎo)致中等大小的淀粉粒堆積，數(shù)目增多，這些中等高大小淀粉粒在正常條件下本可以繼續(xù)一層層裝配成更大的A型淀粉粒。有趣的是，在正常條件下，耐熱小麥存在更多的中等大小淀粉顆粒，熱脅迫后淀粉顆粒大小變化不顯著，這表明不同耐熱性小麥的淀粉顆粒的對熱脅迫的響應(yīng)存在差異。在未來的研究中，這種特征可被用來篩選耐熱小麥種質(zhì)。此外，B型顆粒粒徑似乎不受熱脅迫的影響，表明具有高比例的B型顆粒的小麥也可能表現(xiàn)出更好的耐熱性，但需要進一步研究證明。

目前，有關(guān)熱脅迫對小麥淀粉顆粒影響的研究較多，但不同的研究結(jié)果不一，這可能與所選小麥品種本身的耐熱性相關(guān)。本研究以不同耐熱性小麥為研究材料，證實了不同耐熱性小麥響應(yīng)熱脅迫的方式存在差異。其中，A型淀粉在對熱脅迫應(yīng)答中是不同小麥材料的一個重要特征，這為高溫下小麥淀粉積累過程提供了新的理解，也為今后小麥耐熱研究工作奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

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