楊漫宇,楊足君,楊武云，楊恩年

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，四川成都 610066； 2.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 611731)

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，小麥生產(chǎn)的安全性對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定均具有重要意義。而小麥-外源染色體易位新種質(zhì)的創(chuàng)制對(duì)于培育突破性新品種具有舉足輕重的作用。有關(guān)染色體易位的研究，主要涉及小麥與其近緣種屬間的染色體易位，如黑麥屬[1-3]、簇毛麥屬[4-5]、偃麥草屬[6]等。由于大部分小麥-外源易位系都是非同源染色體間易位，補(bǔ)償性差，基因組重復(fù)或缺失，導(dǎo)致其農(nóng)藝性狀差，很難直接用于小麥品種改良[7]。在利用異源染色體易位培育新品種方面，以小麥-黑麥1RS·1BL、小麥-簇毛麥6VS·6AL以及小偃6號(hào)中的小麥-長(zhǎng)穗偃麥草易位這3個(gè)易位系的應(yīng)用最為成功。目前，利用1RS·1BL和6VS·6AL易位培育出的小麥新品種，在世界上數(shù)十個(gè)國家中推廣應(yīng)用[8-9]。在我國，以小麥-黑麥1RS·1BL易位系為親本，育成了豐抗號(hào)、矮孟牛系列、魯麥8 號(hào)、魯麥11 號(hào)等一系列抗逆、抗病、高產(chǎn)小麥品種[10]；以小麥-簇毛麥6VS·6AL易位系為親本，育成了南農(nóng)9918、石麥14、揚(yáng)麥18、內(nèi)麥系列等一批小麥品種[9,11]；以小偃6號(hào)為親本育成并大面積推廣的品種已知有49個(gè)[12]。然而，在利用小麥-異源易位染色體的同時(shí)，還應(yīng)關(guān)注小麥染色體之間的易位。例如，歐洲培育的小麥品種大多含有5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體，推測(cè)這對(duì)相互易位染色體可能更適應(yīng)歐洲氣候條件[13-14]。大量的研究表明[15-20]，雙重或多重易位系具有良好的抗病性或優(yōu)異的農(nóng)藝性狀特性，能夠用于小麥育種改良。如小麥-黑麥-簇毛麥純合雙重易位系(1RS·1BL，6VS·6AL)和小麥-黑麥-簇毛麥純合三重易位系(1RS·7DS，1BL·7DL，6VS·6AL)具有良好的農(nóng)藝性狀和白粉病抗性[15-17]；小麥-簇毛麥-小傘山羊草雙重易位系(6VS·6AL，6AL·6AS-6US)育性優(yōu)良且抗白粉病[18]；小麥-黑麥-長(zhǎng)穗偃麥草雙重易位系(1RS·1BL，7DL-7Ai)抗病性好、耐旱、產(chǎn)量高[19]；小麥-黑麥三重易位(5BS·7BS，5BL·7BL， 4BL·5RL )對(duì)銅元素具有高效利用率[20]。亓增軍等[17]認(rèn)為，將不同類型的小麥易位系聚合到同一遺傳背景，培育多重易位系，不僅能提高品種的抗性，還能拓寬品種的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)小麥的品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新都具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。Belan等[19]報(bào)道，小麥-黑麥-長(zhǎng)穗偃麥草雙重易位系Lutescens 242/97-2-10在俄羅斯登記命名為春小麥品種Omskaya 41且已進(jìn)入品種試驗(yàn)。然而，利用小麥染色體間的多重易位培育小麥品種(系)的報(bào)道還較少。鑒于此，本研究利用分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法對(duì)四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所育成的小麥品種及高代品系進(jìn)行分析鑒定，以期篩選出多重易位品種(系)，為小麥染色體間多重易位染色體在小麥育種中的應(yīng)用提供證據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為小麥品種川麥62以及兩個(gè)高代品系16EW381和16EW458，均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所創(chuàng)制。四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所鑒定川麥62高抗條銹病、高感白粉病。16EW381和16EW458選自于雜交組合內(nèi)麥8號(hào)/2*川麥62，其中，內(nèi)麥8號(hào)是6VS·6AL易位系[9]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根尖中期細(xì)胞染色體制片

將待鑒定的種子置于墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽(22～24 ℃)，待根尖長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)取根，冰水處理22～24 h后，用卡諾氏固定液固定7 d，70%的酒精保存。酶解制片方法參照Han等[21]描述的方法：根尖放入酶液37 ℃水浴50～60 min；用70%酒精洗凈酶液，搗碎根尖；低速離心，倒掉酒精；適量冰醋酸重懸浮細(xì)胞；滴片，晾干；鏡檢觀察。

1.2.2 FISH鑒定

利用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1[22]對(duì)川麥62及其高代品系16EW381和16EW458的根尖中期染色體進(jìn)行非變性FISH(ND-FISH)分析。寡核苷酸探針按照Tang等[22]描述的方法在序列5′末端加上6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein, 6-FAM)或6-羧基四甲基若丹明(6-carboxytetramethylrhodamine, Tamra)標(biāo)記成綠色或紅色，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。寡核苷酸探針序列詳見表1。原位雜交程序參照Fu等[23]描述的方法：將適量的探針加入2×SSC/1×TE Buffer中充分混勻備用，每張玻片加10 μL的雜交液后置于42 ℃恒溫箱中雜交1 h，雜交好的玻片于2×SSC溶液中洗脫(室溫)，晾干后加10 μL含PI或DAPI的抗褪色劑進(jìn)行染色，幾分鐘后使用OLYMPUS BX51熒光顯微鏡觀察并照相。

1.2.3 產(chǎn)量比較與抗病性鑒定

產(chǎn)量比較試驗(yàn)：試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小區(qū)計(jì)產(chǎn)面積為13 m2，每個(gè)小區(qū)8行，行長(zhǎng)6.5 m，行距25 cm，播種量以180萬株·hm-2為標(biāo)準(zhǔn)。以川麥62為對(duì)照。

條銹病抗性鑒定：采用條銹病生理小種條中30號(hào)、條中31號(hào)、條中32號(hào)及水源11的混合菌種接種誘發(fā)材料川育12，菌種由甘肅省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所賈秋珍提供。待供試材料充分發(fā)病時(shí)進(jìn)行觀察并記載反應(yīng)型(infection type，IT)，按0、0;、1、2、3、4六級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載，其中，0、0;、1、2為抗病反應(yīng)型，3和4為感病反應(yīng)型[24]。白粉病抗性鑒定：采用田間自然發(fā)病法，待供試材料充分發(fā)病時(shí)采用0～9級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記載，其中，0為免疫，0;為近免疫，1～2為高抗，3～4為中抗，5～6為中感，7～9為高感[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種川麥62的細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果

隨機(jī)選取10粒川麥62種子進(jìn)行根尖有絲分裂中期染色體的ND-FISH分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10粒種子的染色體數(shù)目均為2n=42。以Tang等[22]利用寡核苷酸探針建立的中國春和綿陽11的標(biāo)準(zhǔn)核型作參考，分析發(fā)現(xiàn)，川麥62含一對(duì)5BS·7BS易位染色體以及一對(duì)5BL·7BL易位染色體(圖1)，而且10粒種子都含有這兩對(duì)相互易位染色體。

2.2 高代品系16EW381和16EW458的產(chǎn)量及抗病性

為了利用高抗白粉病的6VS·6AL易位系品種內(nèi)麥8號(hào)改良川麥62高感白粉病的缺點(diǎn)，本課題組用川麥62與內(nèi)麥8號(hào)雜交、回交，選育出了高代穩(wěn)定品系16EW381和16EW458。2017年度品種比較試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，16EW381和16EW458的產(chǎn)量分別為5 365.50和5 160.30kg·hm-2，兩者產(chǎn)量在0.05水平上均顯著高于親本川麥62的產(chǎn)量(4 468.95 kg·hm-2)。抗病性鑒定結(jié)果(表2)表明，16EW381高抗條銹病和白粉病，16EW458中抗條銹病和高抗白粉病，川麥62高抗條銹病和高感白粉病。說明16EW381和16EW458比親本川麥62在產(chǎn)量和抗病性方面都得到了顯著改善。

表1 寡核苷酸探針序列Table 1 Sequences of oligonucleotide probes

圖A中，以O(shè)ligo-pTa535(紅色信號(hào))和Oligo-pSc119.2(綠色信號(hào))作探針，染色體被DAPI染為藍(lán)色；圖B中，以O(shè)ligo-(GAA)7(黃色信號(hào))作探針，染色體被PI染為紅色；紅色箭頭示5BS·7BS易位染色體，綠色箭頭示5BL·7BL易位染色體；圖C中，易位染色體來源于圖A和圖B；標(biāo)尺為10 μm。

In Fig.A,the Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green) were used as ND-FISH probes,and chromosomes were counterstained with DAPI(blue);In Fig.B,the Oligo-(GAA)7(yellow) were used as ND-FISH probes,and chromosomes were counterstained with PI(red);Red arrows indicate 5BS·7BS translocation chromosomes;Green arrows indicate 5BL·7BL translocation chromosomes；Translocation chromosomes in Fig.C were from Fig.A and Fig.B;Bar indicates 10 μm.

圖1川麥62根尖中期染色體的ND-FISH分析

Fig.1ND-FISHanalysisofmetaphasechromosomesinroot-tipofChuanmai62

2.3 高代品系16EW381和16EW458的細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果

為了進(jìn)一步明確16EW381和16EW458的染色體組成，隨機(jī)從這兩個(gè)品系及內(nèi)麥8號(hào)中各選取10粒種子進(jìn)行根尖中期染色體的ND-FISH分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16EW381和16EW458染色體數(shù)目均為2n=42(圖3)；16EW458含有來自于親本內(nèi)麥8號(hào)的一對(duì)6VS·6AL易位染色體及來自于親本川麥62的一對(duì)5BS·7BS易位染色體和一對(duì)5BL·7BL易位染色體(圖1、圖2和圖3A～3C)；16EW381除了含有來自雙親的6VS·6AL易位染色體、5BS·7BS易位染色體和5BL·7BL易位染色體以外，還發(fā)現(xiàn)有3B和5A染色體間發(fā)生的相互易位染色體，即3BS·5AS易位染色體和3BL·5AL易位染色體(圖1、圖2和圖3D～3F)。說明16EW381和16EW458的遺傳背景中都成功地轉(zhuǎn)入了6VS·6AL易位染色體，其中，16EW458是含有6VS·6AL、5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體的三重易位系；16EW381是含有6VS·6AL、5BS·7BS、5BL·7BL、3BS·5AS和3BL·5AL易位染色體的五重易位系。

表2 產(chǎn)量比較和抗病性鑒定結(jié)果Table 2 Results of yield comparison and identification of resistance to stripe rust and powdery mildew

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異在0.05水平顯著；HR：高抗；MR：中抗；HS：高感。

Different letters following the data indicated the difference was significant at 0.05 level；HR:High resistance;MR:Moderate resistance;HS:High susceptibility.

圖A中，以O(shè)ligo-pTa535(紅色信號(hào))和Oligo-pSc119.2(綠色信號(hào))作探針，染色體被DAPI染為藍(lán)色；圖B中，以O(shè)ligo-(GAA)7(紅色信號(hào))作探針，染色體被DAPI染為藍(lán)色；箭頭示6VS·6AL易位染色體；圖C中，易位染色體來源于圖A和圖B；標(biāo)尺長(zhǎng)度為10 μm。

In Fig.A,the Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green) were used as ND-FISH probes,and chromosomes were counterstained with DAPI(blue);In Fig.B,the Oligo-(GAA)7(red) were used as ND-FISH probes,and chromosomes were counterstained with DAPI(blue);Arrows indicate 6VS·6AL translocation chromosomes;Translocation chromosomes in Fig.C were from Fig.A and Fig.B;Bar indicates 10 μm.

圖2內(nèi)麥8號(hào)根尖中期染色體的ND-FISH分析

Fig.2ND-FISHanalysisofmetaphasechromosomesinroot-tipofNeimai8

圖A和D中，以O(shè)ligo-pTa535(紅色信號(hào))和Oligo-pSc119.2(綠色信號(hào))作探針，染色體被DAPI染為藍(lán)色；圖B和E中，以O(shè)ligo-(GAA)7(紅色信號(hào))作探針，染色體被PI染為紅色；白色箭頭指示6VS·6AL易位染色體；紅色箭頭指示5BS·7BS易位染色體；綠色箭頭指示5BL·7BL易位染色體；黃色箭頭指示3BS·5AS易位染色體；紫色箭頭指示3BL·5AL易位染色體；圖C中，易位染色體來源于圖A和圖B；圖F中，易位染色體來源于圖D和圖E，3B和5A染色體分別來源于圖1A和圖1B；標(biāo)尺長(zhǎng)度為10 μm。

In Fig.A and D,the Oligo-pTa535(red) and Oligo-pSc119.2(green) were used as ND-FISH probes,and chromosomes were counterstained with DAPI(blue);In Fig.B and E,the Oligo-(GAA)7(yellow) were used as ND-FISH probes,and chromosomes were counterstained with PI(red);White arrows indicate 6VS·6AL translocation chromosomes;Red arrows indicate 5BS·7BS translocation chromosomes;Green arrows indicate 5BL·7BL translocation chromosomes;Yellow arrows indicate 3BS·5AS translocation chromosomes;Purple arrows indicate 3BL·5AL translocation chromosomes;Translocation chromosomes in Fig.C were from Fig.A and Fig.B;In Fig.F, translocation chromosomes were from Fig.D and Fig.E,and chromosomes 3B and 5A were from Fig.1A and Fig.1B,respectively;Bar indicates 10 μm.

圖316EW458(A、B和C)和16EW381(D、E和F)根尖中期染色體的ND-FISH分析

Fig.3ND-FISHanalysisofmetaphasechromosomesinroot-tipof16EW458(A,BandC)and16EW381(D,EandF)

3 討 論

3.1 熒光原位雜交技術(shù)快速鑒定小麥多重易位系輔助育種選擇

通過染色體易位將外源優(yōu)異基因?qū)胄←準(zhǔn)切←溒贩N改良的重要途徑之一，而外源遺傳物質(zhì)及小麥基因組本生狀態(tài)的準(zhǔn)確鑒定對(duì)育種工作者顯得十分重要。以重復(fù)序列作探針的FISH技術(shù)作為識(shí)別小麥染色體的一個(gè)強(qiáng)有力工具被廣泛應(yīng)用。利用重復(fù)序列pSc119.2和Afa 家族進(jìn)行FISH分析, Kubalakova等[26]和Sepsi等[27]成功地識(shí)別了小麥所有染色體。Komuro等[28]利用重復(fù)序列pSc119.2、pTa-535以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列GAA對(duì)小麥A、B、D染色體組進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定。Tang 等[22]利用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535分別建立了小麥品種中國春和綿陽11的標(biāo)準(zhǔn)核型圖。本研究采用FISH技術(shù)對(duì)材料進(jìn)行分析，準(zhǔn)確鑒定出每個(gè)材料的染色體組成：川麥62含有5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體； 16EW458含有6VS·6AL、5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體；16EW381含有6VS·6AL、5BS·7BS、5BL·7BL、3BS·5AS和3BL·5AL易位染色體。因此，在小麥多重易位染色體的聚合過程中，利用FISH技術(shù)輔助育種選擇，確認(rèn)被鑒定個(gè)體的染色體組成與結(jié)構(gòu)變異, 可以實(shí)現(xiàn)早期定向選擇，加快小麥多重易位系選育及新品種(系)培育進(jìn)程。

3.2 多重易位系的應(yīng)用價(jià)值

在小麥品種改良中，除了利用與其近緣種屬的種間染色體易位外，小麥種內(nèi)染色體相互易位的應(yīng)用也較為成功，如5BS·7BS和5BL·7BL。研究發(fā)現(xiàn)，該雙重易位的5BS染色體臂上含有條銹病成株抗性基因[13,29]，Law等[13]認(rèn)為，正是由于該抗性基因使得5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體廣泛存在于許多歐洲冬小麥品種中，如法國冬小麥品種Cappelle-Desprez。本研究的細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果表明，川麥62是5BS·7BS和5BL·7BL雙重易位系。根據(jù)來源，川麥62的選育雜交組合為Fr3/2*SW1862，其中，母本Fr3是引進(jìn)的法國強(qiáng)冬性高抗條銹病優(yōu)質(zhì)材料，父本SW1862來源于自育選系。經(jīng)細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果表明，F(xiàn)r3含有5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體，而SW1862不含有該易位染色體，這說明川麥62中雙重易位染色體來自于法國材料Fr3。因此，我們推測(cè)川麥62的條銹病抗性可能來自于5BS上的成株抗性基因。

由于簇毛麥6VS上攜帶有白粉病抗性基因 Pm21，自1995年以來， 6VS·6AL易位系在中國及其他23個(gè)國家中對(duì)已知的白粉病生理小種均表現(xiàn)免疫，在世界范圍內(nèi)廣受小麥育種家的關(guān)注[30]。在中國，由于優(yōu)良的白粉病抗性，6VS·6AL易位系作為親本被廣泛應(yīng)用于小麥育種工程。據(jù)報(bào)道，6VS·6AL易位系品種在國內(nèi)的種植面積已超過340萬hm2[30]。本研究中，為了改良小麥品種川麥62高感白粉病的特性，利用川麥62與6VS·6AL易位系品種內(nèi)麥8號(hào)雜交并回交，成功選育出了產(chǎn)量高于親本川麥62且抗條銹病和白粉病的高代品系16EW381和16EW458。FISH分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)高代品系為多重易位系，不僅成功地引進(jìn)了6VS·6AL易位染色體，使川麥62的白粉病抗性得到改良，同時(shí)也聚合了川麥62的5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體。在高代品系16EW381中，還發(fā)現(xiàn)了3BS·5AS和3BL·5AL新易位染色體，我們認(rèn)為該新易位的產(chǎn)生可能是6VS·6AL、5BS·7BS和5BL·7BL易位染色體聚合過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的，但誘導(dǎo)易位形成的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外，3BS·5AS和3BL·5AL易位是否在抗性或農(nóng)藝性狀方面存在利用價(jià)值，能否如5BS·7BS和5BL·7BL易位一樣被廣泛應(yīng)用也有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，多重易位系將不同類型的小麥易位染色體聚合到同一遺傳背景培育，使優(yōu)異基因得到累加和聚合，提高品種的抗性、增進(jìn)小麥遺傳變異是切實(shí)可行的，本研究將為今后的小麥育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供一個(gè)新的方向。

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