藍(lán)蔚青 王 蒙 陳夢玲 謝 晶

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 3. 上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 201306； 4. 食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心﹝上海海洋大學(xué)﹞，上海 201306)

水產(chǎn)品肉質(zhì)細(xì)膩，口感較好，是人類重要的動物蛋白源，受到消費者青睞。然而，由于其肌肉組織柔軟，水分、不飽和脂肪酸與可溶性蛋白含量高，同時從捕撈至加工銷售過程中易受污染，發(fā)生腐敗[1]。相關(guān)報道[2]顯示，微生物活動是引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主因，其中腐敗菌為關(guān)鍵“貢獻(xiàn)者”。

由于水產(chǎn)品的加工貯藏條件差異較大，不同水產(chǎn)品均有其特定的微生物類型，且只有部分微生物參與腐敗過程，并逐漸占主導(dǎo)地位，這些微生物就是其特定腐敗菌(Specific Spoilage Organisms, SSO)[3]。特定腐敗菌繁殖速度快，產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物能力強(qiáng)，甚至?xí)卓蛊渌?xì)菌的生長。通常情況下，水產(chǎn)品的機(jī)體組織內(nèi)部無菌，但其在捕撈、加工與流通等過程中會被微生物污染，大黃魚、羅非魚、大菱鲆、鱸魚、凡納濱對蝦與虹鱒魚等水產(chǎn)品中的SSO多為革蘭氏陰性菌[4]。同時，貯藏與加工方法不同，其優(yōu)勢腐敗菌也存在差異。研究[5]表明，以腐敗希瓦氏菌等為主的SSO數(shù)量及種類同水產(chǎn)品貨架期顯著關(guān)聯(lián)。可見，開展特定腐敗菌群體感應(yīng)研究有利于水產(chǎn)品低溫流通與加工方法優(yōu)化密切相關(guān)。

近年來，部分研究[6-8]表明，群體感應(yīng)現(xiàn)象在各類食品變質(zhì)過程中被發(fā)現(xiàn)，腐敗菌作用與群體感應(yīng)密不可分。隨著對水產(chǎn)品中的微生物群體感應(yīng)機(jī)制與其腐敗間相關(guān)性研究的不斷深入，群體感應(yīng)系統(tǒng)參與微生物活動的調(diào)控機(jī)制也得到不斷完善。因此，研究群體感應(yīng)現(xiàn)象，對于靶向抑菌與提升水產(chǎn)品品質(zhì)方面具有重要的經(jīng)濟(jì)效益與社會價值。群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)是細(xì)胞交流的重要方式之一，是菌體細(xì)胞間的通訊機(jī)制，通常與菌體細(xì)胞密度有關(guān)。許多細(xì)菌能產(chǎn)生、分泌應(yīng)答信號分子，當(dāng)信號分子濃度達(dá)到閾值濃度時，細(xì)菌就會檢測到其存在并與受體結(jié)合，導(dǎo)致生物發(fā)光、毒性因子分泌、生物膜形成和抗生素合成等基因的表達(dá)[9-10]。其中，F(xiàn)UQUA等[11]定義了細(xì)菌群體感應(yīng)現(xiàn)象的產(chǎn)生與積累產(chǎn)生細(xì)菌反應(yīng)化學(xué)信號的現(xiàn)象有關(guān)，群體感應(yīng)現(xiàn)象還先后在弧菌、農(nóng)桿菌、銅綠假單胞菌與胡蘿卜軟腐歐文氏菌等微生物有機(jī)體中被發(fā)現(xiàn)。本文擬從水產(chǎn)品中群體感應(yīng)的自誘導(dǎo)分子、群體感應(yīng)機(jī)制研究動態(tài)、抑制劑的分類與作用機(jī)理、存在問題等方面進(jìn)行分析，以期為水產(chǎn)品貯藏保鮮提供參考。

1 水產(chǎn)品中群體感應(yīng)自誘導(dǎo)分子(Autoinducers, AIs)

群體感應(yīng)通過細(xì)胞信號分子進(jìn)行溝通，隨著細(xì)菌種群密度的增加，化學(xué)信號分子在環(huán)境中積累。大多數(shù)細(xì)菌可產(chǎn)生、釋放、檢測并響應(yīng)化學(xué)信號分子而協(xié)調(diào)細(xì)菌群體行為，這些信號分子也稱自誘導(dǎo)分子[12]。群體感應(yīng)系統(tǒng)有AI、受體和受體蛋白3個基本組成。目前，群體感應(yīng)研究主要從AI入手，根據(jù)AI的性質(zhì)與感應(yīng)模式不同，可將細(xì)菌QS系統(tǒng)分為不同類型，如存在于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及兩者皆存在的現(xiàn)象。目前水產(chǎn)品QS系統(tǒng)中研究較多的信號分子主要有AI-1、AI-2、DKPs、AIPs與其他信號分子等。

1.1 AI-1

AI-1即N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactones, AHLs)，為革蘭氏陰性菌中主要的自誘導(dǎo)因子。AHLs類自誘導(dǎo)因子種類較多，但均具有共同的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，所有AHLs的特異性都由其?；鶄?cè)鏈的碳鏈長度和第3個羰基碳取代基團(tuán)決定[13]。最初，Asad等[14]在海洋費氏弧菌發(fā)光現(xiàn)象的研究中發(fā)現(xiàn)了由AHLs調(diào)控的群體感應(yīng)LuxI/LuxR系統(tǒng)模式。其中，LuxI蛋白是自誘導(dǎo)物合成酶，催化生成AHLs信號分子。一般短鏈的AHLs分子擴(kuò)散至細(xì)胞膜外，長鏈的AHLs通過內(nèi)吞和外排作用進(jìn)出細(xì)胞[15]。當(dāng)濃度達(dá)到閾值時，其與LuxR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成LuxI/LuxR蛋白復(fù)合體，調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[16]。此外，在哈氏弧菌中發(fā)現(xiàn)LuxM蛋白也是AHLs生物合成的來源，此類AHLs類信號分子稱HAI-1。LuxM合成HAI-1后，結(jié)合傳感器激酶LuxN進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控[17-18]。研究人員[19]對銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)研究最多且最深入，得出其分別由4個相互連接的信號機(jī)制組成多層結(jié)構(gòu)。其中LasI/LasR-RhlI/RhlR系統(tǒng)由2對LuxI/LuxR同源物被識別為LasI/LasR和RhlI/RhlR。LasI和RhlI是自誘導(dǎo)合成酶，產(chǎn)生3-oxo-C12-HSL和C4-HSL 2種AHLs分子，分別與轉(zhuǎn)錄因子LasR、RhlR結(jié)合，LasR/AI復(fù)合物激活RhlI與RhlR調(diào)控相應(yīng)的毒力基因表達(dá)[20-21]。

1.2 AI-2

AI-2是一類呋喃硼酸二酯類化合物，為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均可產(chǎn)生的自誘導(dǎo)因子，介導(dǎo)細(xì)菌種間交流。AI-2可通過外源感知和內(nèi)源合成方式獲得，前者發(fā)生在無AHL合酶但含LuxR的微生物中，其未編碼AI-2合成蛋白的luxS同系物卻具有AI-2受體以感知外源AI-2[22]；后者存在2種合成途徑，常規(guī)路線為：AI-2合成源于S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)的代謝途徑，當(dāng)SAM的甲基移至底物后，生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine, SAH)，SAH被S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶(S-adenosyl homocysteine nucleosidase, Pfs)迅速降解，產(chǎn)生S-核糖同型半胱氨酸(S-ribose homocysteine, SRH)，再由LuxS酶降解為4,5-二羥基-2,3-戊二酮(DPD)和高半胱氨酸。DPD環(huán)化后形成具有活性的AI-2并被輸出胞外[23]。另一種途徑中只有Pfs沒有LuxS，使用SAH水解酶將SAH水解成腺苷和高半胱氨酸，腺苷被Pfs轉(zhuǎn)化成核糖-1-磷酸，經(jīng)異構(gòu)化為核糖-5-磷酸，再轉(zhuǎn)化為DPD和AI-2[24]。因此也說明了LuxS對于AI-2合成不是必不可少的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3種AI-2受體，LuxP、LsrB和RbsB蛋白，其主要位于細(xì)胞內(nèi)，由于AI-2在某些細(xì)菌中產(chǎn)生并被感知但不被內(nèi)化，可認(rèn)為某些AI-2受體位于細(xì)胞表面[25]。當(dāng)AI-2在菌體外累積到一定閾值時，其會與受體蛋白LuxP結(jié)合，再與雙組分蛋白LuxQ作用以引起生物發(fā)光，此也為哈氏弧菌檢測AI-2的BAI-1型式[26]?？梢?，在QS信號分子的產(chǎn)生過程中微生物的代謝復(fù)雜，AI-2仍有待進(jìn)一步探索。

1.3 DKPs

DKPs為二酮哌嗪類化合物(Diketopiperazines)，也稱環(huán)二肽。近年來，DKPs被證明為新的信號分子[27]，在銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌與腸桿菌等革蘭氏陰性菌的培養(yǎng)上清液中被檢出，后續(xù)在與海洋無脊椎動物相關(guān)的一些細(xì)菌中被分離出[28-29]。其中，趙愛飛等[30]通過GC-MS在熒光假單胞菌和波羅的海希瓦氏菌檢測到4種DKPs中主要種類是Cyclo-(L-Pro-L-Leu)和Cyclo-(L-Pro-L-Phe)；Zhu等[31]在大黃魚冷藏過程中從分離出波羅的海希瓦氏菌和腐敗希瓦氏菌檢出DKPs信號分子，且通過外源添加AI-2、DKPs、AHLs三類信號分子研究其腐敗表型的變化，證明DKPs可能調(diào)控大黃魚腐敗。DKPs類信號分子能與LuxR蛋白結(jié)合，促進(jìn)或猝滅QS以控制基因表達(dá)，可視為部分代替AHLs作用[32]。DKPs介導(dǎo)QS系統(tǒng)的具體機(jī)制至今尚未完全明晰，且由DKP誘導(dǎo)的魚類腐敗作用和調(diào)控體系也無明確定義。

1.4 AIPs

AIPs是自誘導(dǎo)肽(Autoinducing Peptides)，由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生，以前體肽或自誘導(dǎo)肽的形式通過細(xì)胞核糖體合成，然后通過ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合物對其進(jìn)行加工修飾，將修飾肽運出細(xì)胞[33]。在一定AIP濃度下的雙組分調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子接收信號后，通過磷酸化將信息傳遞給細(xì)胞，激活相關(guān)基因，代表菌株為金黃色葡萄球菌[34]。在部分革蘭氏陽性菌中，AIP也可被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控基因表達(dá)，如蠟樣芽孢桿菌，成熟的AIP分子在細(xì)胞質(zhì)中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，其復(fù)合物可調(diào)節(jié)蠟樣芽孢桿菌毒力因子的產(chǎn)生[35]。類似于金黃色葡萄球菌的agrBDCA系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有同源性lamBDCA系統(tǒng)，且其通過組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase, HPK)和細(xì)胞質(zhì)應(yīng)答調(diào)節(jié)子(response regulator, RR)組成的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component signal transduction system, TCS)來調(diào)控菌體行為[36]。

1.5 其他信號分子

除上述4類主要信號分子外，細(xì)菌QS系統(tǒng)還有其他信號分子。其中，AI-3是一類調(diào)控腸道出血性埃希氏大腸桿菌毒力因子表達(dá)，介導(dǎo)致病菌與宿主細(xì)胞交流的信號分子，目前對此信號分子的結(jié)構(gòu)和合成機(jī)制仍不明晰。研究[37]發(fā)現(xiàn)，多種共生細(xì)菌都能產(chǎn)生AI-3，也表明AI-3可能是另一種跨物種的QS信號分子。PQS(Pseudomonas Quinolone Signal)為2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮，又稱假單胞菌喹諾酮信號，是銅綠假單胞菌的第3種自誘導(dǎo)因子，其能調(diào)控基因表達(dá)，增強(qiáng)膜泡形成，在對氧化應(yīng)激反應(yīng)中表現(xiàn)為雙重作用[38]。通過整合轉(zhuǎn)錄起始因子RpoS研究了PQS和QS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子VqsR之間的作用，得到PQS與VqsR間存在控制體系，且RpoS在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[39]。DSF(Diffusible signal factor)為脂肪酸類化合物，被發(fā)現(xiàn)存在于不同的革蘭氏陰性菌中[40-41]。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)一種DSF翻轉(zhuǎn)及其調(diào)控機(jī)制，其為理解DSF依賴微生物調(diào)控病毒基因表達(dá)，以應(yīng)對周圍環(huán)境變化提供了新的維度[42]。事實上，一些細(xì)菌不產(chǎn)生自誘導(dǎo)物，卻可響應(yīng)其他細(xì)菌的自誘導(dǎo)物產(chǎn)生信號。如大腸桿菌響應(yīng)來自其他細(xì)菌的信號SdiA[43]，洋蔥伯克霍爾德菌也已被證明對銅綠假單胞菌產(chǎn)生的QS信號有響應(yīng)[44]。此外，真菌的毒力和生物膜形成也受到QS的調(diào)控。白色念珠菌中法尼醇的發(fā)現(xiàn)是QS在真核生物中的顯著突破，其產(chǎn)生的信號分子將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化成菌絲體而調(diào)控毒性因子的表達(dá)[45]。目前已確定一些真菌傳播的重要化合物，但其實際機(jī)制未明確[46]。

2 群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitor, QSI)

由于水產(chǎn)品中的腐敗菌活動受群體感應(yīng)機(jī)制調(diào)節(jié)，因此阻斷群體感應(yīng)過程為開發(fā)新型保鮮劑提供了新思路[47]。水產(chǎn)品除應(yīng)配合不同的貯藏方式，更應(yīng)對癥下藥，在群體感應(yīng)進(jìn)程中，將信號分子在產(chǎn)生、擴(kuò)散、感應(yīng)與基因表達(dá)處切斷，從而改善其品質(zhì)，延長貨架期。將天然或合成的能阻斷群體感應(yīng)信號分子發(fā)揮作用或受體識別信號分子的識別過程，而不干擾細(xì)菌正常生理活動的化學(xué)活性物質(zhì)稱為群體感應(yīng)抑制劑[48]。

2.1 QSI的分類與作用機(jī)制

群體感應(yīng)抑制劑的來源廣泛，一般可分為天然和合成抑制劑，天然抑制劑又可分為植物、動物及真菌次級代謝產(chǎn)物。出于水產(chǎn)品保鮮的安全性考慮，相關(guān)學(xué)者[49-50]主要開展了天然抑制劑作為水產(chǎn)品特定腐敗菌群體感應(yīng)抑制劑的研究。

目前有抑制信號產(chǎn)生、信號擴(kuò)散與信號接收等方式可干擾或中斷細(xì)菌的QS系統(tǒng)[51]。其作用機(jī)制主要有：① 利用一些小分子物質(zhì)減少信號分子的產(chǎn)生，使QS系統(tǒng)停止繼續(xù)發(fā)揮作用。如一些QS淬滅酶可通過抑制信號分子合成酶的活性來抑制細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)。有研究[52]顯示，Lon蛋白酶可降解信號分子合成酶來影響AHLs合成，抑制弧菌的LuxR/LuxI型QS系統(tǒng)。② 使用降解酶以促進(jìn)群體感應(yīng)信號分子的降解。研究[53]發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌中存在較多AHLs的QS淬滅酶，如?；D(zhuǎn)移酶和內(nèi)酯酶。Kim等[54]得出，對氧磷酶-2(PON2)可水解3-oxo-C12-HSL信號分子以抑制銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)。③ 利用信號分子類似物競爭受體蛋白以阻斷信號接收。如合成分子——吡哆醛乳酰腙，研究發(fā)現(xiàn)其可與LasR的多個活性位點接合以抑制銅綠假單胞菌中QS相關(guān)毒力因子的表達(dá)，可用于開發(fā)新型抗菌劑[55]。目前這種作用機(jī)制也是藥物篩選的理想靶點[56]。

2.2 植物源QSI在水產(chǎn)品中的應(yīng)用

目前研究較廣泛的是植物源天然抑制劑。一些從植物中提取的化合物長期以來被用作傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，且經(jīng)證實生物性質(zhì)天然物質(zhì)的種類數(shù)量仍在不斷增加。具有抗菌活性的主要植物化合物有酚、醌、皂苷、單寧、香豆素、萜與生物堿類等[57-58]。其中，丁香酚具有良好的抗銅綠假單胞菌的las群體感應(yīng)系統(tǒng)與抗紫色色桿菌QS活性[59]。異檸檬酸可干擾哈氏弧菌中細(xì)胞信號傳導(dǎo)與生物膜的形成[60]。肉桂醛及衍生物可降低大腸桿菌生物膜的形成及不同弧菌屬中AI-2介導(dǎo)的QS，表型變化明顯[61-62]。

近年來，在健康新理念的驅(qū)動下，將植物提取物用于水產(chǎn)品相關(guān)特定腐敗菌群體感應(yīng)抑制研究得到廣泛關(guān)注。該抑制劑既解決了細(xì)菌耐藥性問題，也能避免使用其他來源的抑制劑帶來的副作用，更能滿足人們的健康需求?，F(xiàn)有研究[47]表明，許多水果、蔬菜、香草和香料具有抗QS活性。同時，由于其提取物毒副作用小或幾乎無毒副作用而逐漸被用作QSI[50,63]?，F(xiàn)此類QSI的研究已成為熱點，Kamila等[64]發(fā)現(xiàn)百里香精油及主要生物活性化合物能明顯抑制熒光假單胞菌KM121的運動性及生物膜形成能力。Banerjee等[65]發(fā)現(xiàn)穿心蓮氯仿提取物能明顯降低銅綠假單胞菌lasI、lasR、rhIL和rhIL的表達(dá)，使其巨噬細(xì)胞中的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑明顯削弱。Liu等[66]證明柚皮黃酮提取物對海洋性致病菌鰻弧菌存在QS抑制性。

3 存在問題與解決措施

3.1 植物樣本間存在個體差異

植物除在地域、種類與生長階段上存在差異，某些植物源提取物對紫色桿菌和銅綠假單胞菌的QS活性有增強(qiáng)作用，表明其可產(chǎn)生改變基于細(xì)菌AHL信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的化合物[50]。

3.2 天然提取物的毒性尚未明確

部分植物雖具有較長的食用與藥用歷史，但其提取物的安全性仍無法保證。目前對其提取物的安全性研究相對較少。但已有學(xué)者[67]證實其在食品中的使用是安全的。然而實際上，如無致命影響尚不能證明植物制劑對基因毒性的安全性，其可能存在慢性毒性的影響，甚至毒性因人群個體差異性而被放大。

3.3 提取物的QS作用機(jī)制尚不深入

目前有研究[68]報道了膳食植物提取物或其有效成分具有干擾種內(nèi)或種間QS的能力，但未能深入到其作用機(jī)制研究。同時，研究[69]表明植物提取物及其化學(xué)活性物質(zhì)的作用發(fā)揮具有特異性，由于其難以由一個系統(tǒng)移至另一個系統(tǒng)，須在特定QS系統(tǒng)中選擇。即使系統(tǒng)使用相同的AHL，在一個QS系統(tǒng)中選擇的QSI在其他系統(tǒng)中也不能作為QSI[70]。

3.4 修飾后的天然生物活性化合物存在限制作用

對天然來源的生物活性化合物進(jìn)行化學(xué)修飾是藥物開發(fā)中的有效方法[71]。同樣，可將天然植物的活性成分結(jié)合手性分子以合成新的QSI，其結(jié)構(gòu)與AHL結(jié)構(gòu)相似，通過與相應(yīng)受體蛋白位點結(jié)合，達(dá)到抑制QS反應(yīng)進(jìn)程，但其受體位點可能與AHL信號結(jié)合腔的位置不同而未能發(fā)揮預(yù)測作用[55]。

因此，在對部分天然植物源抑制劑改進(jìn)提取方式，提升提取率的同時，還應(yīng)考慮提取劑對活性成分作用的影響。同時，應(yīng)進(jìn)一步開展對天然植物提取物的安全性研究，研究其急性和亞急性毒性。再次，不同細(xì)菌的QS調(diào)控表型存在差異，可將部分典型細(xì)菌作為QSI篩選模式菌株，快速篩選QS抑制因子，再結(jié)合高通量篩選技術(shù)以篩選得到優(yōu)質(zhì)QSI。最后，將提取物有效成分用于新型化合物的合成，并根據(jù)群體感應(yīng)篩選模型結(jié)合基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)與計算機(jī)輔助模擬藥物設(shè)計等方式，從而獲得較優(yōu)QSI。

4 結(jié)論

隨著科研人員對水產(chǎn)品研究的不斷深入，特定腐敗菌的群體感應(yīng)作用機(jī)制逐漸得到完善，其為獲得優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)品保鮮劑提供了理論依據(jù)。從安全與健康方面考慮，水產(chǎn)品QSI的來源多傾向于天然植物。其中，對人體有益的植物資源因其能產(chǎn)生群體感應(yīng)抑制作用而得到國內(nèi)外密切關(guān)注。目前，對于群體感應(yīng)抑制機(jī)制的研究還處于初級階段，如何深入研究QSI作用于一種或多種QS系統(tǒng)的控制位點仍有待進(jìn)一步研究。因此，結(jié)合多種新型技術(shù)以全面研究QSI作用機(jī)制將會逐步實現(xiàn)。此外，基于當(dāng)前研究現(xiàn)狀，可逆向思維，對需要控制的目標(biāo)QS系統(tǒng)尋找新QSI而展開研究。