安 超， 馬賽箭， 常 帆， 上官亦卿， 丁 浩， 薛文嬌

（陜西省微生物研究所，陜西 西安710043）

出芽短梗霉（Aureobacidium pullulans）是一類與酵母有密切關系的小型絲狀真菌，屬半知菌門短梗霉屬，能發(fā)酵產生胞外多聚糖、酶、抗菌素、單細胞蛋白等多種物質[1-2]。普魯蘭多糖是一種水溶性黏性多糖可由出芽短梗霉發(fā)酵所產生，1938年，Bauer首次報道了這種特殊的微生物多糖，1959年，Bender分離純化并將這種多糖命名為普魯蘭多糖[3]。普魯蘭多糖為無味、無嗅、無毒、可食用的天然碳水化合物，呈非結晶不定型粉末，具有極好的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結性和易自然降解等獨特的理化和生物學特性，對人體無任何副作用，并且，普魯蘭多糖的水溶液其黏度、特性幾乎不受pH、鹽類、酶的影響，因此被廣泛應用于醫(yī)藥制造（膠囊和藥物載體）、食品包裝、水果和海產品保鮮、化妝品（保濕劑和水凝膠）、煙草制造、和農業(yè)種子保護等領域，是一種多功能新型生物制品[4]。

近年來，隨著應用領域的不斷細分及應用產品附加值的大幅提高，對普魯蘭多糖的生產提出了更高的要求。作為高聚物，多糖性能與相對分子質量及其分布特征密切相關[5]，不同的應用必然要求不同的相對分子質量及其分布才能達到最佳效果[6-11]。普魯蘭多糖的相對分子質量分布范圍在5.0×104～5.0×106左右[12]，主要受出芽短梗霉菌種差異、碳源種類、培養(yǎng)時間及發(fā)酵pH等因素的影響。目前，商業(yè)化的普魯蘭多糖的數(shù)均相對分子質量大概在1.0×105～2.0×105， 重均相對分子質量大概在 3.62×105～1.8×105，相對分子質量分散指數(shù)一般在2.1到4.1之間。相對分子質量的分布范圍決定了普魯蘭多糖的應用范圍，例如 3.0×104～9.0×104大小的普魯蘭多糖分子片段可代替右旋糖酐作為血漿擴容劑[13-14]。

有機氮源中含有豐富的蛋白質、肽類、游離的氨基酸、糖類、脂肪和生長因子等，在出芽短梗霉的發(fā)酵過程中對普魯蘭多糖的產量和相對分子質量起著至關重要的作用。Wiley和Lin等人研究了碳源、氮源和磷酸鹽對普魯蘭多糖相對分子質量分布的影響，其中氮源式影響相對分子質量的最大因素，銨離子被證實比硝酸根離子更有利于生產高相對分子質量的普魯蘭多糖[15-16]；Morin和Kumar等人報道碳氮質量比為10∶1是普魯蘭多糖的最佳培養(yǎng)條件[17]；Cheng等人研究表明：75 g/L蔗糖，3 g/L酵母粉和5 g/L的硫酸組合下，普魯蘭多糖的產量最高，培養(yǎng)7天后，收獲25.8 g/L的普魯蘭多糖[18]。作者選用低色素出芽短梗霉CGMCC.No.11602為目標菌株，研究了不同質量濃度酵母粉對普魯蘭多糖產量、結構及相對分子質量的影響，為不同特性普魯蘭多糖的生產提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 菌種

出芽短梗霉 （Aureobasidium pullulans）CGMCC 11062，保藏于中國微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯去皮去芽眼、洗凈、切塊，稱200 g放入1 000 mL蒸餾水中用文火煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾液加水補至1 000 mL，加20 g蔗糖，15 g瓊脂粉，121℃，20 min滅菌。

種子培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖 50.0；MgSO4·7H2O 0.2；K2HPO45.0； 酵母粉 1.7；（NH4）2SO40.6；NaCl 1.0；初始 pH 6.5，113～116 ℃，20 min 滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 50；MgSO4·7H2O 0.2；K2HPO45.0；（NH4）2SO40.6；NaCl 1.0，酵母粉質量濃度 （0，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1 g/L）。 初 始 pH 6.5，113～116 ℃，20 min 滅菌。

1.3 標準品試劑

普魯蘭多糖標準品P4516-25G：Sigma公司產品。

1.4 儀器

恒溫培養(yǎng)箱SPX-250：北京科偉永興儀器有限公司產品；控溫搖床ZWY-2102：上海智誠分析儀器制造有限公司產品；傅立葉變換紅外光譜儀Nicolet is 50：Thermo Scientific產品；高效液相色譜儀（Waters 1515）：Waters公司產品。

1.5 培養(yǎng)方法

活化培養(yǎng)方法：將菌種在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d；種子培養(yǎng)方法：將活化好的菌株接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，置于恒溫搖床上（230 r/min），28℃條件下培養(yǎng) 48 h，即為種子液；發(fā)酵培養(yǎng)方法：按照體積分數(shù)5%接種量將種子接種到裝有體積分數(shù)20%培養(yǎng)液的三角瓶中，置于恒溫搖床上（230 r/min），28℃條件下培養(yǎng)96 h。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體生物量 將發(fā)酵液30 mL裝入50 mL離心管中，8 000 r/min，離心 10 min，取沉淀于 105℃干燥至恒重，生物量計算公式如下：

生物量（g/L）=（m實-m空）×1 000/30

1.6.2 普魯蘭多糖產量 取上清液15 mL加入30 mL體積分數(shù)為95%的乙醇，4℃靜置12 h，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加水重溶，再次加入30 mL體積分數(shù)為95%的乙醇進行沉淀，將沉淀于80℃烘至恒重，精確稱重，多糖質量濃度計算公式如下：

多糖質量濃度（g/L）=（m實-m空）×1 000/15

1.6.3 殘?zhí)琴|量濃度 苯酚硫酸法[19]。

反應30 min，等冷卻之后測定A490nm。待測樣品稀釋合適的倍數(shù)，使用與標曲測定的相同體系測定，根據標準曲線和稀釋倍數(shù)計算發(fā)酵液中的殘?zhí)琴|量濃度。

1.6.4 結構測定 應用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（ATR-FTIR）直接測定制備獲得的普魯蘭多糖粉末[20]。

1.6.5 相對分子質量測定 利用高效液相色譜法（GPC）測定普魯蘭多糖相對分子質量分布范圍。以0.1 mol/L NaNO3作為流動相，流量0.5 mL/mim，柱溫箱溫度35℃，樣品質量濃度1 g/L，進樣量20 μL，數(shù)據處理使用Waters自帶的Breeze軟件積分獲得[21]。

2 結果與分析

2.1 酵母粉質量濃度對出芽短梗霉發(fā)酵普魯蘭多糖的影響

不同酵母粉質量濃度對普魯蘭多糖發(fā)酵的影響如圖1所示。由圖我們可以看出，酵母粉的質量濃度對普魯蘭多糖產量及底物的碳源轉化率影響很大，而對菌體的產量影響不是很大。其中，在未加酵母粉時，菌體產量5.92 g/L，普魯蘭多糖產量34.74 g/L，殘?zhí)琴|量濃度44.18 g/L。因此，有機氮源的缺失導致菌體含量和普魯蘭多糖產量偏低，造成大量底物剩余。隨著酵母粉質量濃度的增加，菌體含量和普魯蘭多糖產量逐漸升高，同時，底物的利用效率也提升，特別是當酵母粉質量濃度為1.5 g/L時，普魯蘭多糖的產量出現(xiàn)最大峰值，達到了61.32 g/L，相對于單一的無機氮源，有機氮源類的酵母膏與無機氮源混合作為發(fā)酵氮源時，更有利于出芽短梗霉的生長及胞外多糖合成。而當酵母粉質量濃度超過1.5 g/L，多糖產量逐漸降低，這可能是由于過多的有機氮源供給促使碳源流向生物體自身。

2.2 有機氮源種類對普魯蘭多糖結構的影響

研究多糖結構的方法有許多種，如紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜、氣相色譜-質譜聯(lián)用以及多糖的分子修飾等。糖的紅外光譜技術源自于20世紀70年代后，由于紅外光譜技術的發(fā)展及糖化學的研究深入，紅外光譜成為糖結構研究的重要手段之一，主要用于不同糖的鑒別、吡喃糖和呋喃糖的識別、糖苷鍵及糖構型的確定、糖鍵上主要取代基的識別[22]。

紅外色譜分析結果見圖2，結果表明：6種不同有機氮源的培養(yǎng)液發(fā)酵合成的普魯蘭多糖樣品具有明顯的多糖特征吸收峰，與普魯蘭多糖標準品具有一致的紅外吸收。普魯蘭多糖在3 600～3 200 cm-1出現(xiàn)一寬峰，是糖類存在的分子間或分子內的O-H伸縮振動產生的；3 000～2 800cm-1存在吸收較弱的O-H的吸收峰；此兩組吸收峰是糖類的特征峰[23]。1 400～1 200cm-1的吸收峰是由兩個C-O伸縮振動產生，其中一個屬于C-O-H，另一個是糖環(huán)C-O-C；1 000～700 cm-1包含著糖類特征吸收峰，主要表現(xiàn)為糖的吡喃環(huán)的振動譜。因此，酵母粉質量濃度對普魯蘭多糖的結構未產生顯著影響。

2.3 有機氮源對普魯蘭多糖相對分子質量的影響

作者選用Sigma普魯蘭多糖相對分子質量標準品，使用Waters 1515-2414（示差檢測器）檢測平臺，獲得了普魯蘭多糖相對分子質量的標準曲線，如表1所示，相對分子質量越大，出峰時間越早。通過GPC測定不同有機氮源條件下的普魯蘭多糖相對分子質量大小，如圖3所示，隨著酵母粉質量濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質量越來越小。通過Waters GPC自帶的Breeze軟件，依據普魯蘭多糖相對分子質量標準生成標準曲線，進而對不同質量濃度酵母粉制備的普魯蘭多糖的相對分子質量積分計算，具體參數(shù)見表2所示，其中不加酵母粉時生產的普魯蘭多糖相對分子質量最大，重均相對分子質量Mw為529 528，隨著酵母粉質量濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質量逐漸降低，重均相對分子質量Mw從529 528降低到183 278。Campbell等人發(fā)現(xiàn)在碳源被消耗完后且發(fā)酵液中仍然有很高的氮源濃度下，會誘導普魯蘭多糖降解酶的產生，并導致普魯蘭多糖相對分子質量及產量的降低[24]；Orr等人發(fā)現(xiàn)提供過多的氮源會導致更高的出芽短梗霉生物量，而不是普魯蘭多糖的產量[25]，研究也證明了這一點。所有條件下制備的普魯蘭多糖的分散系數(shù)在2.0～2.4之間，相對較窄，這可能與發(fā)酵周期短，未被水解酶水解有關。

2.4 有機氮源對普魯蘭多糖相對分子質量的影響

選用Sigma普魯蘭多糖相對分子質量標準品，使用Waters 1515-2414（示差檢測器）檢測平臺，獲得了普魯蘭多糖相對分子質量的標準曲線，如表1所示，相對分子質量越大，出峰時間越早。通過GPC測定不同有機氮源條件下的普魯蘭多糖相對分子質量大小，如圖3所示，隨著酵母粉濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質量越來越小。通過Waters GPC自帶的Breeze軟件，依據普魯蘭多糖相對分子質量標準生成標準曲線，進而對不同濃度酵母粉制備的普魯蘭多糖的相對分子質量積分計算，具體參數(shù)見表2所示，其中不加酵母粉時生產的普魯蘭多糖相對分子質量最大，重均相對分子質量Mw為529 528，隨著酵母粉濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質量逐漸降低，重均相對分子質量Mw從529 528降低到183 278。Campbell等人發(fā)現(xiàn)在碳源被消耗完后且發(fā)酵液中仍然有很高的

表1 不同相對分子質量普魯蘭多糖標準曲線測定Table 1 Standard curve of different molecular weight of pullulan

氮源在一定質量濃度下，會誘導普魯蘭多糖降解酶的產生，并導致普魯蘭多糖相對分子質量及產量的降低[15]；Orr等人發(fā)現(xiàn)提供過多的氮源會導致更高的出芽短梗霉生物量，而不是普魯蘭多糖的產量[16]，研究也證明了這一點。所有條件下制備的普魯蘭多糖的分散系數(shù)在2.0～2.4之間，相對較窄，這可能與發(fā)酵周期短，未被水解酶水解有關。

圖3 酵母粉質量濃度對普魯蘭多糖相對分子質量大小的影響Fig.3 Effects of yeast extract concentration on pullulan molecular weight size

3 結語

普魯蘭多糖的相對分子質量決定了普魯蘭多糖的應用范圍及醫(yī)用價值，高相對分子質量的普魯蘭多糖更適用于商業(yè)用途。但是，針對不同的方向，對于普魯蘭多糖的要求不同，特別是對相對分子質量及其分布的要求。例如，作為生物材料及組織工程而言，要求高相對分子質量普魯蘭多糖且分布相對均一；作為血漿代用品則需要相對分子質量低的普魯蘭多糖（大概6×104左右）且要求其相對分子質量分布范圍相對窄，因為高相對分子質量的普魯蘭多糖可能產生高的靜脈壓；作為一般的食品添加劑，中等相對分子質量的普魯蘭多糖就能滿足需求。因此，不同相對分子質量級別的普魯蘭多糖的制備能夠更好地滿足普魯蘭多糖應用要求，增加產品的附加值，同時，也滿足不同相對分子質量普魯蘭多糖的市場需求。

發(fā)酵過程調控是控制微生物多糖相對分子質量分布重要途徑。氮源的水平和種類對菌體形態(tài)和代謝產物的合成起關鍵性作用，是一個重要且復雜的因素。作者選擇工業(yè)生產中常用有機氮源酵母粉，研究了不同濃度酵母粉對出芽短梗霉CGMCC 11602發(fā)酵生產普魯蘭多糖的產量、結構、相對分子質量的影響。結果表明酵母粉質量濃度對出芽短梗霉的產量和相對分子質量影響顯著，而對普魯蘭多糖結構不大。當酵母粉質量濃度為1.5 g/L時，普魯蘭多糖的產量出現(xiàn)最大峰值，達到了61.32 g/L，同時，過多的酵母粉供給造成了碳源流向生物體，普魯蘭多糖產量減少。不加酵母粉時生產的普魯蘭多糖相對分子質量最大，重均相對分子質量Mw為529 528，隨著酵母粉質量濃度的增加，生成的普魯蘭多糖相對分子質量逐漸降低，重均相對分子質量Mw從529 528降低到183 278。表明有機氮源可能會誘導普魯蘭多糖降解酶的產生，并導致普魯蘭多糖相對分子質量及產量的降低。

表3 有機氮源種類對普魯蘭多糖相對分子質量分布的影響Table 3 Effects of yeast extract concentration on pullulan molecular weight distribution

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