王 瑞 陳隆升 王湘南 彭映赫 陳永忠

(1. 湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004； 2. 國(guó)家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

油茶 (Camelliaoleifera) 屬于山茶科 (Theacae) 山茶屬植物，是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種，與油棕 (Elaeisguineensi)、油橄欖 (Oleaeuropaea) 和椰子 (Cocosnucifera) 并稱為世界四大木本食用油料植物[1]。無(wú)性繁殖是油茶目前主要采用的繁殖方式，無(wú)性繁殖具有保持木本優(yōu)良性狀、成本低、繁殖速度快、簡(jiǎn)單易行等特點(diǎn)。但油茶組培、扦插等無(wú)性繁殖方式由于存在生根慢、生根率低、根系差等問(wèn)題，影響了規(guī)模化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用。研究表明，穗條中存在生根抑制物質(zhì)導(dǎo)致鄧恩桉、馬尾松等樹(shù)種扦插繁殖困難[2-12]。本研究以油茶穗條為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其生根抑制物進(jìn)行了生物和有機(jī)鑒定，并探討抑制物對(duì)扦插苗生長(zhǎng)的影響，以期為油茶扦插繁殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用油茶新品種 ‘晚霞’、 ‘赤霞’、 ‘朝霞’、 ‘秋霞’，其優(yōu)良無(wú)性系穗條采自湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)林場(chǎng)油茶采穗圃，該采穗圃于1997年采用高接換冠造林技術(shù)建成。實(shí)驗(yàn)樣品為4個(gè)油茶新品種當(dāng)年生春梢，于2014年6月12日采集后帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取液制備

穗條依次用洗潔劑、自來(lái)水、去離子水沖凈，吸水紙吸干水分。用不銹鋼刀片切去穗條基部變色部分，將整個(gè)穗條切成碎片。稱取10 g左右，剪碎，研磨成漿，按每克鮮材料加入1 mL甲醇溶液進(jìn)行提取。最后用蒸餾水稀釋，過(guò)濾，定容，待用。

1.2.2提取液酸度測(cè)定

采用滴定法對(duì)提取液進(jìn)行總酸度滴定。以酚酞作指示劑，0.1 mol/L氫氧化鈉滴定，根據(jù)消耗的堿液體積計(jì)算樣品總酸含量。

1.2.3酚類物質(zhì)化學(xué)顯色反應(yīng)

利用酚類物質(zhì)與三氯化鐵溶液反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色化合物的原理，以0.5%三氯化鐵溶液為顯色劑，鑒定提取液原液、5倍稀釋液中是否含有酚類物質(zhì)。

1.2.4酚類物質(zhì)含量測(cè)定

取10 μL待測(cè)液置于10 mL刻度試管中,以蒸餾水為對(duì)照,加入6 mL蒸餾水及2.5 mL Folin-Denis試劑，用力搖勻，3 min后加入1 mL飽和碳酸鈉溶液,再加蒸餾水使終體積為10 mL；搖勻后室溫下靜置1 h，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)725 nm條件下測(cè)定吸光度,。配制濃度為0、1.1、2.2、3.3、4.4、5.5、6.6、7.7 μg/mL沒(méi)食子酸溶液，按上述測(cè)定方法測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合直線回歸方程，根據(jù)直線方程計(jì)算各樣品的總酚含量。

1.2.5生物效應(yīng)鑒定

將白菜 (Brassicapekinensis) 種子用紗布包好，分別放入蒸餾水 (CK)、原提取液和稀釋5倍提取液中浸泡12 h后置于培養(yǎng)皿中的濕濾紙上，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)。每天加2次不同濃度溶液，保持濾紙濕潤(rùn)。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)50粒種子。發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率鑒定受試材料生物效應(yīng)。

1.2.6扦插實(shí)驗(yàn)

取4個(gè)品種的插穗，每個(gè)品種3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50根插穗，扦插后4個(gè)月調(diào)查生長(zhǎng)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007及SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液中酸度差異分析

酸類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抑制活性，酸類物質(zhì)含量越高，抑制作用越明顯，不利于生根[10]。由表1可知，4個(gè)不同油茶品種提取液酸度間存在顯著差異 (P< 0.05)，說(shuō)明不同品種間酸類物質(zhì)對(duì)油茶穗條生根的影響不同。其中， ‘晚霞’ 酸度最高， ‘秋霞’ 酸度最低。這說(shuō)明4個(gè)品種中， ‘秋霞’ 插穗中含有的酸類抑制物質(zhì)較少， ‘晚霞’ 插穗中含有的酸類抑制物質(zhì)較多。

表1 不同品種提取液中酸度差異比較Table 1 Difference comparison of acidity in scions extracts of different varieties

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。

2.2 酚類物質(zhì)化學(xué)顯色反應(yīng)

酚類物質(zhì)是導(dǎo)致植物生根困難的物質(zhì)，是植物生根的最主要的抑制物[3-9]。由表2可知，4個(gè)不同油茶品種提取液原液中酚類物質(zhì)化學(xué)顯色反應(yīng)均成藍(lán)色，且在30 s內(nèi)不褪色,稀釋5倍后依然為藍(lán)色，且在30 s內(nèi)不褪色，說(shuō)明4個(gè)油茶品種中均含有酚類物質(zhì)或其衍生物。

2.3 提取液中酚類物質(zhì)含量差異分析

由表3可知，4個(gè)不同品種插穗提取液中均存在酚類物質(zhì)，這與酚類物質(zhì)化學(xué)顯色的鑒定結(jié)果一致，且4個(gè)品種間酚類物質(zhì)含量差異顯著 (P< 0.05)。其中，秋霞酚類物質(zhì)含量最低， ‘晚霞’ 酚類物質(zhì)含量最高，說(shuō)明 ‘秋霞’ 插穗中含有的酚類抑制物質(zhì)較少， ‘晚霞’ 插穗中存在的酚類抑制物質(zhì)偏多。

表2 不同品種提取液中酚類物質(zhì)化學(xué)顯色反應(yīng)Table 2 Chemical assay of phenolic compound in scions extracts of different varieties

表3 不同品種提取液中酚類物質(zhì)含量差異比較Table 3 Difference comparison of phenols content in scions extracts of different varieties

2.4 生物效應(yīng)鑒定結(jié)果分析

2.4.1種子發(fā)芽率

由表4可知，不同品種提取液原液及5倍稀釋液處理后的種子發(fā)芽率均低于CK，說(shuō)明其對(duì)白菜種子發(fā)芽具有不同程度的抑制作用。其中，5倍稀釋液對(duì)白菜種子發(fā)芽的抑制作用較弱，種子發(fā)芽率高于原液中種子發(fā)芽率，抑制活性為13.33%～23.67%；而提取液原液對(duì)白菜種子發(fā)芽的抑制作用較強(qiáng)，發(fā)芽率為62.00%～78.00%。4個(gè)品種提取液原液種子發(fā)芽率與CK均存在顯著差異 (P< 0.05)，但不同品種間不存在顯著差異。在原液中， ‘赤霞’ 種子發(fā)芽率最高， ‘晚霞’ 最低；在5倍稀釋液中， ‘晚霞’ 種子發(fā)芽率最低，與對(duì)照間存在顯著差異 (P< 0.05)，其余品種間及與對(duì)照間均無(wú)明顯差異，說(shuō)明4個(gè)品種中， ‘晚霞’ 插穗中存在的抑制物質(zhì)偏多。

2.4.2根系長(zhǎng)度

由表5可知，不同品種提取液原液及5倍稀釋液中種子根系生長(zhǎng)情況不同。提取液原液及5倍稀釋液中白菜種子根系長(zhǎng)度均小于對(duì)照，并且提取液5倍稀釋液中種子根系長(zhǎng)度均大于提取液原液中種子根系長(zhǎng)度。可見(jiàn)，提取液稀釋后有利于種子根系生長(zhǎng)，說(shuō)明了提取液中存在根系生長(zhǎng)抑制物質(zhì)，并且降低插穗中生根抑制物質(zhì)的含量可以促進(jìn)根系生長(zhǎng)。在不同品種穗條提取液原液中，4個(gè)品種間種子根系長(zhǎng)度不存在顯著差異，但均與對(duì)照間存在顯著差異 (P< 0.05)。4個(gè)品種中以 ‘赤霞’ 提取液中種子根系生長(zhǎng)最佳， ‘晚霞’ 最低，為0.06 cm；在5倍稀釋液中，以 ‘秋霞’ 提取液中種子根系生長(zhǎng)最佳， ‘晚霞’ 最低。

表4 不同品種提取液原液及5倍稀釋液中種子發(fā)芽率差異比較Table 4 Difference comparison of seed germination rate in scions extracts and 5 times dilution of different varieties

表5 不同品種提取液原液及5倍稀釋液中種子根系長(zhǎng)度差異比較Table 5 Difference comparison of root length of seed in scions extracts and 5 times dilution of different varieties

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。

2.5 扦插試驗(yàn)結(jié)果分析

由表6可知，4個(gè)品種扦插苗的新稍長(zhǎng)度依次為 ‘朝霞’ < ‘晚霞’ < ‘秋霞’ < ‘赤霞’， ‘赤霞’ 扦插苗新稍長(zhǎng)最長(zhǎng)，為4.80 cm，且與其他3個(gè)品種間均存在顯著差異 (P< 0.05)；4個(gè)品種的根數(shù)多少依次為 ‘朝霞’ < ‘晚霞’ < ‘秋霞’ < ‘赤霞’， ‘赤霞’ 的根數(shù)與其他3個(gè)品種間均存在顯著差異 (P< 0.05)，其他3個(gè)品種間根數(shù)無(wú)顯著差異；4個(gè)品種間的根長(zhǎng)均不存在顯著差異，4個(gè)品種中，根長(zhǎng)也是以 ‘赤霞’ 最佳，為4.03 cm， ‘朝霞’、 ‘秋霞’ 次之，分別為3.55 cm和3.54 cm， ‘晚霞’ 最差，為2.87 cm?？梢?jiàn)，4個(gè)品種的扦插苗， ‘赤霞’ 新稍及根系長(zhǎng)勢(shì)最佳， ‘秋霞’ 次之， ‘晚霞’ 生長(zhǎng)最差。

表6 不同品種新稍長(zhǎng)、根數(shù)和根長(zhǎng)差異比較Table 6 Difference comparison of new branch length、root number and root length of different varieties

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。

3 結(jié)論與討論

油茶無(wú)性繁殖生根比較困難，為了探討難生根的原因以及探索促進(jìn)生根的技術(shù)措施，本研究從酸度、顯色反應(yīng)、酚類物質(zhì)含量、種子發(fā)芽率以及生物效應(yīng)等方面分析了4個(gè)油茶新品種的生根抑制物質(zhì)，并通過(guò)4個(gè)品種的扦插苗生長(zhǎng)情況進(jìn)行了驗(yàn)證。酸類物質(zhì)和酚類物質(zhì)是抑制生根的最主要物質(zhì)，在4個(gè)參試品種中， ‘秋霞’ 插穗中酸類抑制物質(zhì)及酚類抑制物質(zhì)含量均最低， ‘晚霞’ 均最高；生物效應(yīng)鑒定及扦插試驗(yàn)結(jié)果表明， ‘赤霞’ 生根抑制物質(zhì)含量較低，生根相對(duì)容易， ‘秋霞’ 次之， ‘晚霞’ 插穗中所含的生根抑制物質(zhì)最多，生根相對(duì)困難。綜合評(píng)價(jià)，4個(gè)品種生根難易程度為 ‘赤霞’ > ‘秋霞’ > ‘朝霞’ > ‘晚霞’，在進(jìn)行無(wú)性繁殖時(shí)，為品種選擇提供了依據(jù)； ‘秋霞’ 插穗中酸類抑制物質(zhì)及酚類抑制物質(zhì)含量均最低，但是扦插生根率并非最高，也說(shuō)明 ‘秋霞’ 插穗中，除了含有酸類抑制物質(zhì)及酚類抑制物質(zhì)以外，還含有其他抑制物質(zhì)影響其生根率及根系生長(zhǎng)。

酚類物質(zhì)是主要的生根抑制物質(zhì)之一。本研究中， ‘晚霞’ 插穗中酚類物質(zhì)含量最高， ‘晚霞’ 插穗提取液原液及5倍提取液浸泡的白菜種子發(fā)芽率均最低，白菜種子根系生長(zhǎng)最差， ‘晚霞’ 扦插苗根系生長(zhǎng)最差。影響植物生根的酚類物質(zhì)有很多種，具體哪種酚類物質(zhì)對(duì)油茶生根起抑制作用，還有待繼續(xù)研究。降低酚類物質(zhì)含量可以緩解對(duì)生根的抑制作用，從而提高生根率。酚類物質(zhì)及其不穩(wěn)定并且易溶于水，因此，在扦插前通過(guò)采取一些技術(shù)措施降低酚類物質(zhì)含量，如冷水浸泡插穗或者將插條在扦插前放置在冷藏室水培，均可以減少插穗內(nèi)酚類物質(zhì)的含量，從而提高插穗生根率。

植物生根是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過(guò)程，木本植物生根過(guò)程更為復(fù)雜，除了受生根抑制物質(zhì)的影響外，還與基因、內(nèi)源激素以及外部環(huán)境等息息相關(guān)。本研究?jī)H對(duì)4個(gè)油茶新品種的生根抑制物質(zhì)以及其對(duì)扦插苗的生長(zhǎng)情況的影響進(jìn)行分析，與生根有關(guān)的內(nèi)源激素、生根相關(guān)的基因、蛋白等還有待進(jìn)一步研究。

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