PAUL Dempsey

(1 珠海市婦幼保健院乳腺外科，廣東 珠海 519000； 2 珠海市中心血站；3 珠海麗珠圣美醫(yī)療診斷技術(shù)有限公司； 4 Cynvenio Biosystems, Inc.)

乳癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬婦女罹患乳癌。隨著診斷技術(shù)與新藥研發(fā)的發(fā)展，目前乳癌的治療進入了分子分型的時代[1]。早在2013年，St.Gallen國際乳癌會議對乳癌分子分型進行了重新定義，將乳癌分為Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體-2(HER-2)陽性和基底樣細胞乳癌。同時，認為基底樣細胞乳癌與三陰性乳癌(TNBC)的發(fā)病人群中一致率大約為80%。TNBC指的是雌激素受體、孕激素受體及HER-2均陰性表達的一類乳癌[2-3]，其發(fā)病率大約占乳癌病人的15%[4]。

TNBC病人多為年輕、絕經(jīng)前女性(40歲前為主)。該腫瘤的內(nèi)部異質(zhì)性強，常伴有BRCA1突變，目前還沒有發(fā)現(xiàn)可針對治療的靶點或者免疫療法。細胞毒性藥物治療是唯一的常用治療手段，但耐藥情況明顯[5]，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，預(yù)后效果不理想。大部分病人手術(shù)后3年內(nèi)易發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，且在復(fù)發(fā)后進展迅速[6]。多項研究顯示，TNBC是復(fù)發(fā)率最高的乳癌亞型，高達1/3的病人會復(fù)發(fā)，包括首診為癌癥早期的病人[6-8]。然而目前還沒有一種準確高效的方法在復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移發(fā)生前或早期對病人進行有效的監(jiān)測或評估。近年來，液態(tài)活檢技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，使對TNBC病人復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的監(jiān)測成為可能[9-10]。美國強生公司的CellSearchTM是全球第一個經(jīng)過FDA和CFDA批準用于惡性腫瘤疾病管理的檢測循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的商業(yè)化產(chǎn)品，其適應(yīng)證為轉(zhuǎn)移性乳癌。然而單一的細胞計數(shù)功能并不能滿足目前臨床的需求[11-12]。除了CTC技術(shù)外，游離DNA(cfDNA)在腫瘤檢測中的應(yīng)用也進入快速發(fā)展的時期。美國Cynvenio公司為全球首家采取高純度提取CTC及cfDNA進行DNA測序的企業(yè)，擁有該領(lǐng)域全球最新一代的高純度分離技術(shù)，并通過自主開發(fā)軟件和工作流程來進行罕見細胞的測序，相關(guān)產(chǎn)品包括TargetPrepTM與OncoPrepTM等。本研究旨在探討多模板液態(tài)活檢技術(shù)在TNBC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險評估中的應(yīng)用價值，以利于臨床及時采取措施對病人進行干預(yù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究入組病人211例，年齡28～84歲，年齡中位數(shù)53歲。臨床分期：Ⅰ期75例，Ⅱ期95例，Ⅲ期35例，Ⅳ期2例，未能提供信息4例。病人均經(jīng)病理檢查確診為TNBC。共獲得血標本826份，收集時間為2014年1月—2015年12月，病人的血標本來自美國多家醫(yī)院。病人接受檢測的時間間隔不少于3個月，每位病人跟蹤采樣3～5次。

1.2 檢測方法

1.2.1對CTC突變情況的檢測 每次檢測需要采集病人血液8 mL。其檢測步驟包括樣本前處理、血液上機分離腫瘤細胞、CTC測序。CTC捕獲分離平臺為美國Cynvenio公司自主研發(fā)，其原理通過使用微流控免疫磁珠篩選及免疫熒光檢測法定量檢測全血中的上皮特征抗原陽性細胞。首先，向樣本中加入生物素標記的捕獲抗體、鏈霉親和素標記的磁珠，其中捕獲抗體為上皮特異性細胞黏附分子(EpCAM)。經(jīng)過抗原與抗體特異性反應(yīng)形成磁珠-捕獲抗體-檢測抗體的復(fù)合物1；同時向樣本中加入熒光標記的CD45檢測抗體，使其與白細胞表面的CD45抗原結(jié)合形成白細胞-CD45檢測抗體復(fù)合物2；用核酸染料對細胞核進行染色。將處理后的樣本及底部、頂部緩沖液同時通過鞘流芯片，密度關(guān)系為底部緩沖液>樣本>頂部緩沖液，由于密度差異在芯片中形成鞘流，使樣本不直接接觸芯片，避免絕大部分復(fù)合物2的非特異性吸附。同時通過磁力將樣本中的復(fù)合物1分離到鞘流芯片的上層，實現(xiàn)目標細胞的富集和分離(圖1)。完成富集后，通過熒光顯微鏡掃描鞘流芯片，實現(xiàn)目標細胞的識別以及檢測[13-14]。

1.2.2對cfDNA突變情況的檢測 采用德國Qiagen QiAamp ccfDNA kit提取病人外周血液中的DNA。采集血樣后4 h內(nèi)進行處理，采用紅細胞裂解液裂解紅細胞，提取cfDNA。所用測序儀器為美國Thermo Fisher Ion Torrent S5XL，采用Thermo Ion Reporter軟件以及Cynvenio TargetCall生物信息分析軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析。ClearIDTM為美國Cynvenio公司針對癌種定制的腫瘤檢測試劑盒，本研究采用的為ClearIDTM定制的“27基因”乳癌檢測試劑盒。

圖1 鞘流示意圖

1.3 結(jié)果判定及意義

ClearIDTM支持CTC和cfDNA的檢測，報告閾值為1.0%，以該閾值為突變陽性判斷標準。經(jīng)過先前的實驗驗證，基因檢測在正常的cfDNA以及以細胞為基礎(chǔ)的質(zhì)控中顯示假陽性的概率為0.001 0%～0.000 7%。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21軟件進行統(tǒng)計處理。采用卡方檢驗及McNemer檢驗比較樣本中CTC及cfDNA突變陽性率，采用Kappa檢驗判斷2種檢測方法結(jié)果是否具有一致性[15]。

2 結(jié) 果

2.1 CTC與cfDNA突變檢出結(jié)果

對211例病人標本進行檢測顯示，163例病人在至少一個標本中發(fā)現(xiàn)突變，48例病人在標本中未發(fā)現(xiàn)任何突變；59例檢出突變的病人在連續(xù)2次采集的血標本中發(fā)現(xiàn)突變；18例病人在連續(xù)2次采集的標本中發(fā)現(xiàn)相同的突變；1例病人在連續(xù)2次采集的標本中發(fā)現(xiàn)CTC及cfDNA均有突變。

211例病人共采集826份血標本，其中，cfDNA標本突變的檢出率為22.84%，CTC標本突變的檢出率為19.84%，同一病人在cfDNA及CTC標本中都檢出突變的概率為4.28%。同時，選取其中進行了cfDNA與CTC兩項檢測的病人共檢測血標本194份，cfDNA和CTC兩種檢測結(jié)果差異有顯著性(χ2=3.108，P<0.05)；2種檢測結(jié)果的一致性較差(Kappa=0.091)。見表1。在373份檢出突變標本中，TP53、PIK3CA以及EGFR突變的檢出率分別為52%、33%、7%。

表1 194份血標本cfDNA及CTC檢出突變情況 (份)

2.2 腫瘤復(fù)發(fā)病人的突變情況

截止到2017年5月，共有11例病人出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)部位10例為乳腺，1例為卵巢。11例病人從治療到復(fù)發(fā)平均時間為21個月。對該11例發(fā)生復(fù)發(fā)的病人CTC及cfDNA情況進行分析，發(fā)現(xiàn)所有復(fù)發(fā)病人，都在連續(xù)的血標本中檢測出腫瘤相關(guān)突變。對比11例復(fù)發(fā)病人的多次檢測結(jié)果，在連續(xù)的檢測中持續(xù)檢出相同突變的概率為36%，而這些相同的突變中，僅有約50%可以在cfDNA與CTC中都被檢出。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，大部分(77.25%)TNBC病人被發(fā)現(xiàn)在至少一個液體活檢標本(cfDNA或CTC)中檢測出了基因突變類型。其中，TP53、PIK3CA、EGFR為檢出率最高的3種突變類型。TP53的檢出率為52%，與已有研究結(jié)果相比較低[16]。TP53是人體重要的抑癌基因，在正常細胞中低表達，在惡性腫瘤中高表達[16]。TP53基因翻譯的P53蛋白是細胞生長、增殖和損傷修復(fù)的重要調(diào)節(jié)因子[8,17-20]。PIK3CA以及EGFR都屬于原癌基因[21-24]。EGFR一直是TNBC領(lǐng)域的研究熱點[25]，三陰性乳癌中，EGFR陽性表達情況與腫瘤的組織學(xué)分級有關(guān)，與其治療預(yù)后也有相關(guān)性[4,26-27]。這也為新藥研發(fā)帶來了啟示，EGFR有可能會成為TNBC有效的治療靶點[28-29]。

與無腫瘤復(fù)發(fā)的病人相比，出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的病人均能在cfDNA或CTC檢測中發(fā)現(xiàn)突變。而對比cfDNA與CTC的檢測結(jié)果，認為兩種檢測源攜帶不一致的突變信息，同時檢測cfDNA及CTC能夠更完整地反映病人的基因突變情況，可以對病人的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險做更準確的評估。

STOVER等[30]的一項Meta分析研究納入了1 419例接受新輔助化療前的乳癌病人，采用空心針穿刺乳腺組織獲取標本后，綜合分析其基因信息及臨床特征。該研究認為，病人的病理完全緩解率和增殖相關(guān)基因發(fā)生突變的關(guān)系密切。針對TNBC病人，研究者篩選出60個具有預(yù)測價值的突變基因，其中有38個基因與細胞增殖相關(guān)。該研究也從理論層面表明了，可以通過對病人基因突變情況進行分析，用來作為TNBC病人復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的評估預(yù)測方法。

液態(tài)活檢技術(shù)在TNBC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的監(jiān)測中有明顯優(yōu)勢，該研究展示了使用多模板的方法連續(xù)監(jiān)測的應(yīng)用效果，認為連續(xù)監(jiān)測的結(jié)果能夠預(yù)測病人的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。同時，通過對突變情況進行分析，也更好地理解了TNBC這種具有高度特異性腫瘤的生物學(xué)特點[4,23,26]。本項研究仍然需要進一步完善，因為隨著隨訪時間的延長，可能會有更多的病人發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)。通過對數(shù)據(jù)進行再次分析，可以得到更多對TNBC診療有指導(dǎo)意義的結(jié)果。

[1] 石愛平,徐格格,解新鵬. St.Gallen會議乳腺癌新輔助治療回顧[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2017,56(1):1-6.

[2] 葉青,江澤飛. 三陰性乳腺癌精準治療的機遇[J]. 中國腫瘤臨床, 2016,43(24):1074-1077.

[3] 趙新,吳世凱,孟祥穎,等. 三陰乳腺癌受體表型轉(zhuǎn)化情況對乳腺癌患者臨床預(yù)后的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2012,37(4):322-326.

[4] 朱明華, 陽澤龍,胡朔楓,等. 三陰性乳腺癌臨床病理特征及其與預(yù)后的關(guān)系[J]. 空軍醫(yī)學(xué)雜志, 2015,31(2):89-91.

[5] 鄭紅梅,李祥,金立亭,等. 三陰性乳腺癌基因?qū)W分子分型和個體化治療新進展[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2016,23(17):80-86.

[6] 李慧慧. 三陰性乳腺癌干細胞的分離、鑒定及生物學(xué)行為的初步研究[D]. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2012.

[7] DREYER G, VANDORPE T, SMEETS A, et al. Triple ne-gative breast cancer: Clinical characteristics in the different histological subtypes[J]. Breast, 2013,22(5):761-766.

[8] MADIC J, KIIALAINEN A, BIDARD F C, et al. Circulating tumor DNA and circulating tumor cells in metastatic triple negative breast cancer patients[J]. Int J Cancer, 2015,136(9):2158-2165.

[9] LIU Y, LIU Q, WANG T, et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: A valuable prognostic and predictive biomarker[J]. BMC Cancer, 2013,13(1):202.

[10] ZHANG S, LEI L, TAO W, et al. Real-time Her2 status detected on circulating tumor cells predicts different outcomes of anti-her2 therapy in histologically her2-positive metastatic breast cancer patients[J]. BMC Cancer, 2016,16(1):526.

[11] CHO M, XIAO Y, NIE J, et al. Quantitative selection of DNAaptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(35):15373-15378.

[12] LOWES L E, BRATMAN S V, DITTAMORE R, et al. Circulating tumor cells (ctc) and cell-free DNA (cfdna) workshop 2016: Scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation[J]. Int J Mol Sci, 2016,17(9): e1505.

[13] WINER-JONES P, VAHIDI B, ARQUILEVICH N, et al. Circulating tumor cells: clinically relevant molecular access based on a novel ctc flow cell[J]. PLoS One, 2014,9(1): e86717.

[14] STRAUSS M, CARTER C, SIMMONS J, et al. Analysis of tumor template from multiple compartments in a blood sample provides complementary access to peripheral tumor biomarkers[J]. Oncotarget, 2016,7(18):26724-26738.

[15] 孫振球. 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)[M]. 3版.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2010:662-663.

[16] SZéKELY B, SILBER A L, PUSZTAI L. New therapeutic strategies for triple-negative breast cancer[J]. Oncology, 2017,31(2):130.

[17] 謝廣東,江一舟,邵志敏. 三陰性乳腺癌新輔助化療療效預(yù)測標志物研究進展[J]. 實用腫瘤雜志, 2017,32(6):26-29.

[18] STEPONAVICIENE L, LACHEJ-MIKEROVIENE N, SM-AILYTE G, et al. Triple negative breast cancer-prognostic factors and survival[J]. Adv Med, 2011,56(2):285-290.

[19] GONZ A,RAMOS J, PAZ J, et al.Multi-agent system for obtaining relevant genes in expression analysis between young and older women with triple negative breast cancer[J]. J Integr Bioinform, 2015,12(4):1-14.

[20] SPUGNESI L, GABRIELE M, TANCREDI M, et al. A possible genetic signature of DNA repair genes in triple negative breast cancers by a NGS approach[J]. Eur JCancer, 2014,50:S112-S113.

[21] 朱明華,陽澤龍,胡朔楓,等. 三陰性乳腺癌臨床病理特征及其與預(yù)后的關(guān)系[J]. 空軍醫(yī)學(xué)雜志, 2015,2:89-91.

[22] 李箏,陳紅娜,王蓓. 三陰性乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后分析[J]. 臨床醫(yī)學(xué), 2017,37(10):79-80.

[23] 李華民. EGFR、Ki67在三陰性與非三陰性乳腺癌中的表達及其與TNBC病理特征的相關(guān)性[J]. 實用癌癥雜志, 2017,11:1759-1762.

[24] GOETZ M P, KALARI K R, SUMAN V J, et al. Tumor sequencing and patient-derived xenografts in the neoadjuvant treatment of breast cancer[J]. J Natl Cancer I, 2017,109(7):1.

[25] CORKERY B, CROWN J, CLYNES M, et al. Epidermal growth factor receptor as a potential therapeutic target in triple-negative breast cancer[J]. Ann Oncol, 2009,20(5):862.

[26] 萬宇,黃建軍,包剛. 三陰性乳腺癌的臨床病理特征和EGFR、Ki67的表達及相關(guān)性[J]. 江西醫(yī)藥, 2016,51(4):291-293.

[27] LIU Z, HE K, MA Q, et al. Autophagy inhibitor facilitates gefitinib sensitivity in vitro and in vivo by activating mitochondrial apoptosis in triple negative breast cancer[J]. PLoS One, 2017,12(5): e0177694.

[28] TUNCA B, EGELI U,CECENER G, et al. Ck19, ck20, egfr and her2 status of circulating tumor cells in patients with breast cancer[J]. Tumori, 2012,98(2):243.

[29] OVCARICEK T, FRKOVIC S G, MATOS E, et al. Triple negative breast cancer-prognostic factors and survival[J]. Radiol Oncol, 2010,45(1):46.

[30] STOVER D G, COLOFF J L, BARRY W T, et al. The role of proliferation in determining response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer: A gene expression-based meta-analysis[J]. Clin Cancer Res, 2016,22(24):6039-6050.