幸晶晶 ， 馬立安 ， 余維初

（1.石油石化污染物控制與處理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；3.長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北荊州434025）

0 引言

鉆井廢水成分復(fù)雜、水質(zhì)多變、排放點(diǎn)分散，其主要水質(zhì)表征為：COD濃度高，廢水可生化性差；色度較高；固體懸浮物含量較多[1-3]。三磺鉆井液體系是國(guó)內(nèi)油田普遍采用的一種性能優(yōu)良、價(jià)格低廉的耐高溫型鉆井液體系，主要用于井深達(dá)到2000～3000 m以上時(shí)的深井鉆井過(guò)程，目前在國(guó)內(nèi)各油田都有大量的使用。三磺鉆井液體系就是添加劑主要組成為磺化酚醛樹(shù)脂（SMP）、磺化褐煤（SMC）、磺化烤膠（SMK）、磺化瀝青等的鉆井液體系，也稱為磺化鉆井液體系[4]。

磺化瀝青是一種以石油烴基化合物為原料經(jīng)過(guò)硫酸等物質(zhì)進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)處理而得到的一種改性的高分子化合物。是經(jīng)過(guò)磺化、氧化和乳化等改性化學(xué)處理得到的產(chǎn)品[5-8]。該實(shí)驗(yàn)旨在研究三磺鉆井液體系中的磺化瀝青的降解菌及降解特性。

對(duì)于油田鉆井廢液的處理方法主要有物化法、化學(xué)法、生物法組合和工藝處理法4大類[9-11]。其中物化法、化學(xué)法及工藝處理法在處理過(guò)程中存在造價(jià)過(guò)高或處理不達(dá)標(biāo)及造成二次污染等其他問(wèn)題[12-18]。隨著微生物處理技術(shù)的深化研究和工程實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，生物處理技術(shù)在有毒、有害有機(jī)工業(yè)廢水的治理中已得到了廣泛的應(yīng)用[19-22]。張淑俠等[23]針對(duì)聚磺鉆井液廢水中有機(jī)物含量高、降解難度大的特點(diǎn)，研究了用高效復(fù)合菌劑 BS5 處理經(jīng)生化預(yù)處理工藝后排出的廢水， 當(dāng)優(yōu)勢(shì)菌劑加量為 0.5 g·L-1， 曝氣量為 0.25 L·min-1， 污泥沉降比為25%～35%時(shí)， COD去除率大于87%。馮栩等[24]通過(guò)從受鉆井廢水污染的土壤樣品中篩選菌株進(jìn)行生物處理實(shí)驗(yàn)[25]，并加入20 mg·L-1的硫酸銨來(lái)提高降解率，用其處理COD范圍為1369～1655 mg·L-1的鉆井液廢水，通過(guò)曝氣作用，使得有機(jī)物去除率達(dá)到42%，且運(yùn)行過(guò)程中耐沖擊負(fù)荷性和穩(wěn)定性均較好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

菌種來(lái)源：新疆克拉瑪依油田磺化鉆井液，鉆井口附近離地表15～20 cm的油田鉆井液，進(jìn)行多點(diǎn)取樣后裝入無(wú)菌袋存于實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱中密封保存。

磺化瀝青：由重慶大方提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ： 5 g 牛肉膏、 10 g 蛋白胨、5 g NaCl 、1 L 蒸餾水、pH 值 為 7.0。

無(wú) 機(jī) 鹽 培 養(yǎng) 基 ： 0.5 g KCl、1.5 g NaNO3、1 g K2HPO4、 0.5 g MgSO4、 1.5 g （NH4）2SO4、5 g NaCl、 0.01 g CaCl2、 0.01 g FeSO4、 1 L H2O。

富集馴化/篩選降解培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加入0.5%的磺化瀝青。

分離培養(yǎng)基：富集馴化/篩選降解培養(yǎng)基加入50%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，2%瓊脂。

擴(kuò)大培養(yǎng)基：富集馴化/篩選降解培養(yǎng)基加入50%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集、馴化

分別稱取各污染土壤1 g，加入到以磺化瀝青為唯一碳源的富集馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行富集、馴化。培養(yǎng)條件為 35 ℃、150 r/min，培養(yǎng) 5 d 后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，吸取5 mL馴化菌液，加入到新的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代馴化。馴化周期為5 d，連續(xù)馴化5個(gè)周期后，加入到分離擴(kuò)大培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得以磺化瀝青為唯一碳源生長(zhǎng)的混合菌液。

1.2.2 菌種的分離、純化、篩選

取混合菌液，10倍系列稀釋涂布于分離培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)獲得單菌落。觀察菌落生長(zhǎng)情況，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小、邊緣特征等挑選不同類型的單菌落，命名為X1-n。再進(jìn)行劃線分離、純化，鏡檢，獲得純種單菌落，回接篩選培養(yǎng)基中篩選降解效果，對(duì)降解效果好的純種單菌落做生理生化及分子鑒定。

1.2.3 菌種的生理生化及分子鑒定

（1）生理生化鑒定：參考《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定：用接種環(huán)挑取少量菌體，置于1.5 mL離心管中，加入30 μL去離子水，振蕩使菌體分散，蓋緊離心管并用封口膜密封，置于微波爐中使用中火加熱2 min，加熱后立即將離心管冰浴 2 min，然后 12 000 r/min，離心 1 min，吸上清液置于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〖?xì)菌DNA為模板，通用引物（27F和1492R）擴(kuò)增16S rRNA基因，PCR 反 應(yīng) 體 系 為（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物 27F/1492R（10 μmoL）各 2 μL，模板 DNA 3 μL，ddH20 18 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?：94 ℃ 4 min ；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，交至武漢生工測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)分析，并通過(guò)MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 菌種的降解特性研究

1）單因素實(shí)驗(yàn)。

①溫度：準(zhǔn)確量取50 mL的篩選培養(yǎng)基于150 mL的錐形瓶中，接入5%的擴(kuò)大培養(yǎng)菌液，分別放在25、28、31、34、37 ℃（分別設(shè)為 W1、W2、W3、W4、W5），轉(zhuǎn)速為 150 r/min 的恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)7 d，5個(gè)周期，分別測(cè)定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長(zhǎng)溫度。

②pH值：準(zhǔn)確量取50 mL的篩選培養(yǎng)基于150 mL的錐形瓶中，分別調(diào)pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5（分別 設(shè) 為 pH值 1、pH 值 2、pH 值 3、pH 值 4、pH 值 5），接入 5% 的擴(kuò)大培養(yǎng)菌液，34 ℃、150 r/min下培養(yǎng)7 d，5個(gè)周期，分別測(cè)定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長(zhǎng)pH值。

③P源：準(zhǔn)確量取50 mL的篩選培養(yǎng)基于150 mL的錐形瓶中，將培養(yǎng)基的P源分別配制為K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4（ 分 別 設(shè)為 P1、P2、P3、P4），在 34 ℃、150 r/min 下培養(yǎng)7 d，5個(gè)周期，分別測(cè)定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長(zhǎng)磷源。

④N源：準(zhǔn)確量取50 mL的篩選培養(yǎng)基于150 mL的錐形瓶中，將培養(yǎng)基的N源分別配制為NaNO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3（分別設(shè)為N1、N2、N3、N4、N5），接入5%的擴(kuò)大培養(yǎng)菌液，在 34 ℃、150 r/min 下培養(yǎng) 7 d，5 個(gè)周期，分別測(cè)定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳生長(zhǎng)氮源。

⑤鹽濃度：準(zhǔn)確量取50 mL的篩選培養(yǎng)基于150 mL的錐形瓶中，將NaCl分別按0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（分別設(shè)為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5）的量配制培養(yǎng)基，接入5%的擴(kuò)大培養(yǎng)菌液，在 34 ℃、150 r/min 下培養(yǎng) 7 d，5 個(gè)周期，分別測(cè)定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳鹽濃度。

⑥接種量：準(zhǔn)確量取50 mL的篩選培養(yǎng)基于150 mL的錐形瓶中，分別按2%、4%、6%、8%、10%（分別設(shè)為J1、J2、J3、J4、J5）接入擴(kuò)大菌液。34 ℃、150 r/min 下培養(yǎng) 7 d，5 個(gè)周期，分別測(cè)定OD600 nm的吸光值。研究該菌種的最佳接種量。

2）正交實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳P源N源后，選取溫度、pH值、鹽濃度和接種量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。在最佳條件下設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)7 d、5周期后，測(cè)量菌株生長(zhǎng)量以及COD的降解率。

1.2.5 COD降解率的測(cè)定

使用DR1010COD測(cè)定儀測(cè)定磺化瀝青培養(yǎng)基的COD值。使用移液管吸取2 mL樣品加入到消解管中，緩慢上下顛倒多次以后用干凈的紙巾擦干，并采用等量去離子水設(shè)置為對(duì)照。將加入了樣品的消解管插入預(yù)熱的DRB200反應(yīng)器中加熱2 h。反應(yīng)完成后。待溫度降低到120 ℃時(shí)便可以取出，輕輕晃動(dòng)待消解管冷卻到室溫后使用比色法測(cè)定COD。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、鑒定

經(jīng)過(guò)富集、馴化、純化分離后，得到能以磺化瀝青為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株。形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果如圖1、圖2。

圖1 X2的顯微結(jié)構(gòu)鏡檢圖

圖2 X2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖1可知，該菌為產(chǎn)芽孢的短桿菌。圖2結(jié)果表明X2與大洋沉積芽孢桿菌相似度最高，暫命名為大洋沉積芽孢桿菌X2。

2.2 降解特性研究

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1）溫度對(duì)X2生物生長(zhǎng)量的影響。溫度條件處理對(duì)X2的生物生長(zhǎng)量影響如圖3所示，對(duì)培養(yǎng)5個(gè)周期的菌液進(jìn)行OD600的吸光度測(cè)量。由圖3可知，5個(gè)周期過(guò)程中，菌株生長(zhǎng)量呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)。其中W4條件下菌株的生長(zhǎng)量最大，確定溫度為34 ℃時(shí)是最佳培養(yǎng)條件。

圖3 不同溫度處理對(duì)菌株X2生長(zhǎng)量的影響

2）pH值對(duì)X2生物生長(zhǎng)量的影響。pH值條件處理對(duì)X2的生物生長(zhǎng)量影響如圖4所示，對(duì)培養(yǎng)5個(gè)周期的菌液進(jìn)行OD600的吸光度測(cè)量。由圖4可知，5個(gè)周期過(guò)程中，菌液生長(zhǎng)狀態(tài)起伏較大。其中在第5個(gè)周期時(shí)pH值為4狀態(tài)下菌株的生長(zhǎng)量最大，確定pH值為8.0時(shí)是最佳培養(yǎng)條件。

圖4 不同pH值處理對(duì)菌株X2生長(zhǎng)量的影響

3）P源對(duì)X2生物生長(zhǎng)量的影響。不同P源條件處理對(duì)X2的生物生長(zhǎng)量影響如圖5所示，對(duì)培養(yǎng)5個(gè)周期的菌液進(jìn)行OD600的吸光度測(cè)量。由圖5可知，5個(gè)周期過(guò)程中，菌液生長(zhǎng)狀態(tài)起伏較小，但不同P源處理間的差異較大。其中在P2的處理狀態(tài)下菌株的生長(zhǎng)情況處于先上升后平緩的趨勢(shì)，并且在第2、3、4周期時(shí)均大于其他P源處理下的生長(zhǎng)量。因此確定P源為KH2PO4時(shí)是最佳培養(yǎng)條件。

圖5 不同P源處理對(duì)菌株X2生長(zhǎng)量的影響

4）N源對(duì)X2生物生長(zhǎng)量的影響。不同N源條件處理對(duì)X2的生物生長(zhǎng)量影響如圖6所示，對(duì)培養(yǎng)5個(gè)周期的菌液進(jìn)行OD600的吸光度測(cè)量。

圖6 不同N源處理對(duì)菌株X2生長(zhǎng)量的影響

由圖6可知，5個(gè)生長(zhǎng)周期過(guò)程中，同種處理不同階段下的菌液生長(zhǎng)量差異較小。但是不同N源處理下的菌液生長(zhǎng)量差異較大，其中N4處理狀態(tài)下菌液生長(zhǎng)量最大。因此確定N源為NH4NO3時(shí)為最佳培養(yǎng)條件。

5）鹽濃度對(duì)X2生物生長(zhǎng)量的影響。不同NaCl濃度條件處理對(duì)X2的生物生長(zhǎng)量影響見(jiàn)圖7，對(duì)培養(yǎng)5個(gè)周期的菌液進(jìn)行OD600的吸光度測(cè)量。

圖7 不同鹽濃度處理對(duì)菌株X2生長(zhǎng)量的影響

由圖7可知，5個(gè)周期過(guò)程中，5種處理?xiàng)l件下的菌液生長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升狀態(tài)。其中Y5處理?xiàng)l件下菌株的生長(zhǎng)量最大，確定鹽濃度為1%時(shí)是最佳培養(yǎng)條件。

6）接種量對(duì)X2生物生長(zhǎng)量的影響。不同接種量條件處理對(duì)X2的生物生長(zhǎng)量影響如圖8所示，對(duì)培養(yǎng)5個(gè)周期的菌液進(jìn)行OD600的吸光度測(cè)量。由圖8可知，5個(gè)周期過(guò)程中，5種處理?xiàng)l件下的菌液生長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升狀態(tài)。其中J5處理?xiàng)l件下菌株的生長(zhǎng)量始終大于其他4個(gè)條件處理。確定接種量為10%時(shí)是最佳培養(yǎng)條件。

圖8 不同接種量處理對(duì)菌株X2生長(zhǎng)量的影響

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

1）X2生長(zhǎng)量正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。在單因素實(shí)驗(yàn)中確定P源為KH2PO4，N源為NH4NO3為最佳條件下，設(shè)置不同溫度、pH值、鹽濃度和接種量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

表2 X2生物量正交實(shí)驗(yàn)及其分析表

由表2可以看出，X2菌株在溫度為36 ℃、pH值為7.8、鹽濃度為1%、接種量為10%時(shí)為最佳培養(yǎng)條件。其中pH值的R極差最大，是影響菌株生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，其次為鹽濃度、溫度、接種量。

2）X2的COD降解率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。由表3可以得出，COD最佳降解條件：溫度為36℃、pH值為8.2、鹽濃度為0.9%、接種量為12%，降解率在59%～71%，在34 ℃、pH值為8.2、鹽濃度為0.9%、接種量為10%時(shí)降解率達(dá)到最大值71%。pH值的R極差最大，達(dá)到0.068，其次為溫度、接種量、鹽濃度。

表3 X2的COD降解正交實(shí)驗(yàn)及其分析表

3 結(jié)果與討論

獲得一株降解磺化瀝青的芽孢短桿菌，命名為大洋沉積芽孢桿菌X2。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示：X2分別在溫度為34 ℃、pH值為8.0、P源為KH2PO4、N源為NH4NO3、鹽濃度為10%、接種量為10%時(shí)為最佳生長(zhǎng)環(huán)境。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定當(dāng)溫度為36 ℃、pH值為8.2、鹽濃度為0.9%、接種量為12%，X2對(duì)磺化瀝青COD的降解率達(dá)59%～71%。pH值的R極差最大，是同時(shí)影響菌株生長(zhǎng)及COD降解的關(guān)鍵因子，其次為溫度、接種量、鹽濃度。

利用微生物降解磺化瀝青，降解過(guò)程中微生物生長(zhǎng)情況良好，可以反映出磺化瀝青得到了一定的降解。但是在離心過(guò)程中容易產(chǎn)生誤差，故而建議在后期研究過(guò)程中可以選擇測(cè)量濃度及結(jié)構(gòu)式進(jìn)一步確定磺化瀝青的降解效率。在正交實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，菌體生長(zhǎng)的最佳條件與降解的最佳條件不完全相同，因此在降解修復(fù)過(guò)程需要采取分段式控制其參數(shù)，有利于菌體生長(zhǎng)與降解COD均在最佳條件下進(jìn)行。在最佳降解條件下的COD 降解率有待下一步驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)一步研究。