馮英慧， 悅 沖， 樊保國(guó)

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000)

桃(PrunuspersicaL.)為薔薇科李亞屬的一種落葉喬木，原產(chǎn)我國(guó)西北高原，至今已有3 000多年的栽培歷史，是世界上栽培最為廣泛的果樹樹種之一[1]。在山西省內(nèi)桃樹栽培范圍廣，栽培歷史悠久，品種繁多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前山西省桃樹栽植面積3.6萬(wàn)hm2，產(chǎn)量約5.5萬(wàn)t，其中晉中、太原是山西省桃集中產(chǎn)區(qū)。另外還有晉南、晉東南、臨汾盆地等主要栽培區(qū)，太原以北也有栽培，但由于氣候因素，種植比重較小?？购允欠从彻麡鋵?duì)環(huán)境適應(yīng)性的重要指標(biāo)之一，也是限制果樹種植地區(qū)范圍的重要因素之一。因此，選育抗寒性桃樹品種，對(duì)于指導(dǎo)桃樹適地適栽及擴(kuò)大栽培范圍具有重要的意義。

桃樹的枝條、花芽在北方冬季易受到嚴(yán)寒的危害，導(dǎo)致?lián)p傷甚至死亡。桃樹抗寒性研究已有不少報(bào)道[2-7]，但是大多是通過田間調(diào)查來(lái)鑒定桃樹抗寒性[2-3，5-6]，據(jù)調(diào)查凍害大約每10年發(fā)生1次，用這種方法鑒定桃樹品種抗寒性大概需要10年的時(shí)間。因此，筆者在前人對(duì)桃樹抗寒性研究的基礎(chǔ)上，選擇了在山西省桃樹生產(chǎn)中有一定栽培面積和發(fā)展前景的10個(gè)品種作為供試品種，測(cè)定其休眠枝條多個(gè)生理生化指標(biāo)。利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對(duì)多個(gè)抗寒性生理指標(biāo)進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，并對(duì)10個(gè)毛桃品種的抗寒性進(jìn)行排序，同時(shí)與生長(zhǎng)恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，以便能更全面地比較品種間的抗寒性差異，以期獲得桃樹品種抗寒性鑒定的有效方法，為桃樹抗寒資源的篩選與應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料于2015年12月24日在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所桃樹示范園選取，選取的10個(gè)毛桃品種樹齡均在10～15年，其中早金、錦玉、21010是早熟品種，大久保、75614、崗山白是中熟品種，晚蜜、天王、華玉、9618是晚熟品種。隨機(jī)剪取各品種無(wú)病蟲害的帶休眠芽1年生健壯枝條，每品種剪取20根，迅速裝入塑封袋密封，做好標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)處理

將枝條用自來(lái)水沖洗(注意沖洗過程中保護(hù)休眠芽不受損傷)，以洗凈枝條表面的灰塵和雜質(zhì)，然后用干凈紗布將枝條擦干(在擦洗過程中應(yīng)保證休眠芽完好無(wú)損)。擦干水分后，將每個(gè)品種分成9份，塑封袋包裹，做好標(biāo)記。1份作為對(duì)照材料不做冷凍處理，其余8份放于超低溫冰箱中，分別以-3 ℃/h的速度降至預(yù)定溫度，分別設(shè)置-10、-15、-20、-25、-30、-35 ℃處理；結(jié)合實(shí)際，考慮到-20 ℃以上或以下低溫可能持續(xù)的時(shí)間，所以在達(dá)到所需溫度后，-10、-15、-20 ℃分別維持72 h，-25、-30、-35 ℃分別維持24 h，對(duì)-20 ℃低溫處理，分別在24、48、72 h后各取出1次。將低溫處理結(jié)束后取出的樣品放置于-4 ℃冰箱中解凍24 h，再放于室溫中恢復(fù)12 h然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定時(shí)每個(gè)處理均重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生理指標(biāo)的測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定[8]：將低溫處理后的枝條切成小薄片(避開芽眼)稱取3份，每份0.3 g，分別置于刻度試管中，加20 mL去離子水，加塞在室溫下靜置12 h后，用電導(dǎo)儀測(cè)定浸提液的電導(dǎo)率S1，以代表植物組織電解質(zhì)外滲值。然后將試管在沸水浴中煮沸30 min，取出靜置 12 h 后，再次測(cè)定植物組織全部被破壞后浸提液的電導(dǎo)率S2，以代表植物組織原生質(zhì)膜被破壞后所滲出的電解質(zhì)的總含量，每處理重復(fù)3次。計(jì)算公式：電解質(zhì)外滲率=S1/S2×100%。

采用硫代巴比妥酸TBA顯色法[9]測(cè)定丙二醛(MDA)含量，用蒽酮比色法[10]測(cè)可溶性糖含量，可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[10]，以酸性茚三酮法[9]測(cè)游離脯氨酸含量，用氮藍(lán)四唑法測(cè)定SOD活性[11]，以愈創(chuàng)木酚法[9]測(cè)定POD活性。

1.3.2 恢復(fù)生長(zhǎng)法[12]將各低溫處理后的枝條置于25 ℃智能光照培養(yǎng)箱中，水培20 d，每天觀察記錄枝段成活數(shù)(枝段能發(fā)生愈傷組織、生根、發(fā)芽或保持綠色)，累計(jì)發(fā)芽數(shù)。待發(fā)芽數(shù)恒定后，計(jì)算成活芽百分率，作為材料恢復(fù)生長(zhǎng)能力的指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行計(jì)算和作圖，用SPSS 17.0進(jìn)行相關(guān)性分析以及主成分分析。

1.5 綜合評(píng)價(jià)方法

參照柳新紅等對(duì)翅莢木[13]、唐婉等對(duì)紫薇屬植物[14]和王琳等對(duì)扁桃品種[15]進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)的方法。

1.5.1 主成分的確定 不同指標(biāo)對(duì)抗寒性的影響力度不同，因此對(duì)所測(cè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，以特征值λ>1為標(biāo)準(zhǔn)確定主成分個(gè)數(shù)。

1.5.2 權(quán)重的確定 根據(jù)各指標(biāo)負(fù)荷量(F)與貢獻(xiàn)率(Y)，計(jì)算出各指標(biāo)在各主成分中的分值(F×Y)，以確定權(quán)重(Wi)，從而確定各指標(biāo)對(duì)抗寒性作用所占比重。計(jì)算公式如下：

Wi=Di/∑Di。

式中：Di表示某指標(biāo)對(duì)抗寒性作用大小，F(xiàn)ij表示該指標(biāo)在第j個(gè)主成分上的負(fù)荷量，Yij表示第j個(gè)主成分的貢獻(xiàn)值。

1.5.3 隸屬函數(shù)值得確定 指標(biāo)與抗寒性呈正相關(guān)，公式為：

Zij=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin) 。

指標(biāo)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)，公式為：

Zij(反)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin) 。

式中：Zij表示第i個(gè)品種第j項(xiàng)指標(biāo)的抗寒性隸屬函數(shù)值，Xij表示第i個(gè)品種第j項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax、Xmin表示所以參試品種中第j項(xiàng)指標(biāo)的最大和最小測(cè)定值。

1.5.4 綜合評(píng)價(jià)指數(shù) 將各指標(biāo)權(quán)重(Wi)與各指標(biāo)隸屬度值(Zij)相乘，計(jì)算出各毛桃品種抗寒性綜合指數(shù)(I)，公式為：I=∑(Wi×Zij)。根據(jù)抗寒性綜合指數(shù)大小確定抗寒性大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 恢復(fù)生長(zhǎng)情況

樹木枝條在遭受凍害后的萌芽率是估計(jì)受凍害程度最直觀的方法[13]，因此恢復(fù)生長(zhǎng)法的結(jié)果通常用來(lái)驗(yàn)證其他抗寒性研究方法適用性和準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同低溫處理后，各毛桃品種均受到不同程度的傷害，枝條萌芽率均隨著溫度的降低和處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。其中，在-20 ℃處理 72 h 后，各品種發(fā)芽率降低明顯，除大久保和21010外，其他各品種均降到50%以下，說明這幾個(gè)毛桃品種適宜在-20 ℃低溫持續(xù)72 h以下的地區(qū)栽植。在-25 ℃處理后，21010、大久保、崗山白和75614這幾個(gè)品種發(fā)芽率在35%以上，耐寒性較強(qiáng)；-30 ℃處理后，天王、華玉、晚蜜這3個(gè)品種的發(fā)芽率為0，耐寒性較弱(表1)。

表1 不同溫度處理下毛桃枝條的萌芽率

2.2 生理指標(biāo)相關(guān)關(guān)系分析

研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)電導(dǎo)率與MDA含量呈極顯著正相關(guān)，與SOD活性、3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明抗寒性強(qiáng)的品種，細(xì)胞膜受損程度輕，丙二醛積累較少，電解質(zhì)外滲率相對(duì)較低，保護(hù)酶SOD活性高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量高。2種保護(hù)酶活性之間、3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量之間都呈極顯著正相關(guān)。可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量與其他各指標(biāo)都呈極顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)(表2)?？梢姼髦笜?biāo)間存在一定的相關(guān)性，從而使其所提供的抗寒性信息有一定的重疊現(xiàn)象，所以不能依賴某一個(gè)指標(biāo)對(duì)品種的抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表2 低溫脅迫處理后毛桃品種枝條生理指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣

注：“**”表示在0.01水平上顯著相關(guān)；“*”表示在0.05水平上顯著相關(guān)。

2.3 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

2.3.1 主成分分析 對(duì)低溫處理后毛桃休眠枝的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，得到其特征值和貢獻(xiàn)率(表3)。特征值是指主成分的影響力度大小，一般以1為標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樘卣髦敌∮?說明該成分還不如一個(gè)基本變量的影響力大，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，只能提取前2個(gè)主成分。第1主成分的特征值為3.6，貢獻(xiàn)率為51.426%，第2主成分的特征值為1.528，貢獻(xiàn)率為21.829%，2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為73.255%，說明這2個(gè)主成分已經(jīng)把不同品種的毛桃抗寒性73.255%的信

表3 各成分的特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率

息反映出來(lái)。按照上式(1)、(2)，確定權(quán)重(Wi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1主成分主要反映相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量和脯氨酸含量與抗寒性關(guān)系，第2主成分主要反映SOD活性、POD活性、可溶性蛋白質(zhì)含量和可溶性糖含量這4個(gè)指標(biāo)抗寒性信息。根據(jù)抗寒指標(biāo)權(quán)重大小得知，與參試毛桃品種抗寒性關(guān)系最大的指標(biāo)是可溶性蛋白質(zhì)含量，以下依次是SOD活性、脯氨酸含量、相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量(表4)。

表4 抗寒指標(biāo)的負(fù)荷量和權(quán)重

2.3.2 抗寒指標(biāo)隸屬度 按照上式(3)、(4)計(jì)算各品種各項(xiàng)生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值(表5)。

表5 低溫脅迫后毛桃品種枝條的各生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

2.3.3 抗寒性綜合指數(shù)值 根據(jù)抗寒性綜合指數(shù)的大小，參試毛桃品種的抗寒能力從強(qiáng)到弱依次為：大久保>崗山白>75614>21010>早金>錦玉>9618>華玉>晚蜜>天王(表6)。

3 結(jié)論

低溫脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，單一指標(biāo)對(duì)各品種抗寒性強(qiáng)弱反應(yīng)不甚一致。采用主成分分析法將彼此錯(cuò)綜復(fù)雜的7個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，選取了2個(gè)主成分并計(jì)算各成分的貢獻(xiàn)率，根據(jù)主成分的負(fù)荷量，計(jì)算各指標(biāo)對(duì)抗寒性作用的大小，確定權(quán)重。結(jié)果表明，可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、脯氨酸含量、相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量可以作為桃樹抗寒性評(píng)價(jià)的重要參考指標(biāo)。根據(jù)各個(gè)指標(biāo)權(quán)重和每個(gè)品種的隸屬函值，進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)得出10個(gè)毛桃品種抗寒性的強(qiáng)弱順序?yàn)椋捍缶帽?崗山白>75614>21010>早金>錦玉>9618>華玉>晚蜜>天王。

表6 各桃品種抗寒性綜合指數(shù)

根據(jù)生長(zhǎng)恢復(fù)法試驗(yàn)得到的10個(gè)品種的抗寒性強(qiáng)弱與綜合評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致。利用主成分分析法和隸屬函數(shù)法不僅能夠快速鑒定品種抗寒性，同時(shí)還克服了采用單一因素進(jìn)行評(píng)價(jià)的缺陷。由于植物抗寒性受多個(gè)因素的影響，衡量植物對(duì)低溫耐受性的指標(biāo)也較多，指標(biāo)間關(guān)系復(fù)雜，生理生化指標(biāo)一般情況下受環(huán)境因素的影響較大。另外，由于樹齡不同，樹體貯藏或消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況也不同，也會(huì)影響樹體的抗寒性。因此，要科學(xué)評(píng)價(jià)桃樹的抗寒性還應(yīng)從多個(gè)方面綜合考慮，才能全面、科學(xué)評(píng)價(jià)其抗寒能力，從而為利用不同類型抗寒種質(zhì)資源提供可靠依據(jù)。

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