于思樺， 陸秀君， 曹 婷， 李 玲

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，遼寧沈陽 110161； 2.興城市中等職業(yè)技術(shù)專業(yè)學(xué)校，遼寧興城 125100)

美國紅楓(AcerrubrumL.)是北美地區(qū)紅楓的統(tǒng)稱。美國紅楓是槭樹科槭屬落葉大喬木，因其秋季色彩奪目，樹冠整潔，被廣泛應(yīng)用于公園、小區(qū)、街道栽植，是近幾年來引進(jìn)的優(yōu)良城市園林的理想珍稀樹種之一。近年來，國內(nèi)許多地區(qū)開始引種栽培美國紅楓，美國紅楓有許多改良的園藝品種，改良美國紅楓是從眾多品種中選育的40余個非常優(yōu)秀的園藝栽培品種的統(tǒng)稱。美國紅楓和改良美國紅楓春夏季葉色為綠色，秋季變?yōu)榛鸺t色，是優(yōu)良的彩葉樹種[1]。

近年來，有關(guān)美國紅楓系列品種的抗性及適應(yīng)性研究已有一些報道。劉毓在國外優(yōu)良彩葉槭樹資源引種及適應(yīng)性研究中對改良美國紅楓(Acerr.×freemanii‘Autumn Blaze’)進(jìn)行了生物學(xué)特性觀察和耐寒性觀測，認(rèn)為所引種彩葉槭樹品種在引種地濟(jì)南市存在長期生存的可能性[2]。王菲等報道了沈陽地區(qū)栽種的紅花槭(Acerrubrum)在低溫脅迫下幾種生理指標(biāo)的變化，初步得出紅花槭可以抵御-35 ℃的低溫，可以在沈陽地區(qū)露地越冬[3]。劉廣林等報道了沈陽地區(qū)引種的紅花槭、自由人槭(Acerr.×freemanii‘Autumn Blaze’)的半致死溫度以及自然越冬過程中含水量等生理指標(biāo)的變化，結(jié)果表明，在自然越冬過程中，束縛水/自由水值，以及可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量隨著溫度的降低均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢[4]。目前，關(guān)于美國紅楓系列品種在低溫逆境下細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶活性的變化并沒有系統(tǒng)的研究報道，但已經(jīng)有大量研究表明，植物的保護(hù)酶系統(tǒng)影響了植物的抗寒性。植物組織因為受到寒害而產(chǎn)生大量活性氧，會破壞細(xì)胞的正常功能以致影響植物的生長和發(fā)育[5]。植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是重要的防御保護(hù)酶，能夠清除組織內(nèi)多余的自由基，使活性氧保持動態(tài)穩(wěn)定的水平，從而保護(hù)其細(xì)胞本身不受危害[6-9]。因此，當(dāng)植物受到脅迫時，可以通過SOD、POD、CAT三者共同作用來清除機(jī)體內(nèi)累積的自由基[10-11]。低溫脅迫在引起植物體內(nèi)抗氧化酶活性變化的同時，還能誘導(dǎo)抗氧化酶同工酶活性的增加。殷有等對白皮松幼苗抗寒性的研究表明，其機(jī)體內(nèi)SOD、POD和CAT的活性隨溫度降低明顯提高，說明3種酶的活性是影響白皮松幼苗抗寒性強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素[12]。對金邊衛(wèi)矛(Euonymusradicans‘Emorald & Gold’)[13]、加拿大糖槭(AcernegundoLinn)[14]、楊樹(PopulusL.)[15]等植物的SOD、POD以及相應(yīng)同工酶活性的測定結(jié)果也表明，植物的抗寒性與保護(hù)酶系統(tǒng)的活性有顯著相關(guān)性。

本研究擬通過對引進(jìn)的美國紅楓系列品種苗木在遼寧沈陽地區(qū)自然越冬過程中各項保護(hù)酶活性和同工酶活性變化的研究，明確各樹種的抗寒能力和低溫適應(yīng)機(jī)制，為沈陽地區(qū)引種與栽培美國紅楓等系列樹種及通過保護(hù)酶活性評價其抗寒性提供理論依據(jù)。

1 試驗地概況

試驗地位于遼寧省沈陽市東陵區(qū)高坎鎮(zhèn)興隆村，該地區(qū)與撫順市接壤，屬于半濕潤季風(fēng)氣候，冬寒時間較長，近6個月，降雪較少；夏季時間較短，多雨；春季多風(fēng)；秋季晴朗。該地日照充足，四季分明。年平均氣溫6.2～9.7 ℃，極端最高氣溫38.3 ℃，極端最低氣溫-32.9 ℃。受季風(fēng)影響，降水集中在夏季，全年降水量600～800 mm，集中于6—8月，占全年的62.5%，年平均相對濕度61%，年日照時數(shù)約2 516 h，全年無霜期155～180 d。于2012年11月1日至2013年3月16日對試驗地實(shí)測最高和最低溫度進(jìn)行了記錄，詳見表1。

表1 2012年冬季至2013年春季期間采樣地溫度變化

2 材料與方法

2.1 材料與處理

本試驗所用紅花槭為從山東青島引進(jìn)的實(shí)生苗；改良美國紅楓為從山東青島引進(jìn)的1年生扦插苗；五角楓(Acerelegantulum)為當(dāng)?shù)夭シN的繁殖苗。從2012年11月初至2013年3月中旬，每隔15 d分別對紅花槭4年生苗、紅花槭3年生苗、改良美國紅楓1年生苗、五角楓3年生苗的1年生休眠枝進(jìn)行采樣。將材料洗凈擦干后，直接放于-20 ℃冰箱中恒溫保存，用于測定超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶及其同工酶活性幾項生理指標(biāo)。測量時剪成15 cm長的枝段，每組測量選取9段枝條，3次重復(fù)。

2.2 測定方法

2.2.1 SOD、POD、CAT活性的測定 SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑還原法，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[16]，CAT活性測定采用紫外吸收分光光度法。

2.2.2 SOD、POD、CAT同工酶活性的分析 (1)酶液提取。稱取0.5 g冷凍樣品枝條，在冰浴條件下加2 mL酶提取液(0.1 mol/L、pH值7.5的Tris-HCl緩沖液)，研磨至勻漿，加入離心管內(nèi)，然后在低溫冷凍離心機(jī)中于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取1 mL上清液，加入1 mL 10%甘油，1 mL 40%蔗糖，即為待測酶提取液。

(2)制膠。測定SOD同工酶分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%。先配制分離膠，后配制濃縮膠，在即將灌膠前再分別加入過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)試劑，在分離膠中加入150 μL AP、32 μL TEMED，在濃縮膠中加入50 μL AP、15 μL TEMED。

(3)灌膠、加樣?；靹蚝罅⒓囱夭ＡО暹吘売靡埔浩鲗⒎蛛x膠緩緩注入膠室中，注膠過程中要防止氣泡產(chǎn)生，膠液加到距玻璃板邊緣1 cm處為止，立即用移液器在膠溶液上加滿無水乙醇，靜置5 min，待分離膠上出現(xiàn)清晰的界面時，將上層無水乙醇倒掉，用移液器加入配制好的濃縮膠，加滿濃縮膠后立即插入10孔樣品梳，注意不要帶入氣泡。靜置10 min后，輕輕拔出梳子，將2 μL溴酚藍(lán)點(diǎn)在消毒一次性手套上，吸取 20 μL 樣品液，混入溴酚藍(lán)中，將吸取的20 μL混合液加入槽點(diǎn)中，應(yīng)保證每個槽點(diǎn)的上樣量相同。

(4)電泳。采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[17]。

(5)染色。SOD同工酶的染色采用四氮唑藍(lán)(NBT)法；POD同工酶的染色采用醋酸-聯(lián)苯胺法；CAT同工酶的染色采用鐵染色法[18]。

2.3 圖像掃描與數(shù)據(jù)分析

用UMAX Powerlook 2100XL掃描儀對SOD、POD、CAT的同工酶凝膠進(jìn)行掃描并保存圖像。用Adobe Photoshop CS4軟件對圖像進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 SOD活性的變化

由圖1可以看出，在自然越冬過程中，紅花槭4年生苗、紅花槭3年生苗、改良美國紅楓SOD活性均呈先上升后下降的趨勢。其中在11月份剛進(jìn)入冬季時，溫度下降幅度較小，3種紅楓SOD活性基本維持在較低的水平。但到12月上旬外界溫度下降較快時，幾種紅楓SOD活性急劇上升，紅花槭4年生苗、紅花槭3年生苗和改良美國紅楓SOD活性分別在12月16日、12月1日和1月2日時達(dá)到峰值，分別比11月1日最初測定時的活性提高了2.34、2.33、2.56倍。結(jié)果表明，在整個越冬季節(jié)，幾種樹種的SOD活性會隨著低溫脅迫的加強(qiáng)逐漸增大，其中五角楓的升幅表現(xiàn)最大，改良美國紅楓以及紅花槭4年、3年生苗的升幅依次遞減。

3.2 SOD同工酶活性的變化

從圖2可以看出，遷移率為0.17、0.23、0.34的SOD同工酶條帶幾乎為幾種樹種所共有。紅花槭4年生苗和3年生苗條帶表現(xiàn)接近，但是紅花槭3年生苗相比4年生苗缺少了遷移率為0.21、0.34的條帶，3年生苗Rm=0.17、0.23、0.25的條帶在整個取樣過程中均表現(xiàn)為弱于4年生苗。改良美國紅楓比紅花槭少了Rm=0.15、0.25的2個條帶，但其他條帶表現(xiàn)比較強(qiáng)。五角楓在4種樹種中的SOD同工酶條帶數(shù)最多。結(jié)果表明，各樹種的SOD同工酶會在溫度降低時表現(xiàn)出相應(yīng)增強(qiáng)的趨勢，且抗寒性越強(qiáng)的樹種同工酶條帶的數(shù)量越多，每個種樹在不同時期其SOD同工酶的強(qiáng)弱也不相同。

3.3 POD活性的變化

圖3結(jié)果顯示，在自然越冬過程中，4種樹種的POD活性的基本走勢都是先升高后下降，但紅花槭3年生苗POD活性雖然有所升高，但是變化比較平緩。紅花槭4年生苗和改良美國紅楓的POD活性總體上處于較高的水平，五角楓在11月初期到12月上旬時的POD活性均最低，但在12月中旬有個大幅度提升，與紅花槭4年生苗和改良美國紅楓在同一時期的POD活性水平相當(dāng)。結(jié)果表明，4種樹種的POD活性會隨著越冬過程中溫度的降低逐漸增強(qiáng)，紅花槭4年生苗達(dá)到極值時表現(xiàn)出的活性最高，但是五角楓從越冬初期到最低溫時POD活性的升幅最大，改良美國紅楓稍次之，紅花槭3年生苗的走勢則較平緩，可見該樹種通過增加POD活性來抵御低溫脅迫的能力較弱。

3.4 POD同工酶活性的變化

如圖4所示，4種樹種均含有Rm=0.17、0.23、0.26、0.38的這幾條POD同工酶條帶。紅花槭4年生苗的條帶總體上要強(qiáng)于3年生苗。改良美國紅楓比紅花槭3年、4年生苗多出了Rm=0.88、0.92、0.96的3條條帶，其Rm=0.20、0.23、0.38、0.40的這4條條帶要強(qiáng)于另外2種紅楓。五角楓的POD同工酶條帶數(shù)最多，共有12條，五角楓的Rm=0.23、0.38的條帶表現(xiàn)較強(qiáng)，強(qiáng)于其他3種紅楓。結(jié)果表明，POD同工酶也與幾種樹種的抗寒性相關(guān)，其中抗寒性較強(qiáng)的品種其同工酶譜帶也表現(xiàn)較強(qiáng)?？梢钥闯?，整體上五角楓的條帶數(shù)最多，且條帶表現(xiàn)均較強(qiáng)，其次是改良美國紅楓、紅花槭4年生苗，紅花槭3年生苗的同工酶條帶則表現(xiàn)最弱。

3.5 CAT活性的變化

從圖5可以看出，紅花槭4年、3年生苗和改良美國紅楓在自然越冬過程中的CAT活性總體呈先升后降的趨勢，但是五角楓的CAT活性在整個冬季的走勢平緩。在越冬初期，3種紅楓的CAT活性呈先緩慢上升后急劇上升的趨勢，11月1日至11月17日，變化比較平緩，升幅不大，12月初至12月中旬，酶活性急劇增加，并且3種紅楓先后達(dá)到峰值，其中紅花槭4年生苗、改良美國紅楓分別在1月2日、12月16日達(dá)到最大值140.7、150.6 U/(g·min)，分別比測定初期值高 1.56、1.62倍，紅花槭3年生苗在1月2日達(dá)到最大值 102.9 U/(g·min)，比測定初期值高1.34倍。五角楓CAT活性在冬季低溫時達(dá)到最大值，比初期測定值高了1.80倍，相比另外3種樹種在整個取樣期間的總體酶活性變化幅度最大。

3.6 CAT同工酶活性的變化

由圖6可見，CAT同工酶圖譜中的4種樹種均出現(xiàn)了CAT同工酶條帶，且其遷移率相同，Rm=0.94。結(jié)果表明，幾種樹種的CAT同工酶條帶變化無明顯差異，且均含有同一條條帶，表明植物體中已測出的這一種CAT同工酶可能與幾種樹種的抗寒性不直接相關(guān)，但是卻能協(xié)調(diào)體內(nèi)的H2O2平衡。

4 結(jié)論與討論

植物在遭受低溫逆境時，體內(nèi)的自由基增多，其自身會激發(fā)SOD、POD等植物體內(nèi)的酶促防御系統(tǒng)，從而阻止膜脂過氧化，使其活性適應(yīng)脅迫。可以通過提高護(hù)酶活性來清除過多的自由基，使其在一定范圍內(nèi)與自由基保持相對平衡[19]。人們討論的酶促防御系統(tǒng)中，最常被測定就是SOD、POD、CAT，前人有許多研究證實(shí)了植物在受到低溫脅迫時，其自身酶促防御系統(tǒng)會發(fā)生響應(yīng)，保證植物在冬季低溫下的正常生長[20]。

本試驗結(jié)果表明，4種樹種均會通過增加其SOD、POD、CAT活性來保證其在低溫逆境中的正常生存，這與前人的研究結(jié)果一致[21]。同時測定每種植物在不同時期的同工酶變化，也發(fā)現(xiàn)其SOD、POD同工酶活性都會隨著溫度的降低相應(yīng)增強(qiáng)，這與其活性的增加是相對應(yīng)的。測定CAT活性發(fā)現(xiàn)，隨著溫度降低，其活性相應(yīng)增強(qiáng)，但是其同工酶卻沒有明顯變化，可能是因為CAT在植物體中是用于清除H2O2的，也可能只是響應(yīng)H2O2的增加[22-23]。

通過對各種酶活性變化的綜合評價，發(fā)現(xiàn)在越冬過程中溫度達(dá)到最低值時，4種樹種的SOD、POD、CAT的活性增強(qiáng)，從而增強(qiáng)了細(xì)胞膜保護(hù)系統(tǒng)清除活性氧的能力，其變化幅度根據(jù)樹種不同也表現(xiàn)出很大差異。與4個樹種的POD、SOD同工酶相比，CAT同工酶譜帶多樣性較差，只有1個條帶，說明相比之下CAT對低溫脅迫不敏感。已有研究認(rèn)為，抗寒性強(qiáng)的品種體內(nèi)保護(hù)酶類活性較高是其抗寒性強(qiáng)的原因之一[24-25]。由此判斷，4個樹種的酶促防御系統(tǒng)反映的抗寒性強(qiáng)弱依次表現(xiàn)為五角楓、改良美國紅楓、紅花槭4年生苗、紅花槭3年生苗。

本試驗首次研究了越冬過程中的低溫脅迫對美國紅楓系列品種抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響，由本試驗可以看出，不同品種的林木因其遺傳特性不同，會表現(xiàn)出不同的適應(yīng)性和抗逆性，今后我們需要在苗木引種和選育上找到最適合當(dāng)?shù)氐臉浞N，以提高用于美化城市環(huán)境的植物的成活率。

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