鄧 坦， 周 遜， 張 念

(1.遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州遵義 563006； 2.貴州省赤水河流域植物資源保護(hù)與應(yīng)用研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563006)

紫萁(OsmundajaponicaThunb)屬蕨類(lèi)植物門(mén)真蕨類(lèi)原始厚囊蕨綱紫萁目紫萁科紫萁屬的一種多年生草本植物，既是一種山野菜又是一種名貴中藥材[1]。其拳卷幼葉經(jīng)過(guò)干制處理，稱(chēng)為薇菜，是出口日、韓的名貴山野菜。紫萁根莖入藥，具有一定的應(yīng)用價(jià)值，很多研究表明，薇菜含有鈣(Ca)、鐵(Fe)、鋅(Zn)等元素和多種氨基酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]，但其自然繁殖能力弱，不利于種群的擴(kuò)大和人工栽培。目前，中國(guó)產(chǎn)的薇菜均為采自山區(qū)的野生紫萁，質(zhì)優(yōu)，無(wú)污染。近年來(lái)，由于濫采，其野生資源日漸枯竭，產(chǎn)品供不應(yīng)求，為合理開(kāi)發(fā)這一珍稀資源，提高其品率，滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，進(jìn)行人工規(guī)模栽培勢(shì)在必行，而人工栽培的關(guān)鍵是解決紫萁成苗問(wèn)題，對(duì)其孢子萌發(fā)條件的研究是解決其有性生殖問(wèn)題的重要條件之一。

國(guó)內(nèi)外對(duì)紫萁孢子的人工繁殖已有研究[1，4-11]，但對(duì)一些控制紫萁孢子萌發(fā)和原葉體發(fā)育的因素還有待更深入的研究。本試驗(yàn)就不同碳源濃度、不同激素水平、不同成熟度的紫萁孢子這幾個(gè)因素對(duì)紫萁原葉體發(fā)育的影響進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫萁孢子體材料于2013年4月中旬采自貴州遵義大板水國(guó)家級(jí)森林公園，所采集的試驗(yàn)材料由遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物資源實(shí)驗(yàn)室鑒定，并保存標(biāo)本。采集不同成熟度的孢子葉穗，放入潔凈的密封袋中，置于5 ℃冰箱中保存供使用。

1.2 不同培養(yǎng)基的配制

無(wú)機(jī)培養(yǎng)基采用MS、1/2MS、1/4MS(1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基的大量元素含量分別為MS培養(yǎng)基全量的1/2、1/4，鐵鹽和有機(jī)物的含量與MS培養(yǎng)基相同)，pH值為6.0，培養(yǎng)基配制好后分裝到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌120 min。

1.3 消毒方式

取適量不同成熟度的孢子體，先用適量洗衣粉洗10 min，洗去表面雜質(zhì)，然后用自來(lái)水沖洗30 min，再然后用75%乙醇處理 1 min 后用無(wú)菌水清洗3～4次，再用0.1%氯化汞處理 8 min，最后用無(wú)菌水清洗3～4次后就可進(jìn)行接種。

1.4 正交試驗(yàn)

本試驗(yàn)分3個(gè)組合：組合1以MS、1/2MS、1/4MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的蔗糖，pH值6.0，培養(yǎng)不同成熟度的外植體；組合2以MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA和NAA，pH值6.0，培養(yǎng)不同成熟度的外植體；組合3以MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、2，4-D，pH值6.0，培養(yǎng)未完全成熟的外植體。

將各個(gè)處理置于光照時(shí)間12 h/d、光照度2 000 lx、溫度25 ℃的條件下培養(yǎng)，定期觀察其生長(zhǎng)情況，3 d后觀察孢子的萌發(fā)情況，定期記錄孢子顏色的變化，25～30 d后分別對(duì)每個(gè)處理在顯微鏡下觀察原葉體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并統(tǒng)計(jì)每種處理?xiàng)l件下的孢子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔗糖和無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)紫萁孢子萌發(fā)和原葉體發(fā)育的影響

由表1可以看出，不同蔗糖濃度和無(wú)機(jī)鹽濃度能影響紫萁孢子的萌發(fā)和原葉體的發(fā)育。蔗糖濃度為2%的培養(yǎng)基比含量為3%的培養(yǎng)基更有利于孢子的萌發(fā)和原葉體的發(fā)育(圖1-A)。1周后孢子開(kāi)始萌發(fā)，表面開(kāi)始分化出一些綠色小點(diǎn)，這與張敏等對(duì)紫萁的組織培養(yǎng)而得出的結(jié)論[5]相符合。在沒(méi)有添加任何植物激素的條件下培養(yǎng)紫萁孢子，成熟度為3的紫萁孢子的萌發(fā)率為0，成熟度為1的紫萁孢子的萌發(fā)率最高，最高達(dá) 66.67%(表1)。

表1 不同蔗糖和無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)紫萁孢子萌發(fā)和原葉體發(fā)育的影響

注：成熟度為1表示還未完全成熟的紫萁孢子，孢子還略顯綠色；成熟度為2表示剛成熟的紫萁孢子；成熟度為3表示已成熟了一段時(shí)間的紫萁孢子。萌發(fā)時(shí)間為“-”表示未萌發(fā)。原葉體發(fā)育情況為“-”表示無(wú)原葉體出現(xiàn)，“+”表示出現(xiàn)原絲體，“++”表示出現(xiàn)片狀體和幼原葉體，“+++”表示出現(xiàn)心形原葉體。下表同。

2.2 不同濃度無(wú)機(jī)鹽、6-BA、NAA對(duì)紫萁孢子萌發(fā)和原葉體發(fā)育的影響

由表2可以看出，不同濃度無(wú)機(jī)鹽、6-BA、NAA均影響紫萁原葉體的發(fā)育，無(wú)論什么樣的濃度配比，成熟度為1的孢子體萌發(fā)率都要高于成熟度為2和3的萌發(fā)率，成熟度為3的孢子體在1/2MS、1.0 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA條件下有幼原葉體和片狀體的發(fā)育。

在MS+0.1 mg/L 6-BA+成熟度1和1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+成熟度1條件下紫萁原葉體發(fā)育最好(圖1-C)。在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度1和MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+成熟度1條件下還是片狀體(圖1-B)，在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度3的條件下處于2～6個(gè)細(xì)胞的絲狀體(圖1-A)，在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+成熟度1和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度1條件下的原葉體發(fā)育較好(圖1-C)。

2.3 不同濃度無(wú)機(jī)鹽、6-BA、2，4-D對(duì)紫萁孢子萌發(fā)和原葉體發(fā)育的影響

由表3可以看出，不同無(wú)機(jī)鹽、6-BA、2，4-D濃度能影響紫萁原葉體的發(fā)育，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D都有利于紫萁原葉體的發(fā)育，0.5 mg/L為最佳濃度。在不同濃度外源激素條件下紫萁原葉體發(fā)育不同，在MS+0.1 mg/L 2，4-D(無(wú)6-BA)與MS+0.5 mg/L 2，4-D(無(wú)6-BA)和1/2MS+0.5 mg/L 2，4-D(無(wú)6-BA)的條件下，發(fā)育為心形原葉體的時(shí)間較快(圖1-C)，在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D條件下為片狀體(圖1-B)。

3 討論

在外植體的選擇上，筆者所在課題組選取了3種不同成熟度的穗狀孢子體：成熟度為1，孢子體顏色為青綠色；成熟度為2，孢子體剛由青色轉(zhuǎn)黃色；成熟度為3，孢子體由黃色轉(zhuǎn)褐色。無(wú)論是在何種條件的處理下，成熟度為1的孢子體萌發(fā)要好于成熟度為2、3的孢子體，究其原因，成熟度為1的孢子體未成熟，細(xì)胞還未分化完成，在適度培養(yǎng)條件的刺激下，更能激發(fā)細(xì)胞的全能性。

在無(wú)機(jī)鹽濃度的選擇上，筆者所在課題組選擇了3種濃度，分別是1MS、1/2MS、1/4MS。由結(jié)果看出，在低濃度無(wú)機(jī)鹽條件下，孢子萌發(fā)率較高，這在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)于控制成本是有益的。

在碳源濃度選擇上，筆者所在課題組選擇了2種濃度進(jìn)行比較，分別是3%、2%蔗糖。由結(jié)果看出， 在2%的低碳源濃度下，孢子萌發(fā)較好，這在大規(guī)模的實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)于控制成本也是有益的。

表2 不同濃度無(wú)機(jī)鹽、6-BA、NAA對(duì)紫萁孢子萌發(fā)和原葉體發(fā)育的影響

不同無(wú)機(jī)鹽濃度、6-BA濃度、NAA濃度均影響紫萁原葉體的發(fā)育。由結(jié)果可以看出，無(wú)論什么樣的濃度配比，成熟度為1的孢子體萌發(fā)率都要高于成熟度為2、3的，成熟度為3的孢子體在1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培養(yǎng)條件下有絲狀體和片狀體的發(fā)育。

不同濃度無(wú)機(jī)鹽、6-BA和2，4-D的配比試驗(yàn)表明，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D都有利于紫萁原葉體的發(fā)育，0.5 mg/L 為2，4-D最佳濃度。

在控制條件下，碳源濃度為2%的培養(yǎng)基有利于孢子的萌發(fā)和原葉體的形成；隨著無(wú)機(jī)鹽濃度的降低，孢子萌發(fā)率上升，以1/4MS最佳；1 mg/L 6-BA更有利于紫萁原葉體的發(fā)育；NAA濃度為0.01 mg/L，原葉體長(zhǎng)勢(shì)較好；0.1～1 mg/L 2，4-D均有利于紫萁原葉體的發(fā)育，其中0.5 mg/L為最佳濃度；還未完全成熟的孢子體的萌發(fā)率較高，最高達(dá)50%以上。在2%蔗糖+1/4MS+1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D和孢子體未完全成熟的條件下，更有利于紫萁原葉體的發(fā)育。

表3 不同濃度無(wú)機(jī)鹽、6-BA、2，4-D對(duì)紫萁孢子萌發(fā)和原葉體發(fā)育的影響

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