江鳴濤， 張藝祎， 李云霞， 黃繼芬， 吳沙沙

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)海峽蘭花保育中心，福建福州 350002)

獨(dú)蒜蘭屬(Pleione)是蘭科植物中具有較高觀賞價(jià)值的一個(gè)屬[1]，該屬植物花色鮮艷、花型奇特，深受歐美和日本人士的喜愛，具有極高的園藝價(jià)值。在歐洲、美國(guó)、日本等地已廣泛栽培應(yīng)用，在英國(guó)已規(guī)?；a(chǎn)[2]，并已培育出約2 000個(gè)品種[3]。我國(guó)臺(tái)灣省每年外銷到日本的臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭種球即可達(dá)20萬(wàn)球[4]。獨(dú)蒜蘭屬約26種，我國(guó)有23種，其中12種為我國(guó)特有，是獨(dú)蒜蘭屬植物的分布中心，資源眾多[1]。但由于其栽培環(huán)境條件要求較高，開發(fā)利用滯后，我國(guó)目前僅中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所培育出2個(gè)新品種[5]，臺(tái)灣大學(xué)培育出少量幾個(gè)品種[6]。因此加快我國(guó)獨(dú)蒜蘭屬植物種質(zhì)資源的保護(hù)和育種開發(fā)具有重要意義。

獨(dú)蒜蘭屬植物因其分球和頂球繁殖率低，無(wú)菌播種和假鱗莖作為外植體器官發(fā)生成苗速度快，但養(yǎng)成開花球時(shí)間長(zhǎng)、成本高而嚴(yán)重制約其規(guī)模化生產(chǎn)[6]，種子無(wú)菌播種繁殖在新品種培育過(guò)程中具有重要意義。同時(shí)，與蘭科其他種一樣，獨(dú)蒜蘭屬植物的種子由于自身不透水、不透氣等原因，自然狀態(tài)下萌發(fā)率極低[7-8]，利用無(wú)菌播種組織培養(yǎng)技術(shù)能夠快速、大量繁殖。

云南獨(dú)蒜蘭(P.yunnanensis)具有重要的藥用價(jià)值[9]，且其花淡紫、粉紅或近白色，唇瓣具紫或深紅色斑[10]；陳氏獨(dú)蒜蘭(P.chunii)原產(chǎn)于中國(guó)云南西部和廣東北部，花大，淡粉紅色至玫瑰紫色，色澤通常向基部變淺，唇瓣中央具1條黃色或橘黃色條紋和多數(shù)同樣色澤的流蘇狀毛[1]，深受人們的喜愛，具有較高園藝觀賞價(jià)值。二者進(jìn)行雜交，可能培育出花色豐富、唇瓣色彩和結(jié)構(gòu)多變的新品種，因此有必要對(duì)其雜交種進(jìn)行無(wú)菌播種研究。

本研究以云南獨(dú)蒜蘭為母本、陳氏獨(dú)蒜蘭為父本雜交的成熟未開裂蒴果為試驗(yàn)材料，以花寶2號(hào)作為基本培養(yǎng)基探討不同濃度細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)和生長(zhǎng)素α-萘乙酸(α-naphthalene acetic acid，NAA)對(duì)該雜交種無(wú)菌萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，以期得到適宜的無(wú)菌萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方，從而為今后獨(dú)蒜蘭雜交種快速繁殖和新品種培育提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以人工授粉120 d的云南獨(dú)蒜蘭×陳氏獨(dú)蒜蘭雜交種的成熟未開裂蒴果作為種子萌發(fā)試驗(yàn)材料。以經(jīng)過(guò)90 d無(wú)菌培養(yǎng)得到的云南獨(dú)蒜蘭×陳氏獨(dú)蒜蘭雜交小苗作為繼代培養(yǎng)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滅菌及無(wú)菌播種 將采收的雜交果實(shí)放在自來(lái)水下沖洗30 min后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用75%乙醇表面消毒30 s，然后用0.15% HgCl2溶液浸泡30 min，最后用無(wú)菌水漂洗3次。將消毒后的果實(shí)平放在經(jīng)滅菌的濾紙上，吸干水分后，用解剖刀將莢果縱向切開，將種子均勻播種到培養(yǎng)基表面，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使種子均勻分散。

1.2.2 原球莖誘導(dǎo) 雜交種萌發(fā)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3 g/L花寶2號(hào)+20 g/L蔗糖+2 g/L蛋白胨+50 g/L香蕉+50 g/L馬鈴薯+2 g/L活性炭+7 g/L瓊脂(pH值5.6)，探討6-BA和NAA這2個(gè)因素不同濃度配比對(duì)種子萌發(fā)的影響，按表1進(jìn)行9組處理，每組接種10瓶，3次重復(fù)。于2015年12月27日配制培養(yǎng)基并接種，黑暗培養(yǎng)，至種子明顯膨大后轉(zhuǎn)至光照度為1 500 lx的日光燈下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，平均光照時(shí)間為12 h/d。培養(yǎng)90 d后統(tǒng)計(jì)原球莖分化率和植株平均高度。

表1 種子萌發(fā)培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)

1.2.3 幼苗培養(yǎng) 幼苗培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為1 g/L蛋白胨+25 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+7 g/L瓊脂(pH值5.6)，以6-BA、NAA和花寶2號(hào)3個(gè)不同濃度(表2)進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共9組。每組接種5瓶，每瓶轉(zhuǎn)接3叢大小接近的無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)90 d的小苗，3次重復(fù)。于2016年3月28日配制幼苗培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)接。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖平均直徑和植株平均高度。培養(yǎng)條件與無(wú)菌播種萌發(fā)后光照培養(yǎng)條件相同。

表2 幼苗培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 測(cè)定指標(biāo)及數(shù)據(jù)分析

無(wú)菌播種培養(yǎng)90 d后，從每組處理中隨機(jī)挑選出3瓶，分別用鑷子夾出原球莖放在培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡(Nikon，SMZ18，日本)下觀察9個(gè)不同視野，以葉片突破原球莖的植株視為分化成功，以葉片突破原球莖的植株數(shù)/視野中原球莖總數(shù)×100%作為原球莖分化率。在體視顯微鏡下拍照，于AutoCAD 2007中測(cè)量植株高度。

植株在幼苗培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后，每組處理隨機(jī)選取3瓶，隨機(jī)選出10株植株，置于坐標(biāo)紙上拍照(圖1)，于CAD軟件中測(cè)量植株高度和原球莖直徑。

用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0軟件(IBM，美國(guó))的Duncan’s方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌萌發(fā)形成原球莖

2.1.1 種子無(wú)菌萌發(fā)過(guò)程 種子無(wú)菌播種在黑暗條件下培養(yǎng)20 d時(shí)開始膨大，后轉(zhuǎn)至光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)，種子開始形成一些淡黃色小突起，即為原球莖開始形成。隨著時(shí)間的推移，顏色開始由淡黃色變成淺綠色，原球莖分化逐漸形成。培養(yǎng)90 d后，可觀察到萌發(fā)的種子已經(jīng)形成極小的原球莖，部分原球莖長(zhǎng)出幼嫩葉片(圖1)，且根部有白色絨毛。

2.1.2 原球莖分化及株高的差異 9組處理原球莖分化率分為3個(gè)水平，處理6和處理9的原球莖分化率水平顯著高于其他組，其中處理6原球莖分化率高達(dá)94.45%，處理9分化率為87.19%；處理1、處理2、處理3、處理5和處理8分化率水平居中，在53.92%～63.38%之間；處理4和處理7原球莖分化率顯著低于其他組合(圖1-D、圖1-G)，分化率分別為37.58%和29.75%(表3)。

另外，植株平均高度差異分為6個(gè)水平，處理6植株平均高度顯著高于其他組，達(dá)到1.56 cm(圖1-F)；處理3(圖1-C)和處理9(圖1-I)次之，植株平均高度分別為1.15 cm和1.21 cm；植株平均高度最低的為第7組，僅為0.22 cm(表3)。

表3 種子無(wú)菌萌發(fā)情況統(tǒng)計(jì)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表4同。

2.2 幼苗生長(zhǎng)

2.2.1 原球莖直徑的差異 雜交子代原球莖在不同濃度花寶2號(hào)添加6-BA和NAA不同配比的培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d后，植株發(fā)育成具1～2張葉片的小苗，植株高度和原球莖直徑均有不同程度的增加。處理1假鱗莖膨大顯著大于其他處理，且植株生長(zhǎng)健壯。處理6、處理8和處理9次之，假鱗莖膨大后直徑均約0.3 cm；處理5中原球莖直徑最小，僅為0.14 cm(表4)，且出現(xiàn)部分植株褐化后停止生長(zhǎng)的現(xiàn)象。3個(gè)研究因素對(duì)于假鱗莖膨大的R值排序?yàn)榛▽?號(hào)(0.153)>NAA(0.092)>6-BA(0.043)，表明花寶2號(hào)對(duì)該獨(dú)蒜蘭雜交種假鱗莖膨大促進(jìn)作用最強(qiáng)，NAA次之，6-BA作用最弱。

2.2.2 平均株高的差異 處理8植株平均高度顯著高于其他組，達(dá)到4.38 cm(表4)， 這與原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植株高度最高的處理6中的激素含量相同，說(shuō)明1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于葉片生長(zhǎng)。處理1、處理2、處理6和處理9次之，植株平均高度均小于3 cm；處理4中植株平均高度值最低，僅為1.35 cm(表4)，但該處理中植株高度整齊一致，有利于后期統(tǒng)一出瓶和管理。對(duì)于幼苗平均株高而言，3個(gè)因素的R值排序?yàn)镹AA(1.70)>花寶2號(hào)(1.51)>6-BA(0.43)，表明NAA對(duì)于植株的促進(jìn)作用最強(qiáng)，花寶2號(hào)次之，6-BA最弱。

表4 不同添加物處理對(duì)雜交種幼苗生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 激素對(duì)原球莖分化率及株高的影響

在沒有外源添加6-BA和NAA的培養(yǎng)基中，原球莖分化率即可達(dá)到50%以上，在此基礎(chǔ)上添加6-BA(0.5 mg/L或 1.0 mg/L)，原球莖誘導(dǎo)率降低，說(shuō)明單獨(dú)添加6-BA具有抑制原球莖分化的作用。當(dāng)培養(yǎng)基中僅添加NAA(0.5 mg/L 或 1.0 mg/L)時(shí)，對(duì)原球莖分化促進(jìn)作用不明顯，與不添加NAA對(duì)原球莖分化率沒有差異。當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，添加低濃度6-BA(0.5 mg/L或1.0 mg/L)對(duì)原球莖誘導(dǎo)具有明顯的促進(jìn)作用。表明細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA共同作用對(duì)該雜交種種子萌發(fā)形成原球莖具有明顯促進(jìn)作用。

黃家林等研究云南獨(dú)蒜蘭(P.yunnanensis)種子無(wú)菌萌發(fā)發(fā)現(xiàn)，僅添加細(xì)胞分裂素6-BA或KT對(duì)其萌發(fā)具有抑制作用[11]，本研究結(jié)果與之相同。同樣，對(duì)云南獨(dú)蒜蘭無(wú)菌萌發(fā)研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加6-BA具有抑制作用，單獨(dú)添加NAA對(duì)種子萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用[12]，本研究結(jié)果與之相同；而B5培養(yǎng)基+0.25 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA同樣具有抑制種子萌發(fā)的作用[13]，本研究結(jié)果與之不同，但本研究陳氏獨(dú)蒜蘭種子萌發(fā)結(jié)果與之一致，說(shuō)明激素對(duì)于不同種質(zhì)種子萌發(fā)的作用存在差異。

當(dāng)6-BA濃度為0 mg/L時(shí)，NAA對(duì)種子萌發(fā)后植株高度具有促進(jìn)作用，隨著NAA濃度的增加，植株高度明顯增高。當(dāng)不添加NAA時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，植株高度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，說(shuō)明6-BA對(duì)于植株高度具有抑制作用。雖然在此階段植物葉片的生長(zhǎng)對(duì)于后期假鱗莖的形成具有重要作用，但是由于該培養(yǎng)階段重點(diǎn)關(guān)注的是原球莖的分化，所以現(xiàn)有的研究報(bào)道對(duì)平均株高指標(biāo)關(guān)注不多。

綜合種子萌發(fā)過(guò)程中原球莖分化率和植株高度2個(gè)指標(biāo)，處理6為所有處理中最佳，即3 g/L花寶2號(hào)+0.5 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+50 g/L 馬鈴薯+50 g/L香蕉+2 g/L蛋白胨+2 g/L活性炭+7 g/L瓊脂為種子無(wú)菌萌發(fā)最佳培養(yǎng)基。

3.2 花寶2號(hào)和激素對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

已有的研究報(bào)道，多是在原球莖誘導(dǎo)后進(jìn)行增殖培養(yǎng)方面，缺少專門針對(duì)假鱗莖膨大培養(yǎng)健壯植株的過(guò)程[12-14]，陳之林等研究白花獨(dú)蒜蘭(P.albiflora)原球莖誘導(dǎo)出來(lái)后接種到2 g/L花寶2號(hào)+0.5 mg/L NAA+100 ml/L香蕉勻漿+2 g/L 活性炭培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d假鱗莖直徑可達(dá)5 mm[15]。疣鞘獨(dú)蒜蘭(P.praecox)和巖生獨(dú)蒜蘭(P.saxicola)原球莖在1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)60 d后可長(zhǎng)為高2～5 cm、假鱗莖直徑5 mm的植株[16]。對(duì)臺(tái)灣獨(dú)蒜蘭無(wú)菌播種假鱗莖膨大研究表明，MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯有利于假鱗莖膨大，培養(yǎng) 90 d 后假鱗莖直徑可達(dá)0.33 cm[17]，略小于本研究培養(yǎng)60 d所得到的0.36 cm的結(jié)果。

從研究的結(jié)果可知，花寶2號(hào)對(duì)該雜交種原球莖膨大有著明顯的促進(jìn)作用，NAA對(duì)幼苗葉片生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，綜合植株膨大和植株平均高度2個(gè)指標(biāo)，適合該雜交種幼苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為1 g/L花寶2號(hào)+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1 g/L蛋白胨+25 g/L糖+1 g/L活性炭+7 g/L 瓊脂。

已有的研究報(bào)道表明，獨(dú)蒜蘭屬植物組培生根相對(duì)容易。此外，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，組培苗生根與否對(duì)于煉苗移栽的影響不大，假鱗莖的大小對(duì)于移栽成活和后期植株生長(zhǎng)的作用更重要(未發(fā)表)，故本研究沒有專門針對(duì)生根進(jìn)行研究。由于組培苗移栽后真正生長(zhǎng)成為新植株的為假鱗莖基部的芽，而芽的生長(zhǎng)初期營(yíng)養(yǎng)主要來(lái)自已有的假鱗莖，所以組培苗培養(yǎng)中假鱗莖膨大是重點(diǎn)要解決的問(wèn)題，尤其是針對(duì)縮短膨大時(shí)間和提高膨大效率方面值得進(jìn)一步深入研究。

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