聶 麗， 游思遠(yuǎn)， 樊聰靜， 黎軼凡， 歐陽瀟瀟， 魏賽金

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045)

誘導(dǎo)子是植物抗病生理過程中能夠誘發(fā)植物產(chǎn)生植保素和引起植物過敏反應(yīng)的因子，在植物與微生物的相互作用中，能快速、高度專一性地誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)[1]。生物誘導(dǎo)子是誘導(dǎo)子中的一類，是植物、微生物在防御過程中為對(duì)抗其微生物侵染而產(chǎn)生的物質(zhì)，主要包括分生孢子(conidia)[2]、降解細(xì)胞壁的酶類[3]、有機(jī)體細(xì)胞壁碎片[4]、有機(jī)體產(chǎn)生的代謝物[5]以及培養(yǎng)物濾液中的成分，如真菌菌絲體和細(xì)菌的菌體、勻漿、細(xì)胞壁成分、培養(yǎng)物濾液等。

目前，制備生物誘導(dǎo)子的方法有物理[6-7]、化學(xué)[8]方法，真菌誘導(dǎo)物起作用的成分主要來自菌絲體，人們普遍用的有3種制備方法：將菌絲體研磨成勻漿，勻漿液高壓滅菌制得真菌誘導(dǎo)子；將菌絲體濾去，將濾出液滅菌作為誘導(dǎo)子；將菌絲體烘干后研磨成均勻的干粉制得誘導(dǎo)子[5，8]。

筆者所在項(xiàng)目組在以棉花枯萎病為靶標(biāo)的農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選中，從棉花地土壤中分離篩選到1株鏈霉菌702[9]；進(jìn)一步從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離提取的抗真菌活性物質(zhì)為多烯類大環(huán)內(nèi)脂抗生素，命名為“農(nóng)抗702”(antifungalmycin 702)[10]，該組分對(duì)水稻紋枯病病菌、稻瘟病病菌、稻曲病病菌等14種植物病原真菌有明顯的抑制作用[11-12]，但鏈霉菌702合成農(nóng)抗702的量很低。筆者所在項(xiàng)目組前期試驗(yàn)篩選出大腸桿菌制備物的誘導(dǎo)子，加入鏈霉菌702發(fā)酵后，農(nóng)抗702的產(chǎn)量明顯提高[13]。本試驗(yàn)以大腸桿菌制備誘導(dǎo)子為研究對(duì)象，獲得菌體，探討研磨法、凍融法、研磨法+凍融法、超聲波破碎法、微波破碎法、化學(xué)滲透法、自溶法、酶溶法破碎大腸桿菌細(xì)胞獲得的誘導(dǎo)子對(duì)鏈霉菌702發(fā)酵效果，以確定制備高效細(xì)菌誘導(dǎo)子的方法，并通過有機(jī)溶劑萃取分離法，對(duì)誘導(dǎo)子的主要作用成分進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1 菌種

鏈霉菌702(Streptomyces702)、桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)均為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實(shí)訓(xùn)基地的保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，10 g/L氯化鈉，pH值7.0。PDA培養(yǎng)基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L蔗糖，20 g/L 瓊脂，pH值自然。PDB培養(yǎng)基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L 蔗糖，pH值自然。種子培養(yǎng)基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L 蔗糖，pH值自然。以上培養(yǎng)基所用馬鈴薯均去皮煮沸，紗布過濾，取濾液。

發(fā)酵培養(yǎng)基：16.83 g/L玉米淀粉，30 g/L玉米粉，15 g/L大豆餅粉，20 g/L葡萄糖，8.64 g/L蛋白胨，0.3 g/L磷酸二氫鉀，5 g/L硝酸鉀，5 g/L氯化鈣，10 g/L大豆油，起始(消前)pH值8.0。

1.3 方法

1.3.1 制備細(xì)菌誘導(dǎo)子 大腸桿菌活化后，取50 mL接入250 mL三角瓶中培養(yǎng)24 h后，按接種量10%裝接到 2 000 mL 三角瓶中(總裝液量400 mL)，振蕩培養(yǎng)3 d，離心過濾獲得菌體。將菌體與蒸餾水按1 g ∶4 mL料液比混勻，獲得的濕菌體，分別采用研磨法、凍融法、研磨法+凍融法、超聲波破碎法、微波破碎法、化學(xué)滲透法、自溶法、酶溶法進(jìn)行細(xì)胞破碎，收集處理后的細(xì)胞破碎液，分別滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

研磨法：將濕菌體用液氮研磨，反復(fù)研磨1、2、3、4、5 次，每次研磨5 min。

反復(fù)凍融法：將濕菌體分別于-80、-20、4 ℃冷凍后，分別在45 ℃水浴、室溫(30±2)℃下融解10 min，每個(gè)處理總共凍融4次，每次1 h；將6個(gè)處理按照順序分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6(-80 ℃冷凍+40 ℃水浴處理、-80 ℃冷凍+室溫處理分別記為處理1、處理2，以此類推)。

研磨法+凍融法：將濕菌體于-20 ℃冷凍后，取出于室溫融解后研磨5 min，反復(fù)進(jìn)行5次。

超聲波破碎法：將濕菌體在冰浴條件下用超聲細(xì)胞破碎儀破碎，頻率為20 kHz，每次輻射5 s，間隔5 s，10 min 1次，共5次?？傒椛浯螖?shù)為30次。

微波破碎法：將濕菌體加入聚四氟乙烯管中，密封后放入微波爐中，以2 450 MHz的頻率和630 W的最大輸出功率照射3 min，考察重復(fù)次數(shù)為1、2、3、4、5次的水平，每次中間間隔冷卻1 min。

化學(xué)滲透法：向濕菌體中加入不同濃度甘氨酸(1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mol/L)和絲氨酸(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol/L)，然后將其置于恒溫(45 ℃)搖床中振蕩處理24 h。

自溶法：向濕菌體中分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)NaCl，然后將其置于恒溫(45 ℃)搖床中振蕩處理24 h。

酶溶法：向濕菌體中加入不同濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)的溶菌酶，然后將其置于恒溫(45 ℃)搖床中振蕩處理不同時(shí)間(4、14、24 h)。

1.3.2 誘導(dǎo)子含糖量 用二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定[14]各種誘導(dǎo)子的還原糖含量。以葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo)，以各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的D550 nm(y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.719 1x-0.099 0，r2=0.999 3，查標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出還原糖的濃度。

1.3.3 誘導(dǎo)子中主要活性成分分析 將制備好的誘導(dǎo)子于8 000 r/min離心20 min，得到沉淀部分(A1)，用終濃度為95%的預(yù)冷乙醇處理誘導(dǎo)子的上清液，將混合物置于4 ℃冰箱內(nèi)，12 h后于8 000 r/min離心20 min，得到沉淀部分(A2)，沉淀部分的主要成分是多糖、糖蛋白，去除上清中的乙醇得到液相部分(B)[5]。液相部分(B)分別用3倍體積的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和丁醇進(jìn)行萃取，每種萃取液都用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑進(jìn)行收集，得到石油醚萃取物(C)、三氯甲烷萃取物(D)、丁醇萃取物(E)和乙酸乙酯萃取物(F)[15]。將這些成分在鏈霉菌702發(fā)酵35 h時(shí)加入，分析誘導(dǎo)子的主要誘導(dǎo)成分和效應(yīng)，以未添加誘導(dǎo)子的發(fā)酵液為空白對(duì)照。

1.3.4 鏈霉菌702發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定 將培養(yǎng)64 h的鏈霉菌702種子液，按10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至35 h時(shí)，將還原糖濃度為 3.1 μg/mL 的大腸桿菌誘導(dǎo)子加入發(fā)酵液中繼續(xù)培養(yǎng)至7 d，取樣，測(cè)定發(fā)酵液的生物活性；以添加未處理過的誘導(dǎo)子為對(duì)照，不同處理方法的誘導(dǎo)子活性測(cè)定，以及誘導(dǎo)子中主要活性成分分析中的發(fā)酵液抑菌活性采用一劑量法測(cè)定效價(jià)[16]。發(fā)酵液效價(jià)標(biāo)定以那他霉素(natamycin)作為對(duì)照抗生素，以橘青霉為指示菌測(cè)定抑菌圈，以對(duì)照抗生素的各個(gè)濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(x)，以各濃度對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑校正值為縱坐標(biāo)(y)，制得回歸方程為y=20.301x-9.878 5，r2=0.977 5，換算出發(fā)酵液的效價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用OriginPro9軟件、DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同制備方法所得誘導(dǎo)子的還原糖含量及對(duì)農(nóng)抗702效價(jià)的影響

2.1.1 物理法 由表1可知，凍融法與研磨法結(jié)合使用，誘導(dǎo)子的含糖量均比單一使用研磨法或反復(fù)凍融法的高，且處理次數(shù)為3次時(shí)，含糖量達(dá)到了最高值，為1.46 mg/mL，比CK組提高了256.10%。凍融法+研磨法的處理次數(shù)為2次時(shí)，誘導(dǎo)子誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的效果最佳，比CK組提高了19.85%。由圖1可知，微波次數(shù)為3次，即9 min時(shí)，誘導(dǎo)子含糖量比CK組提高了238.11%，而誘導(dǎo)子誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的最佳時(shí)間為6 min。由圖2可知，超聲破碎總時(shí)間為30 min時(shí)，誘導(dǎo)子含糖量最高，比CK組提高了 193.37%，此時(shí)誘導(dǎo)子誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的效果最佳，比CK組提高了23.83%。

表1 機(jī)械破碎對(duì)誘導(dǎo)子的還原糖含量及農(nóng)抗702效價(jià)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

2.1.2 化學(xué)滲透法 由表2可知，隨著絲氨酸濃度的增加，誘導(dǎo)子的含糖量增加，誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的效果增強(qiáng)，當(dāng)絲氨酸濃度為0.50 mol/L時(shí)，誘導(dǎo)子的含糖量、農(nóng)抗702的效價(jià)達(dá)到了最大值，分別比CK提高了56.10%、37.95%；之后隨著絲氨酸濃度的增加，誘導(dǎo)子的含糖量及誘導(dǎo)效果降低。甘氨酸濃度僅為1.5 mol/L時(shí)，處理的誘導(dǎo)子含糖量及誘導(dǎo)產(chǎn)農(nóng)抗702的量高于CK，說明絲氨酸處理的效果明顯高于甘氨酸處理。

2.1.3 酶溶法與自溶法 由圖3、圖4可知，不同保溫時(shí)間及不同溶菌酶濃度處理對(duì)誘導(dǎo)子還原糖與農(nóng)抗702效價(jià)的影響不同，整體而言，保溫時(shí)間越長(zhǎng)，誘導(dǎo)子含糖量越高，溶菌酶濃度為1.2 mg/mL， 保溫時(shí)間為24 h時(shí)， 誘導(dǎo)子含糖量達(dá)到最大值，為0.95 mg/mL，比CK提高了131.96%，差異顯著；在溶菌酶濃度為0.8 mg/mL，保溫時(shí)間為24 h時(shí)，誘導(dǎo)子誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的量最高，為380.88 μg/mL，比CK提高了39.70%，差異顯著。

表2 不同濃度的絲氨酸和甘氨酸處理對(duì)誘導(dǎo)子還原糖含量及農(nóng)抗702效價(jià)的影響

由圖5可知，應(yīng)用自溶法處理的誘導(dǎo)子，隨著NaCl濃度增加，誘導(dǎo)子的含糖量隨著增加，在NaCl濃度為4%時(shí)，誘導(dǎo)子的含糖量達(dá)到最大值，為0.84 mg/mL，比CK提高了104.04%，差異明顯，之后隨著NaCl濃度的增加而降低；誘導(dǎo)子誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的量雖然與誘導(dǎo)子含糖量的變化趨勢(shì)一致，當(dāng)NaCl濃度為4%時(shí)，農(nóng)抗702效價(jià)達(dá)到最大值，比CK提高了11.03%，差異明顯，但是NaCl濃度在1%～2%間時(shí)，農(nóng)抗702效價(jià)低于CK。

2.2 誘導(dǎo)子中主要作用成分分析

由圖6可知，沉淀部分A1、A2對(duì)農(nóng)抗702的合成誘導(dǎo)活性最好，較CK分別提高了37.91%、25.82%，差異顯著；液相部分B能夠提高農(nóng)抗702的產(chǎn)量，比CK提高了18.04%；其他4 種萃取物和萃余液，除了乙酸乙酯萃取物F對(duì)農(nóng)抗702的生物合成有誘導(dǎo)作用，較對(duì)照提高了15.52%，其他3種萃取物幾乎沒有誘導(dǎo)活性。由結(jié)果可知，細(xì)菌誘導(dǎo)子中起主要誘導(dǎo)活性的是蛋白、多糖類物質(zhì)，此外，一些非蛋白、非多糖類的小分子物質(zhì)對(duì)農(nóng)抗702的合成具有誘導(dǎo)作用，并且其極性與乙酸乙酯相近。

3 小結(jié)與討論

本研究通過5種物理破碎法處理大腸桿菌后制備成誘導(dǎo)子，其中凍融法與研磨法結(jié)合的處理次數(shù)為3次時(shí)，含糖量達(dá)到最高值，為1.46 mg/mL，比CK提高了256.10%，這與趙亞娥等的結(jié)果[17]相似，可能的原因是-20 ℃使大腸桿菌細(xì)胞迅速凍結(jié)后溫度降至-20 ℃，后又突然回到常溫融化，加上研磨，這種猝冷和常溫反復(fù)交替的過程，使大腸桿菌細(xì)胞壁兩側(cè)出現(xiàn)很大的溫差，產(chǎn)生熱應(yīng)力，引起細(xì)胞壁斷裂，促使胞壁物質(zhì)大量釋放。而超聲破碎總時(shí)間為30 min所得誘導(dǎo)子誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的效果最佳，比CK提高了 23.83%。這與戴佳錕等的研究結(jié)果[18]相似。即在破碎時(shí)間為30 min時(shí)，破碎率最高，且外源蛋白活性高。

通過加入絲氨酸、甘氨酸2種溫和化學(xué)滲透劑處理大腸桿菌后制備成誘導(dǎo)子，當(dāng)絲氨酸濃度為0.50 mol/L時(shí)，誘導(dǎo)子的含糖量以及農(nóng)抗702的效價(jià)達(dá)到了最大值，分別比CK提高了56.10%、37.95%；絲氨酸處理的誘導(dǎo)子含糖量高于甘氨酸的處理，這與李夏蘭等的研究結(jié)論[19]相反，可能的原因是化學(xué)滲透劑作用的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有差異，大腸桿菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，而李夏蘭等研究的是酵母菌，屬于真菌。且絲氨酸處理的誘導(dǎo)子誘導(dǎo)農(nóng)抗702合成的量不僅比甘氨酸處理的高，還比物理處理法的高，可能的原因是絲氨酸本身對(duì)鏈霉菌702合成農(nóng)抗702具有誘導(dǎo)活性，具體原因有待進(jìn)一步研究。

溶菌酶通過水解肽聚糖上N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，進(jìn)入細(xì)胞，改變細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)和環(huán)境，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡被打破，隨后導(dǎo)致細(xì)胞壁溶解[20]。溶菌酶濃度為1.2 mg/mL，保溫時(shí)間為24 h時(shí)，誘導(dǎo)子含糖量達(dá)到最大值，為0.95 mg/mL，比CK提高了 131.96%；同時(shí)在溶菌酶濃度為0.8 mg/mL，保溫時(shí)間為24 h時(shí)，誘導(dǎo)子誘導(dǎo)鏈霉菌702產(chǎn)農(nóng)抗702的效果最好，為 380.88 μg/mL，比CK提高了39.70%。以上結(jié)果說明，保溫時(shí)間越長(zhǎng)，誘導(dǎo)子的含糖量及誘導(dǎo)效果越好。這與賈艷萍等的結(jié)果[21]相反，雖說反應(yīng)條件不同，但是溶菌酶破壁是一種溫和無公害的方法，有利于誘導(dǎo)子誘導(dǎo)農(nóng)抗702的積累。

自溶法主要利用細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差異進(jìn)行細(xì)胞破碎，在NaCl濃度為4%時(shí)，誘導(dǎo)子的含糖量達(dá)到最大值，誘導(dǎo)效果最佳，這與單振秀等的研究結(jié)果[22]一致。細(xì)菌誘導(dǎo)子雖能有效地促進(jìn)農(nóng)抗702的生物合成，但具體的作用成分還不清楚。本試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑萃取分離的方法，將細(xì)菌誘導(dǎo)子懸浮液進(jìn)行分離，進(jìn)而測(cè)定各種萃取部分對(duì)農(nóng)抗702合成的誘導(dǎo)活性。結(jié)果表明，細(xì)菌誘導(dǎo)子中起主要誘導(dǎo)活性的是蛋白、多糖類物質(zhì)，此外一些非蛋白、非多糖類的小分子物質(zhì)對(duì)農(nóng)抗702的合成具有誘導(dǎo)作用，并且其極性與乙酸乙酯相近，這與王亞洲等的研究結(jié)果[15]相反，可能的原因是真菌代謝物與細(xì)菌細(xì)胞壁的成分存在差異。

本研究通過物理、化學(xué)、生物法處理大腸桿菌菌體制備成誘導(dǎo)子，且進(jìn)一步研究了這些誘導(dǎo)子對(duì)鏈霉菌702合成農(nóng)抗702的誘導(dǎo)效應(yīng)，為生物誘導(dǎo)子的制備方法體系提供了理論依據(jù)。本試驗(yàn)初步研究了誘導(dǎo)子的主要成分的誘導(dǎo)活性，具體是何種成分物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

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