王皓楠， 靳鵬飛， 康 迅， 謝清標(biāo)， 劉文波， 鄭服叢， 繆衛(wèi)國

(海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南海口 570228)

芽孢桿菌在生長過程中能夠產(chǎn)生不同的抑菌物質(zhì)，已報(bào)道的脂肽類物質(zhì)是芽孢桿菌作為生防菌產(chǎn)生的最主要的抑菌物質(zhì)，尤其是其可以產(chǎn)生具有極高生物工程利用價(jià)值的脂肽類和肽類抗生素[1-2]，如非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和豐源素(fengycin)；核糖體途徑合成的肽類抗生素枯草菌素(subtilin)和類羊毛硫抗生素(lantibiotic-like peptides)[3-4]等。脂肽類物質(zhì)在植物病害生物防治過程中發(fā)揮著重要的作用[5-12]，其結(jié)構(gòu)一般是由1個(gè)β-羥基脂肪酸與7～10個(gè)氨基酸以酰胺鍵形式連接的環(huán)肽[13]。Iturin家族的脂肽類化合物由七肽與14～17個(gè)碳原子的β-氨基脂肪酸鏈相連而成，包括7個(gè)異構(gòu)體iturin A、iturin C、桿菌抗霉素(bacillomycin)D、bacillomycin F、bacillomycin L、bacillomycin LC和抗霉枯草菌素(mycosubtili)。在體外檢測中，iturin表現(xiàn)出廣譜的抗真菌活性和微弱的抑細(xì)菌活性，主要抑制真菌生長[14-18]。Surfactin家族脂肽類化合物是七肽與β-羥基脂肪酸交聯(lián)形成的內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)分為surfactin A、surfactin B、surfactin C1、surfactin C2等，主要抑制細(xì)菌、病毒、支原體生長[18-19]。Fengycin是由十肽與β-氨基脂肪酸鏈(C14～C18)形成的內(nèi)酯環(huán)，包括fengycinA和fengycinB這2類——對絲狀真菌有強(qiáng)烈的抑制作用。另有研究表明，surfactin與iturin、surfactin與fengycin、iturin與fengycin兩兩之間存在協(xié)同效應(yīng)，能夠有效地增強(qiáng)后者的抑菌活性[18，20-21]。

芽孢桿菌脂肽類抗生素合成基因的特點(diǎn)是抗生素合成受一個(gè)大的基因簇控制，基因簇由合成基因、調(diào)控基因共同組成[22]。脂肽類抗生素是通過非核糖體途徑合成的，其合成酶須要翻譯后經(jīng)修飾才有活性，該過程由共價(jià)調(diào)節(jié)酶磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(phosphopantetheinyl transferase，PPTases)催化[23]。Surfactin由surfactin合成酶，即非核糖體多肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetases，NRPS)催化得到，在sfp基因缺失的情況下將不能產(chǎn)生surfactin，將外源基因整合入枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)168菌株中，使其產(chǎn)surfactin[24]。在枯草芽孢桿菌168中由于沒有編碼PPTases的基因，盡管其含有surfactin和fengycin等2種脂肽類抗生素合成酶基因，卻不產(chǎn)生任何脂肽類抗生素[23]。芽孢桿菌脂肽的快速檢測一般采用分析化學(xué)的方法，如高效液相質(zhì)譜、核磁共振等方法。目前，用分子生物學(xué)來檢測芽孢桿菌脂肽類物質(zhì)越來越普遍，根據(jù)芽孢桿菌脂肽的生物合成相關(guān)基因(sfp、srf、fenD、ituC、bmyB等)設(shè)計(jì)引物，從而快速檢測抗菌脂肽。

前期研究發(fā)現(xiàn)，筆者所在實(shí)驗(yàn)室獲得的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)HAB-6菌株具有廣譜抑菌活性，本研究對HAB-6菌株產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的機(jī)制進(jìn)行初步探究，表明其基因組中含有脂肽類物質(zhì)的合成基因和調(diào)控基因，可以為今后研究HAB-6菌株中脂肽類物質(zhì)的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌HAB-6菌株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從豇豆中分離得到；芒果炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，作為HAB-6菌株抑菌活性測定的主要靶標(biāo)菌；感受態(tài)細(xì)胞為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g，NaCl 10 g、5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7，用去離子水定容至 1 L；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、去離子水定容至1 L。

1.3 HAB-6菌株脂肽類合成基因PCR檢測

HAB-6菌株接種于LB培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。提取HAB-6菌株總DNA，以總DNA為模板，分別用10對ituC、srfAB、sboA、ituD、qk、fenD、bamC、yndj、ituB、fenB脂肽類抗生素合成相關(guān)基因引物[25](表1)，進(jìn)行靶標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳膠回收后進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化后送華大基因公司測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析。

表1 HAB-6菌株擴(kuò)增基因及引物序列

1.4 脂肽類關(guān)鍵合成酶基因PCR擴(kuò)增

以HAB-6菌株總DNA為模板，分別用6對脂肽類關(guān)鍵合成酶基因ituA、ituD、lpa-14、sfp、mycB、fenB的引物進(jìn)行靶標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳膠回收后進(jìn)行TA克隆、轉(zhuǎn)化后送華大基因測序，結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對分析。

表2 擴(kuò)增基因及引物序列

1.5 酸沉淀法提取脂肽類物質(zhì)

HAB-6菌株發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，去除菌體得離心上清液，6 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至2.0，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，用甲醇溶液溶解沉淀，為脂肽類物質(zhì)粗提物[9]。用濾紙片法檢測脂肽類物質(zhì)的抑菌活性。

1.6 LC-MS色譜條件

色譜柱SMB200-12C18柱(4.6 mm×250 mm，12)；流動相為0.05%甲酸水溶液(A) ∶乙腈(B)，梯度洗脫(表1)；流速為 1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長235 nm；進(jìn)樣量20 mL[22]。

表3 分析色譜梯度洗脫程序

1.7 脂肽類物質(zhì)粗提物抑菌活性檢測

將芒果炭疽病菌接種于9.0 cm PDA培養(yǎng)平板中央，在距離中央2.5 cm的位置等距離接種HAB-6菌體和濾紙片，每片濾紙片上加15 μL HAB-6菌株發(fā)酵上清液和脂肽類粗提物，將培養(yǎng)皿倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽類基因序列檢測

用10對引物擴(kuò)增，HAB-6菌株中分5個(gè)基因片段ituC、srfAB、ituD、fenD、yndj與目標(biāo)片段長度一致(圖1)。對擴(kuò)增得到的5個(gè)基因片段進(jìn)行測序，經(jīng)NCBI的Blast比對分析，分別為ituC、srfAB、ituD、fenD、yndj，條帶大小與目標(biāo)條帶大小一致。其中HAB-6菌株中的ituC基因序列與B.subtilisB010菌株的ituC基因(GU062715.1)同源性達(dá)到97%，HAB-6菌株中的srfAB基因序列與B.amyloliquefaciens菌株的srfAB基因(AJ575642.1)同源性達(dá)到96%，HAB-6菌株中的ituD基因序列與B.amyloliquefaciensQ-426菌株的ituD基因(JQ271536.1)同源性達(dá)到98%，HAB-6菌株中的fenD基因序列與B.amyloliquefaciensSQR9菌株的fenD基因(CP006890.1)同源性達(dá)到98%，HAB-6菌株中的yndj基因序列與B.amyloliquefaciensSQR9菌株的yndj基因(JN093032.1)同源性達(dá)到97%。

2.2 脂肽類合成酶基因序列檢測

用10對引物擴(kuò)增，HAB-6菌株中得到5個(gè)基因片段ituA、lpa-14、sfp、mycB、fenB與目標(biāo)片段長度一致(圖2)。對擴(kuò)增得到的5個(gè)基因片段進(jìn)行測序，經(jīng)NCBI的Blast比對分析，HAB-6 菌株中的ituA基因序列與B.amyloliquefaciens菌株的ituA基因(KF765804.1)同源性達(dá)到98%；HAB-6菌株中的lpa-14基因序列與B.subtilisRP24菌株的lpa-14基因(EU797520.1)同源性達(dá)到98%；HAB-6菌株中的sfp基因序列與B.amyloliquefaciensS20菌株sfp基因(JX414225.1)同源性達(dá)到99%；HAB-6菌株中的mycB基因序列與B.amyloliquefaciensQ-426菌株的mycB基因(JQ271536.1)同源性達(dá)到96%；HAB-6菌株中的fenB基因序列與B.amyloliquefaciensS20菌株的fenB基因(JX414225.1)同源性達(dá)到96%。

2.3 HAB-6菌株脂肽類抗生素組成

通過HAB-6菌株脂肽類物質(zhì)粗提物的液質(zhì)聯(lián)用可以發(fā)現(xiàn)，保留時(shí)間在3.31、7.70、24.67、25.35 min對應(yīng)的相對分子質(zhì)量分別為1 041.5、1 083.6、1 006.6、1 034.7(圖3)，與脂肽類物質(zhì)相對分子質(zhì)量吻合(表4)。質(zhì)荷比(m/z) 1 042.5、1 084.6、1 007.6、1 035.7所對應(yīng)的脂肽類抗生素為C14Iturin A、C17Iturin A、C13Surfactin A、C15Surfactin C[26]。

2.4 脂肽類物質(zhì)活性檢測

通過對峙培養(yǎng)，顯示HAB-6菌株及其發(fā)酵上清液均對芒果炭疽病菌有明顯的抑制作用，產(chǎn)生明顯的抑菌帶，但將HAB-6菌株發(fā)酵離心上清液通過酸沉淀法提取的脂肽類物質(zhì)對芒果炭疽病菌沒有抑菌活性，說明脂肽類物質(zhì)不是 HAB-6 菌株的抑菌活性物質(zhì)(圖4)。

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)后期產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)是其最重要的抗菌物質(zhì)[26]。Iturin只限于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌中產(chǎn)生，抑制植物病原菌。Iturin家族通過與細(xì)胞膜相互作用引起孔隙形成，普遍對多種真菌有較強(qiáng)的抗真菌活性[27]。于是根據(jù)已知脂肽類物質(zhì)的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，與已知基因經(jīng)Blast比對，顯示HAB-6菌株有合成脂肽類物質(zhì)的5條基因。進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物對合成脂肽類物質(zhì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行擴(kuò)增，HAB-6菌株含有編碼關(guān)鍵酶的5條基因。Sfp基因編碼的4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷酰轉(zhuǎn)移酶是芽孢桿菌非核糖體途徑脂肽類物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因。SrfAB編碼surfactin合成酶，surfactin合成酶通過磷酸泛巰基轉(zhuǎn)移酶將4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷酰轉(zhuǎn)移酶以硫酯鍵連接到PCP結(jié)構(gòu)域上[26-30]，活化后啟動surfactin的合成[23]。在B.subtilis168中由于沒有編碼PPTases的基因，即sfp，盡管其含有surfactin和fengycin這2種脂肽類抗生素合成酶基因，卻不產(chǎn)生任何脂肽類抗生素[26，31]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室另一株解淀粉芽孢桿菌HAB-2菌株缺失sfp基因，但有l(wèi)pa-14基因，同樣能產(chǎn)生有抑菌活性的脂肽類物質(zhì)。HAB-6菌株含有編碼4′-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的sfp基因、lpa-14基因以及編碼surfactin合成酶的srfAB基因，從基因的角度初步推測 HAB-6 菌株產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)應(yīng)具有抑菌活性。

通過LC-MS可以看出，HAB-6菌株代謝產(chǎn)生了 C14Iturin A、 C17Iturin A、 C13Surfactin A、C15Surfactin C等脂肽類物質(zhì)。Iturin類家族的脂肽類化合物在抑制真菌病害中起著重要作用[9-10]。最近，Tanaka等研究表明，Iturin類化合物抗真菌活性隨側(cè)鏈長度增加：C17>C16>C15[28]。很多研究顯示脂肽類物質(zhì)具有相互協(xié)同作用[29]。對峙培養(yǎng)結(jié)果顯示，HAB-6菌株以及其發(fā)酵液有抑制芒果炭疽病菌的活性，但是從HAB-6菌株發(fā)酵液中提取的脂肽類化合物沒有抑制真菌的活性。說明提取的脂肽類物質(zhì)不是HAB-6菌株抑制真菌的主要物質(zhì)。Surfactin家族主要抑制細(xì)菌、病毒，對真菌沒有明顯的抑制作用，可能HAB-6菌株代謝產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)中以surfactin為主。因此，HAB-6菌株脂肽類物質(zhì)代謝途徑以及抑菌活性物質(zhì)的分離純化還有待進(jìn)一步研究。

表4 HPLC-ESI-MS脂肽類物質(zhì)活性檢測分析

解淀粉芽孢桿菌HAB-6具有脂肽類物質(zhì)的合成基因yndj、srfAB、ituD、fenD、ituC和調(diào)控基因fenB、lpa-14、sfp、mycB、ituA，代謝產(chǎn)生C14Iturin A、C17Iturin A、C13Surfactin A、C15Surfactin C，但是酸沉淀提取得到的脂肽類物質(zhì)不是 HAB-6 菌株抑制真菌的主要物質(zhì)。

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