崔雪梅， 李冰暉， 李春生， 郭海如

(湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感 432000)

硒(Se)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的有益元素[1]，也是生物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)人和動(dòng)物的抗氧化系統(tǒng)起著關(guān)鍵作用。Se對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響具有二重性，低濃度的Se能促進(jìn)一些植物的萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)，促進(jìn)植物新陳代謝和提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性[2]；而過(guò)量的Se對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有毒害作用[3]。環(huán)境中的Se不足或過(guò)量都會(huì)通過(guò)食物鏈而影響人類的健康，所以，有關(guān)Se對(duì)植物的影響受到了普遍關(guān)注，但Se對(duì)不同植物表現(xiàn)出的生理學(xué)差異還有待深入研究。

銅(Cu)是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的一種微量元素，但植物正常生長(zhǎng)所需要的Cu量很少，當(dāng)過(guò)量Cu被植物吸收后，會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育甚至使植物死亡。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中使用大量高銅殺菌劑、污水灌溉等多種原因?qū)е峦寥乐蠧u污染日益加劇[4]。

油菜是我國(guó)主要的油料作物，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[5]。油菜種植不僅能收獲菜籽生產(chǎn)食用油，還可以采摘菜薹作為蔬菜，而且其餅粕富含蛋白質(zhì)，可作為動(dòng)物飼料，是一種倍受青睞的作物[6]。要使油菜籽和菜薹的產(chǎn)量高、質(zhì)量好，勢(shì)必要注意油菜的生長(zhǎng)環(huán)境等諸多因素。目前，雖有探討硒、銅對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響方面的報(bào)道，但多集中在單獨(dú)一種元素對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響上。王波等在恒溫箱培養(yǎng)條件下研究了銅脅迫對(duì)油菜種子萌發(fā)期生理生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，低濃度的銅對(duì)油菜有促進(jìn)作用，而高濃度的銅則產(chǎn)生了抑制作用[7]；張馳等應(yīng)用土培與水培相結(jié)合的盆栽方式，研究了硒對(duì)油菜苗期生長(zhǎng)和生理生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，硒能明顯影響油菜的生長(zhǎng)發(fā)育[8-9]，適量的補(bǔ)硒處理具有明顯的增產(chǎn)效果[10]。而關(guān)于油菜對(duì)Se、Cu交互作用的生理響應(yīng)機(jī)制還缺乏系統(tǒng)研究。本研究擬采用不同濃度的Se、Cu溶液處理盆栽油菜幼苗，處理結(jié)束后測(cè)定幼苗葉綠素、丙二醛(MDA)、硝態(tài)氮、可溶性糖、蛋白質(zhì)等指標(biāo)含量及過(guò)氧化物酶活性、淀粉酶活性，以揭示Se、Cu交互脅迫下油菜的生理響應(yīng)規(guī)律，從而找出最佳的Se、Cu供應(yīng)比例，為油菜品質(zhì)的改善和產(chǎn)量的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)于2015年10月至2016年1月在湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生科樓進(jìn)行。先用1%次氯酸鈉溶液對(duì)油菜種子進(jìn)行15 min的消毒處理，然后用無(wú)菌水沖洗5次，再用蒸餾水浸泡種子24 h，讓其充分吸水后挑選沉于水下方的籽粒飽滿的種子若干，將選好的種子均勻撒在鋪有2層濾紙的白色托盤內(nèi)，用適量蒸餾水濕潤(rùn)濾紙(水量以保持濾紙濕潤(rùn)，但不宜流動(dòng)即可)，將托盤放入MJX-250B-Z型恒溫箱進(jìn)行催芽，溫度設(shè)置為25 ℃，其間每天向托盤中添加適量、等量蒸餾水，3 d后種子露白，再移入花盆中進(jìn)行土培試驗(yàn)。

取養(yǎng)分貧瘠的沙土，用篩子篩出沙土中較大的石礫等雜質(zhì)。將土均勻地分到45個(gè)盆中，澆適量、等量蒸餾水保持土壤濕潤(rùn)。

將發(fā)芽后的油菜種子移至花盆中，每盆10株，均勻分布。將花盆放在向陽(yáng)通風(fēng)處，每天澆2次等量Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液[11]。待油菜幼苗長(zhǎng)至4～5張葉片之后，將45盆油菜隨機(jī)分成3組，每組3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行Se、Cu脅迫處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Cu原液主要成分為CuSO4，濃度設(shè)置為0、25、75、100、200 mg/L，Se原液主要成分為Na2SeO3，濃度設(shè)置為0、12、22 mg/L。試驗(yàn)具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

脅迫處理25 d后，取油菜樣品測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。主要指標(biāo)測(cè)定方法[12-16]如表2所示。

表2 各指標(biāo)測(cè)定方法

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算與處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)重復(fù)雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供硒對(duì)銅脅迫油菜中葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，是反映植物葉片光合作用能力的重要指標(biāo)[17]。脅迫處理結(jié)束后，測(cè)定油菜葉片總?cè)~綠素含量。由圖1可看出：(1)單獨(dú)噴施Cu溶液時(shí)，油菜幼苗總?cè)~綠素含量隨著Cu濃度的增加先增加后降低。當(dāng)Cu濃度達(dá)到75 mg/L時(shí)，總?cè)~綠素含量達(dá)最高值，而Cu濃度過(guò)高(200 mg/L)時(shí)，則產(chǎn)生一定的抑制作用；同樣，單獨(dú)噴施Se時(shí)，當(dāng)Se濃度為12 mg/L時(shí)，總?cè)~綠素含量最高，而當(dāng)Se濃度為22 mg/L時(shí)，總?cè)~綠素含量低于對(duì)照。由此可知，低濃度Se、Cu對(duì)油菜合成葉綠素有促進(jìn)作用，而高濃度Se、Cu則會(huì)產(chǎn)生抑制作用。(2)Se、Cu同時(shí)供應(yīng)時(shí)，低濃度Cu(≤75 mg/L)、低濃度Se(12 mg/L)配施，油菜葉綠素含量均高于對(duì)照和高硒組。當(dāng)Cu濃度超過(guò)100 mg/L時(shí)，高Se濃度(22 mg/L)組總?cè)~綠素含量均高于對(duì)照和低Se組。說(shuō)明適量的Se、Cu對(duì)葉綠素含量有促進(jìn)作用，當(dāng)環(huán)境中的Cu濃度高于100 mg/L時(shí)，噴施高濃度的Se對(duì)Cu脅迫有較好的緩解作用。

由表3可知：(1)以Se濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Se對(duì)油菜中總?cè)~綠素含量的影響達(dá)到顯著水平；(2)以Cu濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Cu對(duì)油菜總?cè)~綠素含量的影響也達(dá)到顯著水平；(3)差異源是Se、Cu的交互作用時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Se和Cu的交互作用達(dá)到顯著水平，即Se和Cu在共同影響油菜總?cè)~綠素含量方面有明顯的交互作用。

2.2 供硒對(duì)銅脅迫油菜中丙二醛濃度的影響

丙二醛是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA濃度是一個(gè)常用指標(biāo)，可以通過(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度，以此判斷植物的膜系統(tǒng)受損程度及其抗逆性。脅迫處理結(jié)束后，測(cè)定油菜葉片中MDA濃度。由圖2可看出：(1)無(wú)論噴Se濃度為多少，MDA濃度均隨Cu濃度的增加而呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，都在Cu濃度為 100 mg/L 時(shí)達(dá)到最小值，說(shuō)明低濃度的Cu可以減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，增強(qiáng)了植物的抗逆性。另外，當(dāng)單獨(dú)供Se時(shí)，植物葉片中MDA濃度在Se濃度為12 mg/L時(shí)最低，說(shuō)明低濃度的Se能增強(qiáng)植物的抗逆性。(2)當(dāng)Cu濃度≤100 mg/L時(shí)，Se濃度為22 mg/L時(shí)葉片中MDA濃度低于對(duì)照組、低Se組，說(shuō)明當(dāng)環(huán)境中Cu濃度較低時(shí)，高濃度Se對(duì)油菜的Cu脅迫緩解效果較好。(3)而當(dāng)Cu濃度為200 mg/L時(shí)，則表現(xiàn)為12 mg/L 濃度Se的緩解效果更佳，說(shuō)明低濃度Se對(duì)高濃度的Cu脅迫緩解效果更佳。

表3 總?cè)~綠素含量變化方差分析結(jié)果

注：α=0.05；SS為方差，df為自由度，MS為均方。下表同。

由表4可知：(1)以Se濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Se對(duì)油菜中MDA濃度的影響達(dá)到顯著水平；(2)以Cu濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明噴Cu對(duì)油菜MDA濃度的影響也達(dá)到顯著水平；(3)當(dāng)差異源是Se、Cu交互作用時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Se和Cu的交互作用達(dá)到顯著水平，即Se、Cu在對(duì)油菜MDA濃度影響方面有明顯的交互作用。

表4 丙二醛濃度變化方差分析結(jié)果

2.3 供硒對(duì)銅脅迫油菜中蛋白質(zhì)含量的影響

脅迫處理結(jié)束后，測(cè)定油菜葉片中蛋白質(zhì)的含量。由圖3可知：(1)當(dāng)單獨(dú)供Cu時(shí)，油菜中蛋白質(zhì)含量隨Cu濃度的升高而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)Cu濃度為75 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明低濃度的Cu對(duì)油菜合成蛋白質(zhì)有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)Cu濃度為200 mg/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量明顯低于對(duì)照組，表明高濃度的Cu產(chǎn)生抑制作用。(2)無(wú)論是單獨(dú)供Se還是Se、Cu同時(shí)供應(yīng)，都表現(xiàn)為低濃度Se(12 mg/L)條件下蛋白質(zhì)含量最高，說(shuō)明低濃度Se(12 mg/L)對(duì)Cu脅迫油菜有一定的促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用在Cu濃度為25 mg/L時(shí)達(dá)到最佳效果。當(dāng)銅濃度為200 mg/L時(shí)，供Se都在一定程度上緩解了高濃度銅的脅迫。

對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行雙因素方差分析，由表5可知：(1)以Se濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值

表5 蛋白質(zhì)含量方差分析結(jié)果

2.4 供硒對(duì)銅脅迫油菜中POD活性的影響

植物體中含有大量過(guò)氧化物酶，這是活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。脅迫處理結(jié)束后，測(cè)定油菜葉片中的POD活性。由圖4可看出：(1)在Se濃度為0和高Se濃度(22 mg/L)處理下，隨著Cu濃度的增加，油菜中POD活性逐漸降低；(2)在低Se濃度(12 mg/L)處理下，油菜中POD活性隨Cu濃度增加呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì)。結(jié)果說(shuō)明，適量Se對(duì)Cu脅迫下油菜的POD活性抑制有一定的緩解作用。

對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行雙因素方差分析，由表6可知：(1)以Se濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值F臨界值，說(shuō)明噴Cu對(duì)油菜POD活性的影響達(dá)到了顯著水平；(3)當(dāng)差異源是Se、Cu交互作用時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Se和Cu共同影響油菜POD活性的交互作用較為明顯。由此可見(jiàn)，Se對(duì)POD活性影響較小，而Cu對(duì)POD活性的影響較顯著。

表6 油菜POD活性方差分析結(jié)果

2.5 供硒對(duì)銅脅迫油菜中硝態(tài)氮含量的影響

測(cè)定植物體內(nèi)的硝態(tài)氮含量，能反映植物的氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，還可為鑒定蔬菜及其加工品的品質(zhì)提供依據(jù)。脅迫處理結(jié)束后，測(cè)定油菜葉片中硝態(tài)氮的含量。由圖5可看出：(1)不供Se時(shí)，油菜中硝態(tài)氮含量隨Cu濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)Cu濃度≤75 mg/L時(shí)，硝態(tài)氮含量變化不明顯，當(dāng)Cu濃度>100 mg/L 時(shí)，硝態(tài)氮含量開(kāi)始急劇增加。說(shuō)明低濃度Cu對(duì)油菜硝態(tài)氮含量影響較小，高濃度Cu會(huì)促進(jìn)油菜硝態(tài)氮的累積。(2)在Se、Cu同時(shí)供應(yīng)的條件下，硝態(tài)氮含量均在一定范圍內(nèi)先增加后降低，在Se濃度為12 mg/L、Cu濃度為100 mg/L組合下，硝態(tài)氮含量最低。當(dāng)Cu濃度為 200 mg/L 時(shí)，低濃度Se組和高濃度Se組油菜的硝態(tài)氮含量都明顯低于對(duì)照，說(shuō)明Se能明顯緩解高濃度Cu脅迫下的硝態(tài)氮含量的升高。

對(duì)硝態(tài)氮含量進(jìn)行雙因素方差分析，由表7可知：(1)以Se濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值， 說(shuō)明Se對(duì)油菜中硝態(tài)氮含量的影響沒(méi)有達(dá)到顯著水平；(2)以Cu濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Cu對(duì)油菜硝態(tài)氮含量的影響達(dá)到了顯著水平；(3)當(dāng)差異源是Se、Cu交互作用時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Se和Cu的交互作用達(dá)到顯著水平，即Se和Cu在共同影響油菜硝態(tài)氮含量方面的交互作用非常明顯。

2.6 供硒對(duì)銅脅迫油菜中淀粉酶活性的影響

植物的能量來(lái)源主要是淀粉， 所以需要淀粉酶來(lái)分解淀粉獲得能量，以提供組織生長(zhǎng)需要以及完成各種生理活動(dòng)。淀粉酶活性的高低常作為植物抗逆性的生化指標(biāo)。脅迫處理結(jié)束后，測(cè)定油菜幼苗中淀粉酶的活性。由圖6可看出：(1)當(dāng)單獨(dú)供Se時(shí)，油菜淀粉酶活性隨著Se濃度的增加而增加，

表7 硝態(tài)氮含量方差分析結(jié)果

說(shuō)明Se對(duì)油菜淀粉酶活性有促進(jìn)作用；(2)單獨(dú)供Cu時(shí)，隨著Cu濃度的增加，淀粉酶活性先增加后降低，在Cu濃度為75 mg/L時(shí)達(dá)到最高值，此后雖然有降低，但仍高于對(duì)照組，說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)，Cu對(duì)油菜淀粉酶活性均有促進(jìn)作用，且低濃度Cu的促進(jìn)效果更明顯；(3)當(dāng)Se、Cu同時(shí)供應(yīng)時(shí)，表現(xiàn)為高濃度Se(22 mg/L)與低濃度Cu(75 mg/L)組合下的淀粉酶活性最高。由結(jié)果可知，低濃度Se對(duì)高濃度Cu脅迫下的淀粉酶活性有一定的緩解作用。

對(duì)淀粉酶活性進(jìn)行雙因素方差分析，由表8可知：(1)以Se濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值F臨界值，說(shuō)明Cu對(duì)油菜淀粉酶活性的影響達(dá)到了顯著水平；(3)當(dāng)差異源是Se、Cu交互作用時(shí)，F(xiàn)值>F臨界值，說(shuō)明Se和Cu的交互作用達(dá)到顯著水平，即Se和Cu在共同影響油菜淀粉酶活性方面的交互作用比較明顯。

表8 淀粉酶活性方差分析結(jié)果

2.7 供硒對(duì)銅脅迫油菜中可溶性糖含量的影響

糖類作為呼吸基質(zhì)，為作物的各種合成過(guò)程和各種生命活動(dòng)提供了所需的能量。測(cè)定蔬菜作物中可溶性糖含量，可以了解和鑒定作物品質(zhì)的高低。脅迫處理結(jié)束后，測(cè)定油菜葉片中可溶性糖含量，由圖7可以看出：(1)單獨(dú)供Cu時(shí)，油菜可溶性糖含量隨Cu濃度增加呈現(xiàn)先降后升再降的變化趨勢(shì)。在Cu濃度為100 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，Cu濃度為 200 mg/L 時(shí)，可溶性糖含量明顯低于對(duì)照，說(shuō)明低濃度的Cu對(duì)油菜有促進(jìn)作用，高濃度則產(chǎn)生抑制。(2)單獨(dú)供Se時(shí)，油菜可溶性糖含量呈下降趨勢(shì)。Se、Cu同時(shí)供應(yīng)時(shí)，低濃度Se(12 mg/L)與低濃度Cu(75 mg/L)會(huì)提高可溶性糖含量，隨著Cu濃度的增加，則表現(xiàn)為高濃度Se(22 mg/L)與高濃度Cu組合會(huì)提高可溶性糖的含量。結(jié)果表明，低濃度Se與低濃度Cu對(duì)油菜可溶性糖含量有促進(jìn)作用，而高濃度Se能有效緩解高濃度的Cu脅迫。

對(duì)可溶性糖含量進(jìn)行雙因素方差分析，由表9可知：(1)以Se濃度為差異源時(shí)，F(xiàn)值

表9 可溶性糖含量方差分析

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)盆栽油菜進(jìn)行不同濃度Se、Cu單施和配施試驗(yàn)，分析幼苗葉綠素、丙二醛、硝態(tài)氮、可溶性糖、蛋白質(zhì)等指標(biāo)的含量及過(guò)氧化物酶活性、淀粉酶活性的變化規(guī)律。結(jié)果表明：(1)單獨(dú)噴施Cu溶液時(shí)，油菜葉綠素、蛋白質(zhì)含量及淀粉酶活性均在Cu濃度為75 mg/L時(shí)達(dá)最高值，此后逐漸降低；而可溶性糖含量在銅濃度為100 mg/L時(shí)達(dá)最高值，當(dāng)Cu濃度為200 mg/L時(shí)，大部分指標(biāo)表現(xiàn)為受抑制。另外，Se對(duì)POD活性影響較小，而Cu對(duì)POD活性的影響較明顯。王波等研究銅溶液對(duì)幾種油菜種子萌發(fā)期的影響時(shí)也得出，低濃度銅對(duì)萌發(fā)期可溶性糖含量及淀粉酶活性有促進(jìn)作用，高濃度銅溶液抑制種子的萌發(fā)[9]。(2)單獨(dú)噴施Se溶液時(shí)，油菜葉綠素、MDA、蛋白質(zhì)含量均在硒濃度為12 mg/L時(shí)效果最佳，其余部分指標(biāo)表現(xiàn)為Se濃度為22 mg/L時(shí)效果最佳，與對(duì)照相比，供Se組各項(xiàng)指標(biāo)都較好。劉新偉等在水培環(huán)境下研究硒對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響時(shí)也得出，少量供硒對(duì)油菜的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[18-19]。(3)Se、Cu同時(shí)供應(yīng)時(shí)，低濃度Se(12 mg/L)與低濃度Cu(75 mg/L)的組合，高濃度Se(22 mg/L)與高濃度Cu(>100 mg/L)的組合對(duì)油菜生理指標(biāo)的綜合影響較好。說(shuō)明低濃度的Se、Cu配施，對(duì)油菜各項(xiàng)生理指標(biāo)均有促進(jìn)作用，而當(dāng)環(huán)境中的Cu濃度超過(guò) 100 mg/L 時(shí)，表現(xiàn)為較高濃度的Se能有效緩解Cu對(duì)油菜的脅迫作用。

綜上所述，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行雙因素方差分析表明，單獨(dú)噴Se溶液，對(duì)油菜中總?cè)~綠素和MDA含量的影響達(dá)到顯著水平，而對(duì)其他5項(xiàng)指標(biāo)的影響均未達(dá)顯著水平；單獨(dú)噴Cu溶液時(shí)，Cu對(duì)油菜總?cè)~綠素含量、MDA濃度、POD活性、硝態(tài)氮含量、淀粉酶活性影響均達(dá)顯著水平，僅對(duì)可溶性糖、蛋白質(zhì)含量的影響為不顯著；同時(shí)噴施Se、Cu溶液時(shí)，對(duì)大部分指標(biāo)影響均達(dá)顯著水平。說(shuō)明硒Se對(duì)Cu脅迫有較好的緩解作用。

目前，還沒(méi)有關(guān)于硒、銅交互脅迫下油菜的生理響應(yīng)研究。但已有文獻(xiàn)報(bào)道了低濃度的硒可以緩解西葫蘆鉛脅迫的毒害，高濃度的硒與鉛脅迫存在協(xié)同互作而使西葫蘆毒害程度加重[1]。本試驗(yàn)在盆栽環(huán)境下研究了硒、銅交互作用下油菜的蛋白質(zhì)含量等生理指標(biāo)、酶活性的變化規(guī)律，確定了最佳的硒、銅配施比例，這不僅對(duì)提高糧油產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義，也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

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