秦 蕾，孫玉英，畢可然，高迎莉

(淮海工學(xué)院 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)是水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的一種極其重要的致病原。隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，因該菌引發(fā)的病害問題日益突出，給該產(chǎn)業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。魚類遲緩愛德華氏菌病難以防控的原因是多方面的。其中，遲緩愛德華氏菌是胞內(nèi)寄生菌，對其致病機(jī)理和胞內(nèi)寄生機(jī)制不清楚是主要原因之一。研究表明，魚類主要通過巨噬細(xì)胞參與對遲緩愛德華氏菌感染的炎癥應(yīng)答[2-5]。遲緩愛德華氏菌可以逃避巨噬細(xì)胞的吞噬并在巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖，最終導(dǎo)致宿主全身感染[6]。 遲緩愛德華氏菌與巨噬細(xì)胞的相互作用是該菌感染致病過程的重要環(huán)節(jié)，針對其互作機(jī)制的研究，對魚類遲緩愛德華氏菌病的防治具有重要意義。

目前較為集中深入的工作是關(guān)于遲緩愛德華氏菌各種毒力因子的研究，包括T3SS、T6SS、雙組份系統(tǒng)、溶血素和外膜蛋白等[7-12]， 但對遲緩愛德華氏菌復(fù)雜的胞內(nèi)寄生機(jī)制仍缺乏足夠了解，對遲緩愛德華氏菌與巨噬細(xì)胞的互作關(guān)系也仍然不明確，這在很大程度上限制了對魚類遲緩愛德華氏菌病的防治。 巨噬細(xì)胞主要通過凋亡、產(chǎn)生活性氧和一氧化氮等效應(yīng)分子的方式來清除病原微生物[13-15]。本研究通過對不同毒力遲緩愛德華氏感染巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的Caspase-3、活性氧和一氧化氮等相關(guān)生物效應(yīng)分子進(jìn)行測定，探討不同毒力菌株對巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，旨在為明晰遲緩愛德華氏菌的致病機(jī)理和胞內(nèi)寄生機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時也為尋找根除魚類遲緩愛德華氏菌病的關(guān)鍵靶點開辟新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用健康大菱鲆(Scophthalmusmaximus)取自江蘇贛榆某大菱鲆養(yǎng)殖場，充氧運回實驗室暫養(yǎng)3 d后用于分離巨噬細(xì)胞，遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株和弱毒株分離自不同養(yǎng)殖場患病的大菱鲆，其半數(shù)致死密度分別為3.2×102cfu/mL和1.7×106cfu/mL。

1.2 試驗試劑

L-15培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；Percoll(Pharmacia)；青鏈霉素、慶大霉素(碧云天)；MS-222(杭州動物藥品廠)；TrypLE(Invitrogen)；Caspase-3檢測試劑盒(BioVision)；活性氧(ROS)測試盒(南京建成)；一氧化氮檢測(NO)試劑盒(碧云天)。

1.3 大菱鲆頭腎巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉大菱鲆，75%酒精消毒魚體剖取頭腎。用加有雙抗和慶大霉素的細(xì)胞洗滌液清洗頭腎，清洗后將其置于100目的細(xì)胞篩上研磨得到細(xì)胞懸液。利用31%/45%的Percoll密度梯度，400 g，20 min，水平離心分離巨噬細(xì)胞。收集位于梯度帶的巨噬細(xì)胞加入L-15培養(yǎng)基，200 g，5 min離心反復(fù)清洗兩次。獲得的巨噬細(xì)胞以1.5×106cfu/mL密度接種于24孔板，20 ℃培養(yǎng)24 h后換新培養(yǎng)基，以去除懸浮細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞純度。培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TrypLE消化后計數(shù)并同時做細(xì)胞涂片，甲醛固定用于Giemsa染色觀察。

1.4 遲緩愛德華氏菌侵染巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞換新培養(yǎng)基后加入計數(shù)好的處于對數(shù)生長期的菌液進(jìn)行感染，感染復(fù)數(shù)采用50∶1 (設(shè)3個重復(fù))， 400 g離心5 min，孵育2 h，細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3次，加入含有200 μg/mL的慶大霉素處理1 h，洗滌3次后繼續(xù)培養(yǎng)，在指定的時間點取樣做各項檢測。同時設(shè)不加菌液的細(xì)胞作為對照。

1.5 巨噬細(xì)胞Caspase-3活性檢測

分別在感染后12 h和24 h取樣，按Caspase-3檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，計數(shù)細(xì)胞1×106cfu/mL,用50 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上孵育10 min，10 000 g離心1 min，測定上清液蛋白濃度，稀釋100 μg蛋白于50 μL細(xì)胞裂解液中，先后加入50 μL 2×反應(yīng)緩沖液(含10 mmol/L DTT)和5 μL 4 mmol/L DEVD-pNA底物(終濃度200 mmol/L)，孵育2 h后酶標(biāo)儀讀數(shù)A405。

1.6 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧檢測

活性氧檢測工作在菌液加入巨噬細(xì)胞后直接進(jìn)行。分別在感染后30 min和120 min添加DCFH-DA于細(xì)胞培養(yǎng)基中(工作濃度10 μmol/L),孵育30 min。TrypLE消化細(xì)胞2 min，培養(yǎng)基終止消化，600 g離心5 min收集細(xì)胞，預(yù)冷的 1磷酸鹽緩沖液洗2遍，離心收集細(xì)胞沉淀物，磷酸鹽緩沖液重懸后酶標(biāo)儀讀數(shù)A525。

1.7 巨噬細(xì)胞一氧化氮分泌量測定

于感染后6 h和24 h吸取上清培養(yǎng)液。按一氧化氮測定試劑盒操作分別加入Griess試劑，測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中巨噬細(xì)胞一氧化氮生成量。

1.8 統(tǒng)計分析

所有結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，與對照組比較；P<0.05，不同毒力感染組比較)。

2 結(jié) 果

2.1 大菱鲆頭腎巨噬細(xì)胞的Giemsa染色觀察

培養(yǎng)的大菱鲆頭腎巨噬細(xì)胞經(jīng)Giemsa染色見圖1，可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)豐富，含有大小不等的空泡，胞核較小多偏向一端，符合巨噬細(xì)胞典型的形態(tài)特點。

圖1 大菱鲆頭腎巨噬細(xì)胞的Giemsa染色(比例尺=10 μm)

2.2 不同毒力遲緩愛德華氏菌誘發(fā)巨噬細(xì)胞Caspase-3活性的比較

遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株和弱毒株分別感染巨噬細(xì)胞12 h和24 h后，胞內(nèi)Caspase-3的活性檢測結(jié)果見圖2。與對照組相比，兩株菌感染的巨噬細(xì)胞均能檢測到較高的Caspase-3活性，而且隨時間延長其活性逐漸增加，其中弱毒株感染組Caspase-3的活性在各時間點均顯著高于強(qiáng)毒株感染組(P<0.05)。

2.3 不同毒力遲緩愛德華氏菌誘發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的比較

研究結(jié)果顯示，遲緩愛德華氏菌能夠誘發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，感染后30 min，強(qiáng)毒株感染組和弱毒株感染組巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧差異不顯著(P>0.05)；但感染后120 min，與弱毒株相比，強(qiáng)毒株能夠顯著抑制活性氧的產(chǎn)生(P<0.05)，表明強(qiáng)毒株未能引發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的呼吸爆發(fā)(圖3)。

圖2 遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株和弱毒株對巨噬細(xì)胞Caspase-3活性的影響

圖3 遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株和弱毒株對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的影響

2.4 不同毒力遲緩愛德華氏菌誘發(fā)巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮的比較

遲緩愛德華氏菌能夠誘發(fā)大菱鲆巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮，但與弱毒株感染組相比，在各時間點強(qiáng)毒株感染表現(xiàn)出對巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮的抑制作用(P<0.05)(圖4)。

圖4 遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株和弱毒株對巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮的影響

3 討 論

巨噬細(xì)胞不僅是執(zhí)行固有免疫重要的效應(yīng)細(xì)胞，同時作為抗原呈遞細(xì)胞也在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要輔助功能。其強(qiáng)大的吞噬能力能對病原菌造成很大的威脅，而病原微生物在與巨噬細(xì)胞的長期斗爭過程中會逐漸形成多種逃避殺傷的有效策略，使其得以在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并增殖[16]。已有的研究證實，遲緩愛德華氏菌能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖[17-19]，這說明遲緩愛德華氏菌具備適應(yīng)巨噬細(xì)胞殺傷的能力，并且能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)大量繁殖并導(dǎo)致隨后的全身性感染，而遲緩愛德華氏菌弱毒株卻能被巨噬細(xì)胞吞噬后逐漸清除顯示出較弱的致病能力[14]。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3是最關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。在細(xì)胞凋亡的早期階段，Caspase-3被激活裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[20]。巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡可殺死胞內(nèi)寄生菌，阻止細(xì)菌在宿主體內(nèi)的傳播擴(kuò)散，并能激活臨近未感染的巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其對病原的殺傷力[21-22]。因此，對胞內(nèi)寄生菌而言，巨噬細(xì)胞的凋亡情況對其命運至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，不同毒力的遲緩愛德華氏菌侵染巨噬細(xì)胞后都能夠檢測到Caspase-3的活性，但與弱毒株相比，遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株能夠顯著抑制Caspase-3的活性。研究結(jié)果表明，遲緩愛德華氏菌能夠觸發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡，但強(qiáng)毒株能夠抑制巨噬細(xì)胞凋亡，從而在胞內(nèi)存活繁殖，而弱毒株則能誘發(fā)巨噬細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致其最終被清除。Okuda等[18]在遲緩愛德華氏菌感染鼠巨噬細(xì)胞的研究中也證實，遲緩愛德華氏菌能夠通過上調(diào)NF-κB基因的表達(dá)來抑制巨噬細(xì)胞的凋亡從而來保護(hù)自己。 遲緩愛德華氏菌的這種抗凋亡能力可能為其逃離凋亡細(xì)胞之前提供足夠的時間以改變其毒力相關(guān)的表型，從而增強(qiáng)其感染寄生的能力。遲緩愛德華氏菌的抗凋亡機(jī)制目前仍不十分清楚，還有待進(jìn)一步研究。

活性氧在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中扮演著極其重要的角色，巨噬細(xì)胞受到刺激或進(jìn)行吞噬作用后能夠發(fā)生呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量活性氧，并通過活性氧清除吞噬的微生物。然而其產(chǎn)生的氧壓力同時對巨噬細(xì)胞本身也會產(chǎn)生重要的影響[23]。已發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌能夠抑制藍(lán)曼龍頭腎巨噬細(xì)胞和牙鲆腹腔巨噬細(xì)胞活性氧的釋放[14,17]。同樣，本研究結(jié)果顯示遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株未能引起大菱鲆頭腎巨噬細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的呼吸爆發(fā)，進(jìn)一步證實該菌株有能力阻止巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，以達(dá)到保護(hù)自己和減少巨噬細(xì)胞受損從而為其提供更適居住場所的雙重目的。遲緩愛德華氏菌抑制活性氧產(chǎn)生的機(jī)制尚不十分明確。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌能夠上調(diào)RhoGDI蛋白的表達(dá)(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)， 該蛋白被證實能夠抑制活性氧的主要來源-NADPH氧化酶的活化[24]，或許能夠解釋這一現(xiàn)象，但遲緩愛德華氏菌抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的真正機(jī)制還有待探討。

作為活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞效應(yīng)分子，一氧化氮能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞抑制和殺傷細(xì)菌、病毒及寄生蟲等病原體，是巨噬細(xì)胞防御系統(tǒng)中的一個重要因子[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，與弱毒株相比，遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株能夠顯著抑制大菱鲆頭腎巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量一氧化氮。與之類似，強(qiáng)毒力結(jié)核桿菌也表現(xiàn)出對巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮的抑制作用[26]。 遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株表現(xiàn)出對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的抑制作用可能是其能夠逃避巨噬細(xì)胞殺傷的重要原因之一。然而，Ishibe等[15]研究卻發(fā)現(xiàn)相較于弱毒株，遲緩愛德華氏菌強(qiáng)毒株能誘發(fā)牙鲆腹腔巨噬細(xì)胞更多的一氧化氮產(chǎn)生。不同來源的巨噬細(xì)胞對遲緩愛德華氏菌應(yīng)答出現(xiàn)部分差異，可能與巨噬細(xì)胞存在的異質(zhì)性有關(guān)[27]，但也無法排除菌株之間的差異所導(dǎo)致的結(jié)果。

本研究闡明了不同毒力遲緩愛德華氏菌感染對巨噬細(xì)胞應(yīng)激的調(diào)控作用，初步揭示了遲緩愛德華氏菌與巨噬細(xì)胞相互作用的機(jī)理，即強(qiáng)毒株和弱毒株分別對巨噬細(xì)胞的應(yīng)激發(fā)揮抑制和誘導(dǎo)作用，從而影響了細(xì)菌的生長，繁殖和宿主的發(fā)病，為闡明遲緩愛德華氏菌病的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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