王巖, 吳佳鵬, 關(guān)鳳杰, 何翔,, 焦黎靜, 洪義國(guó)

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有機(jī)物消耗對(duì)珠江口沉積物反硝化和厭氧氨氧化過程的影響

王巖1,2, 吳佳鵬1,2, 關(guān)鳳杰1, 何翔1,4, 焦黎靜1,2, 洪義國(guó)3*

1. 科學(xué)院南海海洋研究所, 熱帶海洋環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 10301 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 00049 廣州大學(xué), 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 0006 暨南大學(xué), 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣州 10632 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3. 廣州大學(xué), 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 510006 4. 暨南大學(xué), 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣州 510632

反硝化及厭氧氨氧化是兩個(gè)主要的氮匯途徑, 能有效地將生態(tài)系統(tǒng)中的固定氮轉(zhuǎn)化為N2或N2O釋放到大氣中。利用微宇宙與中宇宙模擬實(shí)驗(yàn), 本研究系統(tǒng)地分析了有機(jī)物的種類、可利用性和濃度大小對(duì)珠江口沉積物反硝化和厭氧氨氧化過程的影響。研究結(jié)果表明: 有機(jī)物的消耗能顯著提高反硝化的活性, 不同種類的有機(jī)物表現(xiàn)出不同的活性, 簡(jiǎn)單的小分子有機(jī)物活性最高, 復(fù)雜有機(jī)物次之, 惰性有機(jī)物則難以被利用。然而, 有機(jī)物對(duì)厭氧氨氧化過程的促進(jìn)并不顯著, 這主要與其自養(yǎng)型的代謝方式有關(guān)。中宇宙實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步表明, 有機(jī)物的消耗不但給反硝化過程提供了能源, 而且由于有機(jī)物分解消耗氧氣, 為反硝化過程的發(fā)生提供了必要的環(huán)境條件。在有機(jī)物負(fù)荷狀態(tài)下, 反硝化過程在珠江口沉積物的脫氮過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用?？傊? 沉積物中微生物脫氮是依賴有機(jī)物消耗的過程, 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的碳氮代謝耦合。

有機(jī)物; 反硝化; 厭氧氨氧化; 珠江口

1 前言

長(zhǎng)期以來, 反硝化被認(rèn)為是脫氮的唯一途徑, 它是指在缺氧條件下(< 6.25 μmol O2·l-1), 部分異養(yǎng)微生物利用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體, 有機(jī)質(zhì)作為電子供體, 將活性氮經(jīng)過一系列還原反應(yīng)生成N2或N2O等氣體釋放到大氣中[1]。厭氧氨氧化(Anammox)的發(fā)現(xiàn)改變了這一傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)[1–4], 之后在陸地和海洋環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化的活性[4–5]。不同于傳統(tǒng)的反硝化過程, 厭氧氨氧化過程分別以銨鹽和亞硝酸鹽作為電子供體和受體, 由自養(yǎng)的厭氧氨氧化菌在厭氧條件下直接生成N2, 在氮循環(huán)過程中具有重要的作用[6]。在沿海近岸地區(qū), 反硝化在脫氮過程中占主導(dǎo)作用, 厭氧氨氧化作用只占很小的比例。候等人基于沿海濕地的氮同位素示蹤實(shí)驗(yàn), 估計(jì)厭氧氨氧化作用占研究區(qū)域中總活性氮去除的3.8—10.7%[7]。Rich等人在Chesapeake Bay的沉積物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 厭氧氨氧化氮去除的貢獻(xiàn)率為0—22%[8]。但是在開放的海洋, 厭氧氨氧化在脫氮過程發(fā)揮的作用甚至超過反硝化。在波羅的海沉積物同位素培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 約65%的N2是由厭氧氨氧化作用產(chǎn)生的, 其余部分通過反硝化產(chǎn)生[9]。而在Skagerrak大陸架沉積物中, 通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高達(dá)67%的N2來源于厭氧氨氧化過程, 而僅有33%的N2來源于反硝化[4]。目前發(fā)現(xiàn)的最大的厭氧氨氧化貢獻(xiàn)率是挪威海溝700 m深處的沉積物, 約為67—79%[10]。

在自然環(huán)境條件下, 反硝化過程和厭氧氨氧化過程受到多種環(huán)境因素的影響, 例如有機(jī)物、溶解氧以及濃度等。其中有機(jī)物是反硝化過程的能量基礎(chǔ), 同時(shí)有機(jī)質(zhì)礦化也可為厭氧氨氧化作用提供反應(yīng)底物NH4+, 因此有機(jī)物的濃度高低也會(huì)在一定程度上控制著脫氮速率[11]。另外, 有機(jī)物礦化過程伴隨著沉積物中的溶解氧消耗, 改變沉積物中的氧化還原條件, 進(jìn)而影響沉積物脫氮過程[12]。研究表明, 在太平洋東北部(ETSP), 反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和活性均受到海水缺氧層(ODZ)中有可利用機(jī)物的調(diào)節(jié)[13–16]。利用中宇宙模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)Chesapeake Bay沉積物的脫氮過程研究發(fā)現(xiàn), 有機(jī)物的添加會(huì)極大地促進(jìn)活性氮的去除[17]。在太平洋東北部(ETNP)和太平洋南部(ETSP)的氧氣最小層(OMZ), 反硝化過程受到有機(jī)碳的限制。當(dāng)在ETNP水體中添加少量的有機(jī)碳時(shí), 反硝化菌呈指數(shù)增長(zhǎng), 同時(shí)伴有硝酸鹽和亞硝酸鹽的快速減少。在ETSP的氧氣最小層, 葡萄糖的添加同樣促進(jìn)反硝化過程, 但對(duì)厭氧氨氧化卻沒有明顯的促進(jìn)效應(yīng)[18]。

自工業(yè)化革命以來, 人類活動(dòng)已經(jīng)極大的改變了生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程, 顯著增加了活性氮的輸入量。目前地球陸地生態(tài)系統(tǒng)氮輸入超過200 Tg Nyr-1, 比自然狀態(tài)下增加1倍多, 而且在可見的未來還會(huì)持續(xù)增加[19-21]。由于人類的介入, 生態(tài)系統(tǒng)自身的反饋機(jī)制會(huì)對(duì)高氮負(fù)荷做出響應(yīng), 使得微生物脫氮過程加速, “盡可能”的維持氮素輸入和輸出的平衡狀態(tài)。在這一過程中, 反硝化和厭氧氨氧化的會(huì)強(qiáng)烈的受到有機(jī)物存在的影響。然而, 在高氮負(fù)荷條件下有機(jī)物對(duì)沉積物脫氮過程的影響我們還知之甚少, 是一個(gè)需要深入探索的重要科學(xué)問題。這一問題的闡明, 將有助于理解在人類活動(dòng)強(qiáng)烈干擾下生態(tài)系統(tǒng)中碳氮循環(huán)的耦合關(guān)系, 為開發(fā)新型脫氮技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

珠江口位于中國(guó)華南地區(qū), 近30年來的工農(nóng)業(yè)發(fā)展使得該區(qū)域遭受到了嚴(yán)重的氮污染[22], 珠江口水體氮素營(yíng)養(yǎng)鹽水平逐年上升, 特別是溶解無機(jī)氮濃度增加了十倍[23], 造成水體嚴(yán)重缺氧, 富營(yíng)養(yǎng)化狀況加劇[24]。同時(shí), 人類活動(dòng)也向河口排入大量的有機(jī)物, 形成高有機(jī)碳負(fù)荷狀態(tài)。本研究則利用微宇宙與中宇宙模擬實(shí)驗(yàn), 系統(tǒng)地分析了有機(jī)物的種類、可利用性和濃度對(duì)珠江口沉積物反硝化和厭氧氨氧化過程的影響, 更好地了解沉積系統(tǒng)微生物氮控制機(jī)理。

2 材料與方法

2.1 研究區(qū)域與樣品采集

于2015年5月, 在珠江口上游 (113.75° N, 22.52° E, 水深9 m, 溫度27.6 ℃, 鹽度5‰), 使用無擾動(dòng)箱式采泥器采集沉積物樣品, 轉(zhuǎn)移至10 L干凈的聚乙烯桶中。用Plexiglas采水器采集原位水, 裝于20 L干凈的聚乙烯桶。于4℃避光保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室, 建立微宇宙(12 mL)以及中宇宙(20 L)模擬培養(yǎng)體系。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 微宇宙(Microcosm)模擬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):

(1)不同種類簡(jiǎn)單有機(jī)物對(duì)反硝化與厭氧氨氧化過程的影響分析: 分別稱取2 g沉積物樣品, 放入12.5 mL Labco頂空甁中, 每個(gè)樣品做2個(gè)平行, 然后加入8 mL原位海水(經(jīng)過0.22 μm膜過濾, 以下同)以及2顆玻璃珠, 擰緊蓋子, 充氦氣15 min, 達(dá)到充分的厭氧條件。預(yù)培養(yǎng)30 d, 使得樣品本底硝酸鹽消耗完畢(< 2 μM)。然后, 分別添加葡萄糖、乳酸鈉、甲酸鈉和丙酮酸鈉4種不同的簡(jiǎn)單有機(jī)物到樣品瓶中, 分析不同種類的小分子簡(jiǎn)單有機(jī)物對(duì)兩個(gè)脫氮過程的影響。實(shí)驗(yàn)中共設(shè)置7個(gè)實(shí)驗(yàn)組: C1, 為對(duì)照組, 不添加任何外源有機(jī)物和無機(jī)氮; C2, 添加NH4+; C3, 添加NO3-和NH4+; C4, 添加葡萄糖、NO3-和NH4+; C5, 添加乳酸鈉、NO3-和 NH4+; C6, 添加甲酸鈉、NO3-和NH4+; C7, 添加丙酮酸鈉、NO3-和NH4+; 其中各小分子有機(jī)物的濃度為50 mg·L-1, NO3-的濃度為 500 μM , NH4+濃度為300 μM。每隔3h取樣(200 μL), 測(cè)定樣品中NO3-和NH4+濃度[25]。共取樣3次, 繪制時(shí)間—濃度散點(diǎn)圖(圖1), 根據(jù)NO3-和NH4+濃度的變化分別計(jì)算體系中反硝化(公式(1))與厭氧氨氧化速率(公式(2))。

其中,V為反硝化速率,V為厭氧氨氧化速率, △為濃度變化, △為反應(yīng)時(shí)間。

(2)不同類型有機(jī)物對(duì)反硝化與厭氧氨氧化過程影響的分析: 前期處理與預(yù)培養(yǎng)過程同上, 分別添加3種不同可利用性的有機(jī)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比: 簡(jiǎn)單有機(jī)物(葡萄糖)、惰性有機(jī)物(樹葉研磨液)和復(fù)雜有機(jī)物(魚餌飼料), 設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組: 1、D1, 為對(duì)照組; 2、D2, 50 mg·L-1簡(jiǎn)單有機(jī)物、 NO3-和 NH4+; 3、D3, 50 mg·L-1惰性有機(jī)物、NO3-和 NH4+; 4、D4, 50 mg·L-1復(fù)雜有機(jī)物、NO3-和NH4+, 其中NO3-的濃度為 500 μM , NH4+濃度為300 μM。每隔10 h取樣, 分別測(cè)定NO3-和NH4+濃度。共取樣6次, 計(jì)算反硝化與厭氧氨氧化速率。

2.2.2 中宇宙(Mesocosm)模擬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

采用2.5 kg沉積物和18 L原位水建立兩個(gè)中宇宙培養(yǎng)體系(總體積約為20 L), 在室溫且避光條件下培養(yǎng)。首先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng), 當(dāng)體系中基本消耗完畢后, 在兩個(gè)體系中分別加入高濃度(終濃度為10 mg·mL-1)和低濃度的葡萄糖(終濃度為1 mg·mL-1)。每24 h取水樣一次, 用0.22 μm的濾膜過濾后測(cè)定(NH4+, NO3-, NO2-)濃度, 連續(xù)取樣測(cè)定27 d。同時(shí), 使用多參水質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定體系中的水體溶解氧()變化, 并采用微生物活性測(cè)定試劑盒(Dojindo, 日本)測(cè)定微生物的活性。

3 結(jié)果與分析

3.1 微宇宙模擬不同有機(jī)物種類對(duì)沉積物微生物脫氮過程的影響

分別向沉積物中添加不同種類有機(jī)物進(jìn)行微宇宙培養(yǎng), 并分別計(jì)算出相應(yīng)的反硝化與厭氧氨氧化反應(yīng)率, 結(jié)果如圖1所示。在對(duì)照組C1中, 基本檢測(cè)不到反硝化和厭氧氨氧化活性, 主要原因在于培養(yǎng)體系中的本底有機(jī)物、NH4+以及NO3-已經(jīng)被微生物消耗完畢。在C2實(shí)驗(yàn)組中只加入NH4+, 只檢測(cè)到很低的反硝化和厭氧氨氧化反應(yīng)速率, 分別為0.16 μM N· g-1·h-1和0.14 μM N· g-1·h-1; NH4+的濃度基本沒有變化, 表明體系中除了厭氧氨氧化作用外不存在其他途徑利用NH4+(例如微生物或者藻類的同化作用)。在C3實(shí)驗(yàn)組中只加入NH4+和NO3-, 無任何外源有機(jī)物的添加的條件下, 只檢測(cè)到很低的反硝化和厭氧氨氧化速率, 分別為0.23 μM N· g-1·h-1和0.27 μM N· g-1·h-1。在該組實(shí)驗(yàn)中, 體系中已經(jīng)加入了厭氧氨氧化作用反硝化作用的底物, 但其反應(yīng)速率卻很低, 說明沒有可利用有機(jī)物的存在, 反硝化和厭氧氨氧化作用的發(fā)生會(huì)受到限制。

在C4實(shí)驗(yàn)組中, 同時(shí)加入NH4+、NO3-和葡萄糖, 反硝化速率和厭氧氨氧化速率都有提高, 但反硝化速率的提高更為顯著, 是厭氧氨氧化速率的8倍, 分別為8.79 μM N· g-1·h-1和0.92 μM N· g-1·h-1。表明葡萄糖對(duì)反硝化和厭氧氨氧化作用都有促進(jìn)作用, 但更有利于反硝化作用的進(jìn)行。在C5實(shí)驗(yàn)組中, 同時(shí)加入NH4+、NO3-和乳酸鈉, 反硝化和厭氧氨氧化速率分別為15.16 μM N· g-1· h-1和1.0 μM N· g-1·h-1, 是反應(yīng)速率最高的一組, 較C3實(shí)驗(yàn)組速率提高了15倍左右, 表明乳酸鈉是容易被利用的電子供體, 顯著地促進(jìn)了反硝化和厭氧氨氧化作用。C6實(shí)驗(yàn)組中, 同時(shí)加入NH4+、NO3-和甲酸鈉, 測(cè)得的反硝化和厭氧氨氧化速率較低, 分別為1.77 μM N·g-1· h-1和0.3 μM N· g-1·h-1, 說明甲酸鈉不是合適的有機(jī)物電子供體。C7實(shí)驗(yàn)組中同時(shí)加入NH4+、NO3-和丙酮酸鈉, 得到的反硝化和厭氧氨氧化速率分別為9.57 μM N·g-1·h-1和1.92 μM N·g-1·h-1; 雖然不及乳酸鈉, 丙酮酸鈉也能有效的促進(jìn)反硝化過程。即從試驗(yàn)結(jié)果看, 添加丙酮酸鈉的實(shí)驗(yàn)組反硝化速率高于添加乳酸鈉的反硝化速率。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉等簡(jiǎn)單有機(jī)物能夠有效的促進(jìn)反硝化過程, 同時(shí)也促進(jìn)厭氧氨氧化過程。由于不同有機(jī)物物被微生物利用的難易程度的差異, 導(dǎo)致不同有機(jī)物對(duì)反硝化過程作用程度的不同。

3.2 不同可利用性有機(jī)物對(duì)沉積物微生物脫氮過程的影響

采用微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分析了簡(jiǎn)單有機(jī)物、惰性有機(jī)物和復(fù)雜有機(jī)物對(duì)珠江口沉積物微生物反硝化和厭氧氨氧化過程的影響, 培養(yǎng)體系中NH4+、NO3-濃度在48 h內(nèi)的時(shí)間序列變化如圖2所示。在對(duì)照組D1中, 只加入NH4+和NO3-, 不加入任何外源有機(jī)物情況下, 發(fā)現(xiàn)NH4+與NO3-的濃度基本保持不變, 表明無反硝化和厭氧氨氧化活性(圖2A)。在加入簡(jiǎn)單容易利用有機(jī)物(葡萄糖)的體系D2中, 前12 hNH4+和NO3-濃度基本不變, 從12 h開始體系中NO3-濃度以11.28 μM N· (g·h)-1速率下降, 48 h之后體系NO3-下降速率逐漸變緩, 而NH4+濃度則一直緩慢下降, 平均速率為1.56 μM N· (g·h)-1(圖2B)。該結(jié)果與C4組測(cè)定的反硝化率和厭氧氨氧化速率基本一致, 進(jìn)一步證明簡(jiǎn)單容易利用有機(jī)物可以顯著促進(jìn)反硝化過程, 而對(duì)厭氧氨氧化過程促進(jìn)作用不明顯。從動(dòng)力學(xué)變化角度來看, 前12 h體系處于緩沖狀態(tài), 12 h后體系中的反硝化活性顯著增強(qiáng), 而36 h之后反硝化活性減弱, 推測(cè)與有機(jī)物的耗盡有關(guān)。

圖1 不同種類有機(jī)物對(duì)反硝化與厭氧氨氧化速率的影響

圖2C顯示了加入惰性有機(jī)物體系D3中NH4+和NO3-濃度在48 h內(nèi)的時(shí)間序列變化, 發(fā)現(xiàn)NO3-與NH4+濃度基本不變, 表明惰性有機(jī)物對(duì)于反硝化和厭氧氨氧化基本沒有促進(jìn)作用。圖2D為復(fù)雜有機(jī)物存在情況下實(shí)驗(yàn)體系D4中NH4+和NO3-濃度時(shí)間序列變化, 可以發(fā)現(xiàn)36 h之前NO3-濃度有緩慢的下降, 然后NO3-濃度的下降有所加速, 而NH4+濃度下降的趨勢(shì)也不明顯, 表明復(fù)雜有機(jī)物對(duì)于反硝化過程有一定的促進(jìn)效果。

3.3 中宇宙培養(yǎng)分析有機(jī)物負(fù)荷對(duì)河口原位沉積物中反硝化作用的影響

通過中宇宙培養(yǎng), 在較大體系(20L)條件下進(jìn)一步研究了有機(jī)物負(fù)荷對(duì)于反硝化和厭氧氨氧化過程的影響。在體系中添加NO3-濃度至500 μM, 建立高濃度有機(jī)物負(fù)荷(10 mg·cm-2)和低濃度有機(jī)物負(fù)荷(1 mg·cm-2)兩個(gè)培養(yǎng)體系。測(cè)定體系中時(shí)間序列的變化, 結(jié)果如圖3所示。在高濃度有機(jī)物負(fù)荷的體系中, 水體NH4+和NO2-濃度在第4天之前基本保持不變; 從第5天開始, NO2-濃度開始迅速上升, 至第11天上升幅度逐漸變緩, 在第15天達(dá)到最大值, 然后逐漸降低。而NO3-濃度從第4天開始下降, 至第15天時(shí)達(dá)到最低值。在第15天到21天期間, NO2-和NO3-濃度處于較穩(wěn)定狀態(tài), 但從第22天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束, NO2-濃度逐漸下降至低于檢測(cè)限(<1 μM), NO3-濃度則緩慢上升, 而且NO2-濃度的降低值與NO3-濃度的上升值基本相等。在低濃度有機(jī)物負(fù)荷的體系中, 培養(yǎng)前4天NH4+和NO2-濃度也基本保持不變, NO3-濃度有緩慢下降。從第5天開始, NO2-濃度開始緩慢上升, 至第11天達(dá)到最大值, 而NO3-濃度則一直處于下降趨勢(shì), 直至第11天, NO3-濃度達(dá)到最低。第11天到第20天, NO2-濃度緩慢下降至低于檢測(cè)限, NO3-濃度則緩慢上升。

圖 2 加入簡(jiǎn)單有機(jī)物、惰性有機(jī)物和復(fù)雜有機(jī)物下NH4+和NO3-濃度的動(dòng)態(tài)變化

圖 3 高(A)、低(B)濃度有機(jī)物負(fù)荷下DIN時(shí)間序列變化

實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)測(cè)定了水體溶解氧濃度()和微生物活性的變化。從圖4中可以看出, 體系中加入有機(jī)物后, 水體中有明顯的響應(yīng), 迅速降低, 且高濃度有機(jī)物負(fù)荷下的下降幅度更大。在達(dá)到一定的低值后, 體系中的趨勢(shì)又開始緩慢上升。在下降階段, 正好與較強(qiáng)的反硝化活性相對(duì)應(yīng); 當(dāng)上升后, 反硝化過程受到抑制, 但是硝化作用的進(jìn)行提供了有氧的條件, 體系中生成的NO2-又被硝化微生物氧化生成NO3-, 呈現(xiàn)出NO3-濃度的上升趨勢(shì)(圖3)。同樣, 有機(jī)物的加入, 體系中的微生物活性顯著增強(qiáng), 但隨著有機(jī)物的消耗, 微生物的活性逐漸降低, 在第15天時(shí), 達(dá)到最低。溶解氧和微生物活性的變化趨勢(shì), 與體系的反硝化活性的變化趨勢(shì)具有很好的吻合, DO與反硝化活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān), 而微生物活性與反硝化活性呈現(xiàn)正相關(guān)。

圖4 中宇宙培養(yǎng)高、低Glucose負(fù)荷下水體RDO以及微生物活性變化

4 討論

微宇宙和中宇宙模擬培養(yǎng)結(jié)果均表明, 有機(jī)物的消耗能夠顯著促進(jìn)反硝化過程。從本質(zhì)上來說, 反硝化過程是微生物以NO3-為電子受體的呼吸過程, 其能量來源于有機(jī)物的供給。有機(jī)物作為電子供體, 通過有機(jī)物的氧化, 把電子通過電子傳遞鏈傳遞給電子受體NO3-[1]。因此, 有機(jī)物的氧化與NO3-的還原是一個(gè)緊密耦聯(lián)的過程, 理論上來說反硝化過程的進(jìn)行離不開有機(jī)物的消耗[26]。我們的研究表明, 簡(jiǎn)單有機(jī)物, 如乳酸鈉、葡萄糖, 能顯著的促進(jìn)反硝化活性, 主要原因是這些簡(jiǎn)單的有機(jī)物易于被利用。而復(fù)雜有機(jī)物對(duì)反硝化過程的促進(jìn)效應(yīng)明顯減弱, 原因是復(fù)雜的有機(jī)物的可利用性較弱, 微生物首先需要把大分子的有機(jī)物分解成為小分子的有機(jī)物, 之后才能被利用。而惰性有機(jī)物基本對(duì)反硝化過程沒有促進(jìn)作用, 主要是這些有機(jī)物難于被微生物分解利用。在自然的河口環(huán)境中, 大量有機(jī)物的輸入, 大分子有機(jī)物的分解釋放出小分子有機(jī)物, 這些小分子有機(jī)物會(huì)作為有效的電子供體促進(jìn)NO2-和NO3-的還原, 表現(xiàn)出緊密的碳氮循環(huán)耦合過程[28]。大分子有機(jī)物的分解釋放出NH4+, 通過硝化過程N(yùn)H4+進(jìn)一步被氧化成NO2-和NO3-[27]。在表層沉積物中, 存在有充分的活性的有機(jī)物, 因此表現(xiàn)出活躍的反硝化過程。但是隨著沉積物深度的增加, 活性的有機(jī)物濃度逐漸變低, 有機(jī)物礦化作用減弱, 惰性有機(jī)物的濃度相對(duì)變大, 可利用的有機(jī)質(zhì)負(fù)載降低, 使得反硝化的活性也大大降低[29]。在長(zhǎng)島Great海灣, 在14—40 cm之間的有機(jī)物濃度較低的沉積物中加入有機(jī)質(zhì)葡萄糖可增加反硝化速率, 而表層有機(jī)質(zhì)含量較豐富的沉積物中加入葡萄糖卻并不影響反硝化速率[12]。

與反硝化過程的異養(yǎng)代謝類型不同[31], 厭氧氨氧化是自養(yǎng)代謝類型, 生長(zhǎng)緩慢, 主要能量來源于NH4+的氧化[32]。因此, 從對(duì)能量獲得的途徑來看, 有機(jī)物負(fù)荷對(duì)厭氧氨氧化會(huì)產(chǎn)生抑制作用[33]。但是從另一方面考慮, 在有有機(jī)物存在的條件下, 厭氧氨氧化細(xì)菌也會(huì)優(yōu)先利用有機(jī)物獲得能量來生長(zhǎng)和代謝, 會(huì)促進(jìn)厭氧氨氧化菌的生長(zhǎng), 增加厭氧氨氧化細(xì)菌的活性[18]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 隨著有機(jī)物的增加厭氧氨氧化的活性有微弱的提高, 可能是有機(jī)物與厭氧氨氧化菌的代謝活性有關(guān), 具體的機(jī)制仍然需要更深入的分析。周少奇[34]等人在對(duì)厭氧氨氧化與反硝化協(xié)同作用的研究中提出, 有機(jī)碳源存在的條件下, 厭氧氨氧化與反硝化能同步進(jìn)行并且相互促進(jìn)。厭氧氨氧化細(xì)菌不能直接利用有機(jī)物, 但二者共同存在時(shí), 反硝化細(xì)菌利用有機(jī)物產(chǎn)生CO2作為無機(jī)碳源被厭氧氨氧化細(xì)菌所利用[35]。反硝化細(xì)菌在電子供體不足的條件下將NO3-還原為NO2-, 為厭氧氨氧化細(xì)菌提供了反應(yīng)可以利用的NO2-[36]。而厭氧氨氧化細(xì)菌在反應(yīng)過程產(chǎn)生一定量的NO3-又為反硝化提供了電子受體, 二者在一定程度上相互彌補(bǔ), 共同生存[37]。

中宇宙實(shí)驗(yàn)清晰的展示了在接近自然狀況下有機(jī)物負(fù)荷對(duì)體系中的反硝化的影響。在自然條件下, 沉積物和水體是開放系統(tǒng), 而不是絕對(duì)厭氧。有機(jī)物的加入, 會(huì)顯著促進(jìn)體系中微生物的活性, 而微生物有氧分解有機(jī)物以及硝化作用的進(jìn)行會(huì)迅速消耗環(huán)境中的氧氣, 使得表層沉積物的快速降低, 為反硝化過程發(fā)生創(chuàng)造了必要的還原條件[12]。在低氧的環(huán)境條件, 反硝化微生物會(huì)利用有機(jī)物還原NO2-和NO3-, 表現(xiàn)出較強(qiáng)的反硝化活性。因此, 有機(jī)物的存在為反硝化過程的發(fā)生提供了物質(zhì)基礎(chǔ)與環(huán)境條件。

5 結(jié)論

(1)反硝化過程是依賴有機(jī)物消耗的微生物代謝過程, 有機(jī)物的種類會(huì)顯著影響沉積物的反硝化活性。添加簡(jiǎn)單有機(jī)物時(shí)微生物活性最高, 其次為復(fù)雜有機(jī)物, 而惰性有機(jī)物活性最低。有機(jī)物不但為反硝化過程提供了能量來源, 而且通過有機(jī)物的分解消耗氧氣, 為反硝化過程提供了必要的環(huán)境條件。

(2)有機(jī)物對(duì)厭氧氨氧化具有很小的促進(jìn)作用, 這與其自養(yǎng)型的代謝方式有關(guān)。

(3)由于代謝方式、生長(zhǎng)速度以及所需要的環(huán)境條件的不同, 導(dǎo)致反硝化作用和厭氧氨氧化作用對(duì)河口氮素去除的貢獻(xiàn)有顯著不同, 其中反硝化占據(jù)主導(dǎo)作用。而在有機(jī)物負(fù)荷條件下, 反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌之間存在的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系和耦合脫氮關(guān)系又使得該兩類功能類群在沉積物中得以共存, 成為沉積物氮素去除的關(guān)鍵功能類群。

[1] MULDER A, VAN DE GRAAF A A, ROBERSTON L A, et al. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1995, 16(3): 177–183.

[2] 洪義國(guó), 李猛, 顧繼東. 海洋氮循環(huán)中細(xì)菌的厭氧氨氧化[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2009, 49 (3): 281–286.

[3] VAN DE GRAAF A A, MULDER A, BRUIJN P D, et al. Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process[J]. Applied and Environmental Micro-biology, 1995, 61: 1246–1251.

[4] DALSGAARD T, CANFIELD D E, PETERSEN J, et al. N2production by the anammox reaction in the anoxic water column of Golfo Dulce, Costa Rica[J]. Nature, 2003, 422: 606–608.

[5] KUYPERS M M M, SLIEKERS A O, LAVIK G, et al. Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea[J]. Nature, 2003, 422: 608–611.

[6] THAMDRUP B, DALSGAARD T. Production of N2through anaerobic ammonium oxidation coupled to nitrate reduction in marine sediments[J]. Applied and Environ-mental Microbiology. 2002, 68: 1312–1318.

[7] HOU Lijun, ZHENG Yanling, LIU Min, et al. Anaerobic ammonium oxidation and its contribution to nitrogen removal in China's coastal wetlands[J]. Sci Rep, 2015, 5, 15621: 1–11.

[8] RICH J.J, DALE O R, SONG B, et al. Anaerobic ammonium oxidation (anammox) in Chesapeake Bay sediments[J]. Microbial Ecology, 2008, 55 (2): 311–320.

[9] DALSGAARD T, THAMDRUP B. Factors Controlling Anaerobic Ammonium Oxidation with Nitrite in Marine Sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 3802–3808.

[10] ENGSTROM P, DALSGAARD T, HULTH S, et al. Anaerobic ammonium oxidation by nitrite (anammox): Implications for N2production in coastal marine sediments[J]. Geochim Cosmochim Acta, 2005, 69: 2057–2065.

[11] ZHU Guibin, WANG Shanyun, WANG Weidong, et al. Hotspots of anaerobic ammonium oxidation at land- freshwater interfaces[J]. NATURE GEOSCIENCE, 2013, 6: 103–107.

[12] SLATER J M, CAPONE D G. Denitrification in aquifer soil and nearshore marine-sediments influenced by groundwater nitrate[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1987, 53(6): 1292–1297.

[13] KALVELAGE T, LAVIK G, LAM P, et al. Nitrogen cycling driven by organic matter export in the South Pacific oxygen minimum zone[J]. Phyllis et al Nature Geoscience, 2013, 6(3): 228–234.

[14] DALSGAARD T, THAMDRUP B, JENSEN M. M, et al. Anaerobic ammonium oxidation in the oxygen-deficient waters off northern Chile[J]. Limnology and Oceanography, 2006, 51(5): 2145–2156.

[15] WARD B B, DEVOL A H, RICH J J, et al. Denitrification as the dominant nitrogen loss process in the Arabian Sea[J]. Nature, 2009, 461(7260): 78–81.

[16] DALSGAARD T, THAMDRUP B, FARIAS L, et al. Anammox and denitrification in the oxygen minimum zone of the eastern South Pacific[J]. Limnology and Oceano-graphy, 2012, 57(5): 1331–1346.

[17] BABBIN A R, JAYAKUMAR A, WARD B B. Organic Matter Loading Modifies the Microbial Community Responsible for Nitrogen Loss in Estuarine Sediments[J]. Microbial Ecology, 2016, 71(3): 555–565.

[18] CHANG B X, RICH J R, JAYAKUMAR, et al. The effect of organic carbon on fixed nitrogen loss in the eastern tropical South Pacific and Arabian Sea oxygen deficient zones[J]. Limnology and Oceanography, 2014, 59(4): 1267–1274.

[19] GALLOWAY J N, TOWNSEND A R, ERISMAN J.W, et al. Transformation of the nitrogen cycle: recent trends, questions, and potential solutions[J]. Science, 2008, 320 (5878): 889–892.

[20] LIU Xuejin, ZhHANG Ying., HAN Wenxuan, et al. Enhanced nitrogen deposition over China[J]. Nature, 2013, 494: 459–462.

[21] CUI Shenghui, SHI Yalan, GROFFMAN P M. Centennial- scale analysis of the creation and fate of reactive nitrogen in China (1910–2010)[J]. PNAS, 2013, 110 (6): 2052– 2057.

[22] 王麗芳. 珠江口水域硝化作用與無機(jī)氮分布特征[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2007.

[23] 馬媛, 魏巍, 夏華勇, 等. 珠江口伶仃洋海域營(yíng)養(yǎng)鹽的歷史變化及影響因素研究[J]. 海洋學(xué)報(bào), 2009, 31, 69–77.

[24] 祝孟玲. 利用生物標(biāo)志物梯烷脂研究珠江口厭氧氨氧化活動(dòng)的時(shí)空分布特征[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2014.

[25] WU Jiapeng, HONG Yiguo, GUAN Fengjie, et al., A rapid and high-throughput microplate spectrophotometric method for field measurement of nitrate in seawater and fresh-water[J]. Sci Rep, 2016, 6, 20165: 1–9.

[26] MOLINUEVO B, GARCIA M C, KARAKASHEV D, et al. Anammox for ammonia removal from pig manure effluents: Effect of organic matter content on process performance[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(7): 2171–2175.

[27] BABBIN A R, WARD B B. Controls on Nitrogen Loss Processes in Chesapeake Bay Sediments[J]. Environmental Science & Technology, 2013, 47(9): 4189–4196.

[28] HARDISON A K, ALGAR C K, GIBLIN A E, et al. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitio-ning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2production[J]. Geochimica et Cosmochi-mica Acta, 2015, 164: 146– 160.

[29] DALSGAARD T, THAMDRUP B, CANFIELD D E. Anaerobic ammonium oxidation (anammox) in the marine environment[J]. Research in Microbiology, 2005, 156 (4):457–464.

[30] KNOELES R, LEAN D R S. Nitrification: a significant cause of oxygen depletion under winter ice[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1987, 44 (1): 743–749.

[31] STROUS M, KUENEN J G, FUERST J A, et al. The anammox case–A new experimental manifesto for microbiological eco-physiology[J]. Antonie Van Leeuwen-hoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 2002, 81: 693–702.

[32] LIU K K., KAPLAN I R. Denitrification rates and availa-bility of organic matter in marine[J]. Earth and Planetary Science Letters, 1984, 68: 88–100.

[33] 周少奇, 張鴻郭. 垃圾滲濾液厭氧氨氧化與反硝化的協(xié)同作用[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 36(3): 73–76.

[34] 張?jiān)姺f, 吳鵬, 宋吟玲, 等. 厭氧氨氧化與反硝化協(xié)同脫氮處理城市污水[J]. 環(huán)境科學(xué), 2015, 36(11): 4174– 4179.

[35] 賴楊嵐, 周少奇. 厭氧氨氧化與反硝化的協(xié)同作用特性研究[J]. 中國(guó)給水排水, 2010, 26(13): 6–10.

[36] 黃孝肖, 陳重軍, 張蕊, 等. 厭氧氨氧化與反硝化耦合反應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 23( 3): 849–856.

Controls of organic matters on denitrification and anammox in sediments of Pearl River Estuary by mesocosm experiments

WANG Yan1,2, WU Jiapeng1,2, GUAN Fengjie1, HE Xiang1,4, JIAO Lijing1,2, HONG Yiguo3*

1. State Key Laboratory of Tropical Oceanography, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China . Environmental Science and Engineering College, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3. Environmental Science and Engineering College,Guangzhou University, Guangzhou 510006, China 4. College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Denitrification and anaerobic ammonium oxidation (anammox) are major nitrogen sink pathways, which can effectively transform fixed nitrogen as N2or N2O into atmosphere. In this paper, the effects of species, availability and concentrations of organic matteron the denitrification and anammox of sediments from the Pearl River Estuary were analyzed by microcosm and mesocosm experiments. Experiment results showed that consumption of organic matter can significantly improve the denitrification activity. Different kinds of organic matter showed different activity, and small molecule organic matter had the highest activity, followed by complex organic matter, but refractory organic matter was difficult to be used by denitrifers. However, the promotion of anammox was not significant, which was mainly due to its autotrophic metabolism. In addition, mesocosm experiments showed that the consumption of organic matter not only provided energy for denitrification, but also provided the essential environmental conditions for the denitrification. Under thepresence of organic matter, the denitrification played a key role for the nitrogen sink in the sediments of the Pearl River estuary. In conclusion, microbial denitrification in sediments was a process depending on the consumption of organic matter, showing a strong coupling between carbon and nitrogen metabolism.

organic matter; denitrification; anammox; Pearl River Estuary

P76

A

1008-8873(2018)01-027-08

2017-03-09;

2017-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(41576123); 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2015CB452902); 廣州市科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(201504010005), 河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(SKLEC-KF201507)。

王巖 (1992—), 女, 山東德州人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物地球化學(xué)與分子生物學(xué)研究, E-mail: wangyan921026@163.com

洪義國(guó), 男, 博士, 教授, E-mail: yghong@gzhu.edu.cn

10.14108/j.cnki.1008-8873.2018.01.004

王巖, 吳佳鵬, 關(guān)鳳杰, 等. 有機(jī)物消耗對(duì)珠江口沉積物反硝化和厭氧氨氧化過程的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2018, 37(1): 27-34.

WANG Yan, WU Jiapeng, GUAN Fengjie, et al. Controls of organic matters on denitrification and anammox in sediments of Pearl River Estuary by mesocosm experiments[J]. Ecological Science, 2018, 37(1): 27-34.