馮洋

尿微量白蛋白（microalbuminuria，mALB）是指尿液中白蛋白超過正常水平、但低于常規(guī)試帶法可檢出的范圍，是評價腎功能的常見指標［1-2］。相對分子質量大于70 000的大分子溶質不能通過腎小球濾過膜，69 000的白蛋白則幾乎不能通過濾過膜，即便有通過的也在腎小管被全部重吸收；但當腎小球濾過功能受損、腎小管重吸收的能力受限時，尿液中mALB含量就會升高。因此mALB的升高對診斷早期或輕微腎損害具有重要的提示作用。mALB檢測方法較多，試劑質量也參差不齊。本研究旨在驗證Orion免疫比濁法檢測mALB的方法學性能是否滿足臨床需求。

1 材料與方法

1.1 儀器 采用OLYMPUS公司生產的AU640型全自動生化分析儀。

1.2 試劑、校準品、質控品 Orion附帶校準品的微量白蛋白測定試劑盒，批號為1687202和1767794；質控品由上海市臨床檢驗中心提供，批號分別為高值M1303和低值M1301。

1.3 標本來源 采集本院就診患者或正常體檢者的新鮮尿液；生理鹽水為市售醫(yī)用品。

1.4 驗證實驗方法

1.4.1 精密度驗證實驗 參考國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布的行業(yè)標準（WS/T）492-2016文件《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》進行精密度驗證［3］。選擇2個不同濃度的質控品，每天分析1批，連續(xù)測定5 d，每批分高、低2個濃度水平，每個濃度水平同一樣品重復測定3次；如果出現(xiàn)失控，則應刪除數據并重新測定。將以上檢測結果根據公式進行統(tǒng)計分析，分別計算批內變異系數（CV批內）、批間變異系數（CV批間）、批內標準差（S批內）和批間標準差（S批間）。

1.4.2 正確度驗證實驗 參考WS/T 492-2016文件進行正確度驗證。選擇2個與定標校正品不同批號的原廠校正品，每天重復測定2次，連續(xù)測定5 d，計算均值、標準差以及置信區(qū)間，以驗證指定值。

1.4.3 線性范圍驗證實驗

1.4.3.1 參照美國臨床和實驗室標準（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP6-A2 文件［4］，挑選新鮮高值和低值臨床尿液樣本各1份，挑選的高值樣本白蛋白含量應與試劑盒標稱線性范圍上限盡可能相符。按照10L、2H+8L、4H+6L、6H+4L、8H+2L、10H將高值和低值樣本配制為6個濃度，用OLYMPUS AU640型全自動生化分析儀對6個濃度的尿液樣本進行分析，每個濃度在同一批次重復測定2次。

1.4.3.2 對檢測結果進行統(tǒng)計，計算每個濃度2次測定的均值。將橫坐標定義為理論值，縱坐標定義為實測值的均值，繪制散點圖。觀察實驗所得到的數據，看是否存在較明顯的非線性或離群點，如存在，應查找原因。若有明確原因，糾正后修正數據；若無明顯原因，則應重新檢測全部數據。

1.4.3.3 根據公式計算SDr。

式中，L代表樣本數，ri1與ri2代表兩次測定的實際結果。

1.4.3.4 將SDr與設定的不精密度目標進行比較，本次試驗以美國疾病控制與預防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）和美國醫(yī)療保險和醫(yī)療補助服務中心（Centers for Medicare and Medicaid Services，CMS）發(fā)表的臨床實驗室修正法規(guī)1988（CLIA'88）中規(guī)定的允許誤差的1/4為不精密度目標。如果SDr大于設定目標，則可能是不精密度欠佳，不能可靠地評價線性關系。此時應檢查生化儀或操作流程，找到引起不精密度欠佳的原因，

糾正后重新進行實驗。如果方法性能與以前評估重復性時一致，重復測量次數增多1倍（4次），這樣可以將均值的標準差降低約40%。

1.4.3.5 進行回歸分析，計算一階、二階、三階回歸方程及回歸標準誤。利用t檢驗對二階（b2）、三階（b2、b3）回歸系數進行檢驗，如果3個回歸系數與0比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），則可認定其為一級線性，若有統(tǒng)計學意義則判斷為非線性。若為非線性，則應比較各標準誤大小，選擇標準誤最小者為最適多項式，并分析最適多項式在各個濃度上的線性偏差（deviation from linearity，DL）。

1.4.4 參考區(qū)間驗證實驗 參考CLSI C28-A2文件［5］，抽取20例健康體檢合格者作為甲組，其測定值如果有18例及以上在設定的參考值范圍內，即95%以上，則設定的參考區(qū)間便可以接受；如果低于95%，則需重新抽取另外20例健康體檢合格者作為乙組再次檢測。若乙組的測定結果95%以上在所設定的參考范圍內，則仍然可以認為驗證有效；若乙組有超過2例在參考區(qū)間以外，則應首先判斷檢測程序、檢測系統(tǒng)性能是否可靠，然后再分析人群生物特性是否可能對該項目的參考區(qū)間驗證產生影響，重新選定合適的生物參考區(qū)間，必要時可自建生物參考區(qū)間。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件和Excel 2003對檢測數據進行處理。

2 結果

2.1 精密度驗證結果 共檢測10個標本。高濃度水平、低濃度水平質控品的CV批內分別為0.7%和1.0%，CV批間分別為1.5%和1.8%。CLIA'88允許誤差為10%，CV批內均小于CLIA'88允許誤差的1/4；CV批間均小于CLIA'88允許誤差的1/3。

2.2 正確度驗證結果 共檢測10個標本。高濃度水平校正品靶值為87 mg/L，均值為86.8 mg/L，標準差為0.34 mg/L，上置信限為87.1 mg/L，下置信限為86.4 mg/L，置信區(qū)間包括靶值；低濃度水平校正品靶值為24 mg/L，均值為23.9 mg/L，標準差為0.29 mg/L，上置信限為24.2 mg/L，下置信限為23.6 mg/L，置信區(qū)間包括靶值。因此可以證實正確度。

2.3 線性范圍驗證結果 共檢測12個標本。實驗未發(fā)現(xiàn)明顯的非線性和離群值，SDr小于不精密度目標。對二階（b2）、三階（b2、b3）回歸系數的 t檢驗結果顯示，回歸系數與0比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），判斷為一次方程呈線性。其線性范圍評價 r＝0.999 5，r2＝0.998 9，預期值與實測值之間的相關性良好?；貧w方程為y＝1.001 6x＋2.142，說明書的線性范圍為6～150 mg/L，驗證線性范圍為6.45～151.40 mg/L。

2.4 參考區(qū)間驗證結果 20例實驗對象的結果均在現(xiàn)行參考區(qū)間內，因此可判定現(xiàn)行參考區(qū)間有效?，F(xiàn)行參考區(qū)間為0～20 mg/L，驗證參考區(qū)間為7.8～11.7 mg/L。

3 討論

白蛋白的相對分子質量為69 000，帶負電荷，是腎小球在發(fā)揮其濾過作用時所能允許通過的最大相對分子質量的蛋白質之一，主要由肝臟分泌，經腎小球濾過的白蛋白在近曲小管基本全部被主動重吸收，重吸收后的尿液中只存有很少的白蛋白，通常在隨機尿樣本中的含量＜20 mg/L。如果腎小球基底膜發(fā)生病變，通過腎小球的白蛋白大量增加，使得腎小管無法全部重吸收時，尿中的白蛋白將會增加［6］。mALB對于早期診斷具有重要意義，研究表明，mALB既是評估高血壓性腎病［7］和糖尿病性腎?。?］的早期敏感指標，還已被證實是心血管系統(tǒng)疾病的重要危險因子［9-10］，同時mALB也是血管內皮細胞功能受損的標志，能夠預測大血管病變［11］。另外，mALB對于監(jiān)控腎移植術后感染［12］及重癥過敏性紫癜的治療［13］也有一定的意義。

當隨機尿樣本中白蛋白濃度為20～150 mg/L時，由于低于尿常規(guī)試帶法的可檢出范圍，常常導致其無法檢出，因此需要使用其他方法對mALB進行檢測。mALB的檢測方法較多，如放射免疫法、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫比濁法等。目前放射免疫法被認為是檢測mALB的金標準，這種方法應用最早，靈敏度和準確性較好［14］，但缺點是使用的儀器較貴，且存在放射性污染的問題，在臨床應用上具有局限性?；瘜W發(fā)光法是近年新興的方法，這種方法的靈敏度和準確性也較好，但缺點是成本較高。ELISA法雖然成本較低，但操作繁瑣，影響因素較多，結果的可靠性較差。免疫比濁法是mALB測定的常用方法，其理論基礎是抗原、抗體在特殊緩沖液中能迅速形成抗原-抗體復合物，成為均勻分散于反應體系中的顆粒，這些顆粒具有光學特性，可使反應體系在濁度儀下出現(xiàn)度數，如果在反應體系中加入過量的抗體，隨抗原量增加形成的復合物也會增加，反應體系的濁度亦隨之增加［15］。免疫比濁法根據濁度儀檢測的反應體系是透射光還是散射光而分為免疫透射濁度法和散射濁度法。其中免疫透射濁度法測定透射光，依據的是朗伯-比爾定律；而免疫散射濁度法測定散射光，依據的是雷萊定律。免疫透射比濁法具有儀器構造簡單、檢測迅速、結果可靠、易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點，可整合在生化分析儀上，目前國內外生產廠商生產的生化分析儀都有免疫透射比濁功能，方法易于普及［16］；而免疫散射比濁法需要特殊的免疫散射比濁儀，很難整合在全自動生化分析儀上，目前國內臨床檢驗工作中主要在既時檢驗（point of care testing，POCT）中使用。

Orion mALB檢測試劑盒是利用免疫透射比濁法檢測mALB。本資料經過對Orion mALB檢測試劑盒性能的驗證發(fā)現(xiàn)，該試劑盒的正確度高，精密度好，線性范圍符合說明書要求，參考區(qū)間有效。該試劑盒在OLYMPUS AU640全自動生化分析儀上能滿足臨床檢驗的要求。

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