王晨 付紅偉 楊桂芳

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）是一種單鏈無包膜的小RNA病毒，在我國衛(wèi)生環(huán)境較差地區(qū)是急性病毒性肝炎的最主要致病因素［1］。隨著對戊型肝炎（戊肝）研究的不斷深入，戊肝是人畜共患病的事實(shí)已為科研工作者所公認(rèn)，然而相關(guān)報(bào)道顯示，不同基因型HEV病毒株存在著明顯的宿主選擇性及致病性強(qiáng)弱的差異［2］。即基因3型和4型HEV病毒株既能感染人又能感染豬、兔、鼠等哺乳類動(dòng)物，而基因1型和2型HEV病毒株卻僅能感染人和非人靈長類動(dòng)物，不能跨物種傳播［3］。據(jù)其致病性強(qiáng)弱特點(diǎn)分析，基因1型和2型的致病性較基因3型和4型強(qiáng)［4］。在近年來對HEV衣殼蛋白的晶體結(jié)構(gòu)、其所編碼蛋白的功能分析、病毒組裝與進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程致病性影響因素的研究取得諸多進(jìn)展的基礎(chǔ)上，本研究通過對現(xiàn)有已知HEV全基因組序列的比對分析，尋找影響兩大類HEV病毒株間宿主選擇性及致病性差異的可疑基因突變決定子。

1 資料與方法

從DNA序列GenBank數(shù)據(jù)庫獲取87株背景較為資料清楚的HEV病毒株核苷酸序列，包含基因1～4型人源類或人畜共患類HEV病毒株，見表1。鑒于兔HEV尚不確定是否能夠跨物種傳播，因此未納入本次研究分析。

上述87株HEV病毒株分為兩大類，一類為僅感染人的人源病毒類（human，H類），包含基因1型和2型HEV病毒株；另一類為廣泛分離自人、豬、鹿等多種哺乳類動(dòng)物，且可跨物種感染人的人畜共患類（zoonosis，Z類），包含基因3型和4型HEV病毒株。Z類HEV病毒株可引起急性散發(fā)性戊肝，已被廣泛認(rèn)為是一種人畜共患病的病原體［5］。

利用AlingX軟件（Vector NTI軟件包）對上述兩類HEV核苷酸或編碼氨基酸進(jìn)行序列比對分析，尋找兩類HEV病毒株間特異性的基因突變位點(diǎn)，并結(jié)合HEV病毒株基因組和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能特點(diǎn)進(jìn)行綜合分析，尋找可能影響不同基因型HEV的宿主選擇性及致病性強(qiáng)弱的位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 5'UTR區(qū)的分析 5'UTR區(qū)長度為26 nt左右，相對較為保守。兩類HEV病毒株間在此區(qū)域內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)G11A/C（位點(diǎn)參照GU11961）一個(gè)特異的核苷酸突變位點(diǎn)，即Z類HEV基因組中第11核苷酸位點(diǎn)均為G，而H類HEV基因組中該位點(diǎn)核苷酸為A或C。見圖1。

圖1 不同基因型HEV病毒株5'UTR區(qū)基因序列比對分析

2.2 ORF1區(qū)的分析 在ORF1區(qū)，Z類HEV病毒株編碼1705-1707位氨基酸（aa），H類HEV病毒株編碼1692-1693位氨基酸（aa）。兩類病毒株編碼氨基酸片段的長短不同主要是由其高變區(qū)（711-798aa）的長度不同引起的。在ORF1區(qū)域內(nèi)共發(fā)現(xiàn)16個(gè)氨基酸置換位點(diǎn)，其中應(yīng)關(guān)注的是位于高變區(qū)5'端的9個(gè)連續(xù)氨基酸位點(diǎn)的置換，其在Z類HEV病毒株中均為 SGFSSD/CFSP（708-716aa），而在 H 類HEV病毒株中相應(yīng)的位點(diǎn)則分別為VDAVS（基因1型）或ITDTP（基因2型）。見表2。

2.3 ORF2區(qū)的分析 基因4型HEV病毒株的ORF2區(qū)編碼約674個(gè)氨基酸，較基因1～3型多編碼約14個(gè)氨基酸。ORF2區(qū)較ORF1區(qū)更為保守，有7個(gè)氨基酸置換位點(diǎn)在ORF2區(qū)域內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，見表3。

2.4 ORF3區(qū)的分析 基因4型HEV病毒株的ORF3區(qū)編碼約114個(gè)氨基酸，較基因1～3型少編碼約9個(gè)氨基酸。在ORF3區(qū)域內(nèi)，僅發(fā)現(xiàn)E78D一個(gè)特異的氨基酸位點(diǎn)突變。

2.5 3'UTR區(qū)的分析 去除poly（A）尾后，3'UTR區(qū)由65～72個(gè)核苷酸組成，該區(qū)域有諸多核苷酸缺失或插入，變異性較大。在3'UTR區(qū)，所有Z類病毒株在poly（A）尾前較H類病毒株多一個(gè)核苷酸G。

表1 87株已知全基因組序列的HEV病毒株的分類和基因分型

表2 ORF1區(qū)H類和Z類HEV病毒株16個(gè)氨基酸位點(diǎn)置換情況

表3 ORF2區(qū)H類和Z類HEV病毒株7個(gè)氨基酸位點(diǎn)置換情況

3 討論

本研究利用ALIGN軟件比對分析87株基因1～4型HEV病毒株的基因組序列或氨基酸序列，以尋找影響H類和Z類HEV病毒株宿主選擇性差異的突變位點(diǎn)。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)26個(gè)特異的突變位點(diǎn)可能參與HEV宿主選擇，其中在5'UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了G11A/C突變位點(diǎn)。先前報(bào)道顯示，5'UTR區(qū)和ORF1區(qū)5'端58個(gè)核苷酸一起組成了保守的二級結(jié)構(gòu)（頸環(huán)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)），該二級結(jié)構(gòu)可通過與ORF2編碼蛋白的結(jié)合，在HEV病毒衣殼的組裝過程中發(fā)揮重要作用［6］。本研究發(fā)現(xiàn)的G11A/C突變位點(diǎn)可能會(huì)影響到其HEV基因組5'端的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而可能影響到病毒衣殼的組裝，并由此影響到宿主選擇性的不同。另外，通過與甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）核苷酸序列的類比可以發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，即HAV 5'UTR區(qū)的基因位點(diǎn)突變與甲型肝炎疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［7］。而本研究中發(fā)現(xiàn)的5'UTR區(qū)的G11A/C突變位點(diǎn)是否影響到兩類HEV病毒株間的致病性差異亦值得進(jìn)一步分析研究。

HEV病毒株的ORF1區(qū)編碼了一個(gè)包含多個(gè)功能區(qū)的非結(jié)構(gòu)蛋白，如甲基轉(zhuǎn)移酶、木瓜樣蛋 白 酶（apain-like protease，PLP）、RNA 解 旋 酶（RNA helicase）和RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）等［8］。 本 研 究在ORF1區(qū)共發(fā)現(xiàn)16個(gè)氨基酸置換位點(diǎn)。這些氨基酸位點(diǎn)的突變可能會(huì)引起蛋白質(zhì)功能的改變，而各個(gè)位點(diǎn)的突變對病毒株究竟會(huì)引起什么樣的改變則取決于它們所在功能區(qū)的具體功能。例如甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)核苷酸編碼的蛋白與甲基帽結(jié)構(gòu)（m7GpppX）的形成有關(guān)，具體負(fù)責(zé)將m7GTP添加到 mRNA 的 5'端［9］，而本研究發(fā)現(xiàn)的 R40H、L62F和A83F位于甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)，可能會(huì)導(dǎo)致兩類病毒株添加甲基化帽的能力強(qiáng)弱有所不同，而甲基化帽結(jié)構(gòu)又是HEV傳染力的必要基礎(chǔ)［10］，從而可以推測發(fā)生在甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)三個(gè)突變可能通過影響甲基化帽的形成對HEV病毒株傳染力產(chǎn)生作用。HEV基因組在ORF1區(qū)存在一個(gè)高變區(qū)，既往研究結(jié)果提示，將部分或整個(gè)ORF1區(qū)內(nèi)高變區(qū)完全刪除的HEV誘導(dǎo)突變株毒力會(huì)減弱［11］。本研究在此高變區(qū)5'端發(fā)現(xiàn)，708-716位點(diǎn)處Z類病毒株氨基酸均為SGFSSD/CFSP，而在H類病毒株為VDAVS（基因1型）或ITDTP（基因2型），這是發(fā)生在高變區(qū)的連續(xù)9個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，有必要建立刪除9個(gè)氨基酸位點(diǎn)的HEV突變株，以進(jìn)一步證實(shí)這9個(gè)連續(xù)氨基酸位點(diǎn)置換對HEV病毒株毒力強(qiáng)弱的影響。此外，在ORF1區(qū)發(fā)現(xiàn)的16個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)中，有8個(gè)坐落在RdRp區(qū)，而RdRp區(qū)在單股正鏈RNA病毒間是十分保守的區(qū)域，常被作為遺傳進(jìn)化標(biāo)志。因此，如此高頻率的特異性氨基酸突變發(fā)生在RdRp區(qū)，可以間接提示，Z類和H類HEV病毒株可能是各自相對獨(dú)立進(jìn)化而來的。

HEV病毒株ORF2區(qū)編碼病毒衣殼蛋白，HEV衣殼負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞結(jié)合從而引發(fā)感染過程［12-13］。Li等［14］報(bào)道了 HEV 衣殼蛋白 E2s區(qū)域（氨基酸455-602）的三維晶體結(jié)構(gòu)，并對其功能進(jìn)行了研究，該報(bào)道顯示，HEV中和抗體的識別位點(diǎn)也在E2s區(qū)域，且E2s蛋白是與宿主細(xì)胞相互作用的基礎(chǔ)。本研究在ORF2區(qū)發(fā)現(xiàn)了7個(gè)特異的氨基酸置換位點(diǎn)，其中有4個(gè)（T497S、M506V、T511S和G613A）位于E2s區(qū)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，T511S核苷酸位點(diǎn)突變與郭清順等［15］研究報(bào)道的ORF2蛋白第511位點(diǎn)的差異會(huì)影響基因1型和基因4型HEV病毒株的宿主選擇的觀點(diǎn)是一致的。鑒于以上分析，很有必要通過基因位點(diǎn)敲除突變或重組定點(diǎn)突變的方式，進(jìn)一步研究證實(shí)這4個(gè)發(fā)生在E2s區(qū)的突變是否真正影響了H類和Z類HEV病毒株間的宿主選擇差異。

HEV病毒株ORF3區(qū)含編碼114（基因4型）或編碼123（基因1～3型）氨基酸的蛋白（pORF3），pORF3通過激活細(xì)胞信號通路（ERK通路），能發(fā)揮延長內(nèi)膜信號進(jìn)而減弱宿主細(xì)胞的凋亡途徑等作用，促進(jìn)宿主細(xì)胞存活；同時(shí)也可減少急性時(shí)相反應(yīng)蛋白的表達(dá)和提高α1-微球蛋白的分泌，降低宿主對HEV病毒株的天然免疫反應(yīng)，在HEV病毒株侵入宿主的致病過程中發(fā)揮了重要影響作用［16］。本研究在此區(qū)域僅發(fā)現(xiàn)E78D這一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的置換，該突變是否能夠通過影響pORF3而觸發(fā)強(qiáng)弱不同的細(xì)胞信號通路反應(yīng)或改變宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)狀態(tài)，最終影響兩類HEV病毒株間的致病性差異，值得我們進(jìn)一步研究。

HEV病毒株3'UTR區(qū)是高突變區(qū)，Agrawal等［17］報(bào)道顯示，3'UTR與和它相鄰的ORF2的3'末端共同組成二級結(jié)構(gòu)（頸環(huán)狀），該二級結(jié)構(gòu)既負(fù)責(zé)與HEV RdRp酶結(jié)合，也參與宿主蛋白的反應(yīng)。鑒于此報(bào)道結(jié)果，3'UTR區(qū)可能會(huì)參與HEV病毒株與宿主細(xì)胞的結(jié)合過程。然而Graff等［18］報(bào)道結(jié)果卻顯示，將來源于豬HEV病毒株的3'UTR區(qū)重組到基因1型人源HEV病毒株形成新的突變鑲嵌病毒體，依然不能使該人源HEV鑲嵌病毒體成功感染豬。該報(bào)道結(jié)果說明，HEV的3'UTR區(qū)對HEV病毒株的宿主選擇起不到?jīng)Q定性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Z類HEV病毒株的3'UTR區(qū)較H類病毒株多一個(gè)核苷酸G，據(jù)前期研究報(bào)道來看，該突變對HEV宿主選擇所發(fā)揮的影響作用可能較為有限，不能作為未來研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了26個(gè)基因突變位點(diǎn)可能參與影響Z類和H類病毒株的宿主選擇，由于目前對HEV進(jìn)入宿主細(xì)胞機(jī)制的研究報(bào)道甚少，因此很難確定究竟是哪幾個(gè)基因位點(diǎn)的置換對HEV的宿主選擇及致病性差異起到了決定性作用。但是本研究為確定兩類病毒株間宿主選擇及致病性差異提供了重要的線索，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究方案的設(shè)計(jì)。

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