韓宛君，張鴻超，耿浩，程建軍，侯俊財(cái)

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；3.齊齊哈爾食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江齊齊哈爾161000）

0　引言

乳清作為干酪生產(chǎn)的重要副產(chǎn)物[1]，其蛋白質(zhì)主要為-乳球蛋白和-乳白蛋白[2]。WPC（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥34%）[3]和W PI（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%）[4]為乳清產(chǎn)品，因其較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好功能特性廣泛應(yīng)用于食品中[5-6]。菜自建等[7]證明WPC能減緩酸奶分層和乳清析出。Puvanenthiran等[8]發(fā)現(xiàn)添加乳清蛋白的酸奶的凝膠變得致密。乳清蛋白具有提高膠原蛋白和提高乳清蛋白功能特性，熱聚合乳清蛋白具有更好的熱穩(wěn)定性[11]。但加熱時(shí)間對(duì)熱聚合乳清濃縮蛋白（PWPC）和熱聚合乳清分離蛋白（PWPI）的游離巰基含量、乳化性、乳化穩(wěn)定性等的影響鮮有報(bào)道。因此，本文研究了加熱時(shí)間對(duì)PWPC與PWPI游離巰基含量、黏度、乳化性等性質(zhì)的影響，旨在為乳清蛋白的應(yīng)用提供參考依據(jù)。骨破壞力的功能[9]。物理改性、化學(xué)改性等方法[10]可

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　原料與試劑

乳清濃縮蛋白（WPC，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥80%），乳清分離蛋白（W PI，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥92%），其余化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

1.2　儀器與設(shè)備

恒溫磁力攪拌器，TU-1800紫外-可見光分光光度計(jì)，F(xiàn)-4500熒光分光光度計(jì)，IKA-T 18型均質(zhì)機(jī)，JEM-1200EX透射電子顯微鏡，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，DYCZ-23A型電泳槽，Zeta電位分析儀，Brook field DVⅡ數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)。

1.3　方法

1.3.1熱聚合乳清蛋白的制備

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的WPC和W PI溶液，在磁力攪拌器上攪拌30 min，在4℃環(huán)境下靜置8 h，充分水合后分別將調(diào)節(jié)pH=7（濃度為1 m ol/L的N aOH），然后在85℃下分別處理15，30，45，60min和90min，并迅速將溫度降溫至室溫，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2游離巰基的測(cè)定

游離巰基的測(cè)定參照并改進(jìn)Beveridge等[12]方法。取樣品0.3 mL加入到含有5 mL濃度為8 mol/L的尿素T ris-G ly緩沖溶液（濃度0.086m ol/L的T ris溶液，0.09 m o l/L甘氨酸，0.004 m o l/L乙二胺四乙酸，pH=8.0和濃度8 m o l/L尿素），加入20μL的DTNB試劑后震蕩混勻，在室溫下靜置15 min顯色，利用紫外分光光度計(jì)在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，用空白對(duì)照組進(jìn)行調(diào)零。

游離巰基含量（μm o l/g）=(73.53×A412×D)/C，

式中：A412為樣品在波長(zhǎng)為412 nm下的吸光值；C為固形物質(zhì)量濃度（g/L）；D為稀釋系數(shù)。

1.3.3Zeta-電位的測(cè)定

Zeta-電位參照O’Brien等[13]

的方法，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的磷酸鹽緩沖液（濃度為0.1 m o l/L，pH=7.0）稀釋樣品，利用Zeta電位分析儀測(cè)量其蛋白質(zhì)表面電位。

1.3.4黏度的測(cè)定

黏度的測(cè)定參照Liu等[14]的方法。利用Brookfield旋轉(zhuǎn)黏度儀測(cè)定樣品的黏度。轉(zhuǎn)子型號(hào)為s62，溫度為(25±0.1)℃，轉(zhuǎn)速為 30 r/min，總測(cè)量時(shí)間為1min，每隔5 s取一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，最終的黏度值為測(cè)定的平均值。

1.3.5內(nèi)源色氨酸熒光光譜

內(nèi)源色氨酸的測(cè)定參考并改進(jìn)Tang等[15]的方法。使用5 mmol/L磷酸緩沖液（pH=7.0）分別稀釋天然和熱處理蛋白溶液質(zhì)量濃度至0.05 g/L。采用F-7000熒光分光光度計(jì)記錄樣品的熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為280～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，電壓為700m V。

1.3.6乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定采用Pearce等[16]的方法。取1 m g/mL的樣品稀釋液3 mL，將其與1 mL大豆油混合，在10 000 r/min的速度下均質(zhì)1 min，靜置10min后取靜置0min和10min時(shí)的試管底部的乳化液各50μL，加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液中，正當(dāng)混勻后利用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)500 nm下測(cè)量其吸光值。乳化性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）計(jì)算公式為

式中：A500nm為波長(zhǎng)500 nm處的吸光值；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（g/mL）；φ為油相所占體積分?jǐn)?shù)（φ=1/4）；A10為靜置10 min時(shí)乳狀液的吸光值；A0為靜置0 min時(shí)乳狀液的吸光值；n為稀釋倍數(shù)為100。

1.4　統(tǒng)計(jì)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 19.0和Statistix 8.0軟件分析數(shù)據(jù)，多重比較采用Duncan方法，P＜0.05表示差異顯著，采用Sigm a Plot 9.0和Excel軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC與W PI游離巰基含量的影響

不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC與W PI的游離巰基含量的影響由圖1所示。由圖1可以看出，PWPC的游離巰基含量顯著低于未處理WPC的游離巰基含量（30.82μm ol/g±3.15μm ol/g）（P＜0.05）；PWPI的游離巰基含量顯著低于未處理W PI的游離巰基含量（55.81μm ol/g±2.14μm ol/g）（P＜0.05）；PWPC和PWPI的游離巰基含量隨熱處理時(shí)間的增加呈先下降后上升的趨勢(shì)；在熱處理時(shí)間低于30 min時(shí)，PWPC和PWPI的游離巰基含量呈下降趨勢(shì)，在熱處理時(shí)間大于30 min時(shí)，PWPC和PWPI的游離巰基含量呈上升趨勢(shì)；在整個(gè)熱處理時(shí)間范圍內(nèi)（0～90 min），PWPI的游離巰基含量顯著高于PWPC（P＜0.05）；PWPC和PWPI的游離巰基含量均在熱處理時(shí)間為30min時(shí)達(dá)到最低值。

圖1　不同熱處理對(duì)WPC和WPI游離巰基含量的影響

2.2　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC和W PI的Zeta-電位的影響

不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC與W PI的Zeta-電位的影響如圖2所示。由圖2可以看出，PWPC和PWPI的Zeta-電位隨著熱處理時(shí)間的增加呈先下降后上升的趨勢(shì)；在熱處理時(shí)間低于30 min時(shí)，PWPC和PWPI的Zeta-電位呈下降趨勢(shì)，在熱處理時(shí)間高于30 min時(shí)，PWPC和PWPI的Zeta-電位呈上升趨勢(shì)；在熱處理時(shí)間范圍內(nèi)，PWPI的Zeta-電位始終低于PWPC；且PWPC和PWPI的Zeta-電位值均在熱處理時(shí)間為30min時(shí)達(dá)到最低值。

2.3　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC和W PI黏度的影響

不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC與W PI的黏度的影響如圖3所示。由圖3可以看出，PWPC和PWPI的黏度隨著熱處理時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PWPC的黏度值由最初15 min的（33.43±1.62）m Pa·s上升至90 min的（81.47±1.53）m Pa·s，PWPI的黏度值由最初15 min的（52.47±7.70）m Pa·s上升至90min的（90.27±2.07）m Pa·s；在整個(gè)過程中，PWPI的黏度值始終高于PWPC的黏度值。

圖2　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC和WPI的Zeta-電位的影響

圖3　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC和WPI黏度的影響

2.4　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC和W PI內(nèi)源色氨酸熒光光譜的影響

不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC與W PI的內(nèi)源色氨酸熒光光譜的影響如圖4所示。由圖4可以看出，未處理WPC和W PI的熒光峰在298.6 nm，經(jīng)過不同的熱處理時(shí)間后，PWPC和PWPI的最大發(fā)射波長(zhǎng)與未處理WPC和W PI相比，沒有變化，一直保持在298.6 nm，但是熱聚合產(chǎn)物PWPC和PWPI的熒光強(qiáng)度與未處理WPC和W PI的熒光強(qiáng)度相比均有增加；PWPC的最大發(fā)射波長(zhǎng)與PWPI之間不存在差異，二者的熒光峰均出現(xiàn)在298.6 nm處；PWPC和PWPI的熒光強(qiáng)度隨熱處理時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，PWPC和PWPI的熒光值在熱處理時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大值。

2.5　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC和W PI乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC的乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖5所示。由圖5可以看出，在乳化活性方面，PWPC的乳化活性顯著低于未處理的WPC（P＜0.05），在熱處理時(shí)間低于30 min時(shí)，PWPC的乳化活性隨時(shí)間的增加而增加，在熱處理時(shí)間大于30 min時(shí)，PWPC的乳化活性隨時(shí)間的增加而降低；在乳化穩(wěn)定性方面，PWPC的乳化穩(wěn)定性大于未處理WPC的乳化穩(wěn)定性；而PWPC的乳化穩(wěn)定性隨著熱處理時(shí)間的增加呈先上升后降低的趨勢(shì)，在熱處理時(shí)間為30min時(shí)達(dá)到最大值。

不同熱處理時(shí)間對(duì)W PI的乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖6所示。由圖6可以看出，在乳化活性方面，PWPI的乳化活性顯著低于未處理的W PI（P＜0.05）；PWPI的乳化活性隨熱處理時(shí)間的增加呈先上升后降低的趨勢(shì)，PWPI的乳化活性在熱處理時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大值；在乳化穩(wěn)定性方面，PWPI的乳化活性顯著高于未處理的WPI（P＜0.05），PWPI的乳化穩(wěn)定性隨著熱處理時(shí)間的增加呈先上升后降低的趨勢(shì)，PWPC的乳化性在熱處理時(shí)間為30min時(shí)達(dá)到最大值。

圖4　不同熱處理對(duì)WPC和WPI內(nèi)源熒光色氨酸光譜的影響

圖5　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPC的乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

圖6　不同熱處理時(shí)間對(duì)WPI的乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

3　討論

乳清蛋白熱變性過程是低聚物發(fā)生聚集形成多化合物從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解性降低[18]，乳球蛋白要經(jīng)歷蛋白的展開和凝集[19]。影響乳清蛋白熱聚合的主要因素有熱處理時(shí)間、蛋白質(zhì)濃度和pH值等[11]。

本研究中，未處理WPC和W PI的游離巰基含量高于85℃熱聚合PWPC和PWPI的游離巰基含量，這主要是由于β-乳球蛋白在溫度升高至75℃以上時(shí)開始變性，隨著加熱溫度的繼續(xù)升高，部分α-乳白蛋白也開始發(fā)生變性，它能夠與β-乳球蛋白相互作用[20]。變性可以促使β-乳球蛋白內(nèi)的游離巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵，進(jìn)而發(fā)生聚合反應(yīng)，最終使得β-乳球蛋白聚集生成大分子聚合物[21]。加熱可以使得展開的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白將帶二硫鍵的氨基酸片段和非極性端也暴露于水相中，這些活性氨基酸的暴露促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間的疏水作用和二硫鍵作用，導(dǎo)致聚合[22]。吳丹陽等[23]報(bào)道隨熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，乳清蛋白的變異程度及乳清蛋白-酪蛋白結(jié)合程度出現(xiàn)明顯增大，游離巰基含量增加，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其報(bào)道一致。在整個(gè)熱處理時(shí)間范圍內(nèi)（0～90 min），PWPI的游離巰基含量高于PWPC的，說明熱處理時(shí)間會(huì)對(duì)聚合物中游離巰基的含量產(chǎn)生影響。

張鐵華等[24]通過研究發(fā)現(xiàn)，熱處理乳清蛋白的Zeta-電位低于未處理的乳清蛋白，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。在加熱時(shí)間大于30 min時(shí)，PWPC和PWPI的Zeta-電位隨加熱時(shí)間的增加而增加，與Jean等[25]的研究結(jié)果一致；在加熱時(shí)間小于30 min時(shí)，PWPC和PWPI的Zeta-電位隨加熱時(shí)間的增加而減小，這可能是由于加熱時(shí)間過短未能引起乳清蛋白Zeta-電位的變化。本研究還發(fā)現(xiàn)相同條件下PWPI的Zeta-電位顯著低于PWPC（P＜0.05），這種結(jié)果可能與蛋白質(zhì)的聚合程度以及方式有關(guān)。

本研究中，PWPC和PWPI的黏度隨著熱處理時(shí)間的增加而增加，這可能是由于在加熱促使蛋白質(zhì)分子鏈發(fā)生熱運(yùn)動(dòng)，使得分子鏈內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸顯露出來，疏水性基團(tuán)通過疏水鍵和二硫鍵作用，發(fā)生聚集，增加了蛋白質(zhì)的黏度。在整個(gè)熱處理時(shí)間范圍內(nèi)（0～90 min），PWPC的黏度高于PWPI，可能是由于W PI中含有的β-乳球蛋白高于WPC中的β-乳球蛋白的含量，在相同條件下，W PI的變性程度大于WPC。

內(nèi)源色氨酸熒光光譜可以間接反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明，未處理WPC和W PI與PWPC和PWPI相比，二者在最大發(fā)射波長(zhǎng)上沒有差別，而在熒光強(qiáng)度上前者要弱于后者，這可能是由于后者經(jīng)過熱處理后色氨酸被暴露出來。PWPC和PWPI的熒光值在熱處理時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大值。

用來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)乳化性能的指標(biāo)主要包括常用乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI），其中EAI代表了蛋白質(zhì)吸附在脂肪球表面的能力[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，WPC和W PI經(jīng)熱誘導(dǎo)后生成聚合乳清蛋白的乳化穩(wěn)定性顯著升高，與先前報(bào)道結(jié)果一致[27]。劉翠平等[28]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的變性溫度為75℃～90℃，在此溫度區(qū)間內(nèi)乳清蛋白熱穩(wěn)定性會(huì)隨熱處理時(shí)間的逐漸增加而減弱。本試驗(yàn)的熱處理溫度為85℃，在30min前PWPC和PWPI的乳化性和乳化穩(wěn)定性隨熱處理時(shí)間的增加而增加，與劉翠平的試驗(yàn)結(jié)果一致。但在30 min后乳清蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定隨熱處理時(shí)間的增加而減小，這可能是由于加熱時(shí)間過長(zhǎng)破壞了乳清蛋白的結(jié)構(gòu)。相同條件下PWPI的乳化性和乳化穩(wěn)定性顯著高于PWPC（P＜0.05），這可能是由于在未處理?xiàng)l件下，乳清蛋白具有良好的乳化性，熱處理會(huì)導(dǎo)致乳清蛋白變性及溶解度降低，通過控制熱處理的條件可以提高乳清蛋白的乳化性能。

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