晉家正， 李午佼， 牟必琴， 沈詠梅， 耿福能， 岳碧松， 范振鑫， *

1.生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610065； 2.藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川西昌615000； 3.四川省藥用動物工程技術(shù)研究中心，四川西昌615000)

美洲大蠊Periplanetaamericana屬昆蟲綱Insecta蜚蠊目Blattaria蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta，是人們熟知的衛(wèi)生害蟲，同時也是重要的藥用昆蟲。蜚蠊入藥早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為蟑螂具有活血散瘀、解毒消疳和利尿消腫的功效，還被廣泛應(yīng)用于治療疔瘡、腫毒及蟲蛇咬傷等方面。四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司在四川省西昌市建立了藥用美洲大蠊人工養(yǎng)殖基地，實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，成為國內(nèi)首家昆蟲類藥材——美洲大蠊GAP認(rèn)證養(yǎng)殖基地，用美洲大蠊制成的康復(fù)新液等多種藥物臨床應(yīng)用效果良好，特別是在治療人腔道潰瘍損傷和促創(chuàng)面修復(fù)等方面效果顯著。近年來，隨著對美洲大蠊及其提取物研究的不斷深入，其抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫及其對糖尿病和心血管疾病的效果也受到關(guān)注(肖小芹等，2007；馬俊等，2015；譚巧云等，2016；夏超等， 2016；陳佳松等，2017；李嬌等，2017；張蕊等，2017)。

有關(guān)美洲大蠊的研究，國外主要集中在美洲大蠊生物學(xué)、生態(tài)學(xué)習(xí)性、抗藥性及防治、生理生化及過敏原等方面(Ahmedetal.，2010；Kimetal.，2016；Tahiretal.，2017)。近年來，國內(nèi)的研究主要集中在化學(xué)成分分析、臨床應(yīng)用和藥用價值評估等方面(郭美仙等，2017；Yunetal.，2017；Zhaoetal.，2017)。隨著測序技術(shù)和基因組分析方法的飛速發(fā)展，大量動物、植物和微生物的基因組測序陸續(xù)完成，取得了豐碩的研究成果。到目前為止，還沒有美洲大蠊全基因組測序的研究報道。本文以人工繁殖的藥用美洲大蠊為材料，完成了全基因組測序、組裝和注釋，對進(jìn)一步從基因組水平闡釋美洲大蠊的遺傳進(jìn)化、生理生化、環(huán)境適應(yīng)及藥物研發(fā)等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 美洲大蠊樣品及DNA提取

測序用美洲大蠊樣品由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司在四川省西昌市的藥用美洲大蠊規(guī)范化封閉式人工養(yǎng)殖基地提供。在去除3只美洲大蠊雄性成蟲的翅膀、附肢和消化道并進(jìn)行表面消毒后，直接送杭州和壹基因科技有限公司建庫測序。

1.2 文庫構(gòu)建和測序

美洲大蠊DNA提取、文庫構(gòu)建和測序均由杭州和壹基因科技有限公司完成。共構(gòu)建了37個文庫，其中包括長片段文庫24個，插入片段大小分別為2 kb、5 kb、10 kb和20 kb；短片段文庫13個，插入片段大小分別為250 bp、500 bp和800 bp。采用二代測序平臺的Illumina HiSeq 2000和三代測序平臺的PacBio SMRT進(jìn)行高通量測序，原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后用于基因組組裝與質(zhì)量評估。

1.3 基因組組裝與質(zhì)量評估

利用Jellyfish(Mar?ais & Kingsford，2011)進(jìn)行k-mer統(tǒng)計(jì)分析，對基因組大小、雜合度和重復(fù)序列進(jìn)行評估。分別使用DISCOVAR(Weisenfeldetal.，2014)和BESST(Sahlinetal.，2014)構(gòu)建Contig序列和scaffold序列，并通過Soap Gapcloser(Luoetal.，2012)補(bǔ)缺得到更長的scaffold片段，最后利用三代測序數(shù)據(jù)補(bǔ)洞和延伸，完成基因組組裝。利用BUSCO(Sim?oetal.，2015)進(jìn)行單拷貝基因完整性分析，并使用bowtie2(Langmead & Salzberg，2012)將所有小片段序列比對回組裝好的基因組，以檢查基因區(qū)是否完整。最后，進(jìn)行GC深度分析，檢查組裝好的基因組中是否存在污染序列。

1.4 基因結(jié)構(gòu)與功能注釋

基因注釋采用Denovo結(jié)構(gòu)注釋、同源結(jié)構(gòu)注釋和基于轉(zhuǎn)錄本預(yù)測相結(jié)合的方法。Denovo結(jié)構(gòu)注釋是在屏蔽重復(fù)序列之后，用內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsisnevadensis和德國小蠊Blattellagermanica基因組信息訓(xùn)練Augustus(Stankeetal.，2008)和SNAP (Korf，2004)的預(yù)測模型；同源結(jié)構(gòu)注釋通過下載7種昆蟲的蛋白質(zhì)序列文件，利用TBLASTN比對到美洲大蠊基因組，最后利用GeneWise(Birneyetal.，2004)對可能的基因區(qū)域進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測；基于轉(zhuǎn)錄本預(yù)測是將美洲大蠊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過Blast比對回基因組，然后利用PASA(Haasetal.，2003)對基因進(jìn)行預(yù)測。最后利用EVidenceModeler(Haasetal.，2008)和Apollo(Lewisetal.，2002)進(jìn)行整合。用Blastp將翻譯的蛋白質(zhì)序列與3個非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot，KOG和NCBI NR)進(jìn)行比對，同時使用InterProScan(Hunteretal.，2008)完成美洲大蠊基因的功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 文庫構(gòu)建和測序

本研究共獲得小片段文庫測序850 Gb和大片段文庫測序2.1 Tb的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)質(zhì)量控制刪除后得到1.4 Tb的二代數(shù)據(jù)，覆蓋深度大約446×(表1)；同時還獲得約10×的三代數(shù)據(jù)，用于scaffold序列延伸(表2)。

2.2 基因組組裝與質(zhì)量評估

當(dāng)k=17時的k-mer分布如圖1。雙峰分布表明美洲大蠊基因組的雜合程度較高，所有的k-mer總數(shù)為173 392 497 379，峰值為54，計(jì)算得到美洲大蠊基因組的大小約為3.2 Gb，雜合率約為0.635%，屬于復(fù)雜基因組。

表1 美洲大蠊Illumina HiSeq 2000平臺測序Table 1 Genomic sequencing of Periplaneta americana by Illumina HiSeq 2000 platform

表2 美洲大蠊PacBio SMRT平臺測序Table 2 Genomic sequencing of Periplanetaamericana by PacBio SMRT

圖1 美洲大蠊基因組17 bp-mer分布圖Fig. 1 17 bp-mer distribution curve of Periplaneta americana genome

橫坐標(biāo)為17 bp-mer深度， 縱坐標(biāo)為該深度下的k-mer頻數(shù)所占比例

X-axis： 17 bp-mer depth， Y-axis： proportion of k-mer frequency

通過Denovo組裝，基因組大小為3.26 Gb，與預(yù)測基因組大小基本符合。組裝的Contig N50為28.2 kb，scaffold N50為315 kb(表3)。通過BUSCO評估顯示，單拷貝基因完整性為88.1%，小片段文庫比對率平均為99.8%，表明基因組的基因完整性較高(表4)。基因組GC含量為0.346，GC深度分析表明，美洲大蠊基因組GC含量分布在一個合理的范圍，沒有明顯的污染差異區(qū)域(圖2)。

表3 美洲大蠊基因組組裝Table 3 Statistics of Periplaneta americana genome assembly

表4 BUSCO基因完整性評估Table 4 Genome integrality based on BUSCO

圖2 美洲大蠊基因組GC含量深度分布Fig. 2 Correlation between GC content and sequencing depth in the genome of Periplaneta americana

2.3 基因結(jié)構(gòu)與功能注釋

在美洲大蠊基因組重復(fù)序列注釋中，共注釋到1 993.9 Mb的重復(fù)序列。其中，DNA轉(zhuǎn)座子最多，達(dá)到517 Mb，占基因組大小的16.18%，其次是LINE轉(zhuǎn)座子，達(dá)到436 Mb，SINE轉(zhuǎn)座子和LTR轉(zhuǎn)座子所占基因組的比例都比較小，只有1.8%左右。

在Denove預(yù)測中使用的3個軟件預(yù)測到的基因數(shù)差異較大(表5)，同源預(yù)測得到3.5萬個基因，而基于轉(zhuǎn)錄本預(yù)測到約23萬個基因。利用EVidenceModeler整合所有的預(yù)測結(jié)果，在去除僅有

Denovo證據(jù)支持的基因后，最終得到14 568個可信度較高的基因序列。

在預(yù)測的14 568個基因中，有13 464個基因能由4個數(shù)據(jù)庫(NR庫、KOG庫、Interpro庫和Swiss-Prot庫)獲得功能注釋(圖3)，注釋率達(dá)92.4%，能被4個數(shù)據(jù)庫同時注釋到的基因數(shù)為10 773個，占功能注釋基因總數(shù)的80.0%。

圖3 美洲大蠊基因功能注釋統(tǒng)計(jì)Fig. 3 Gene function annotations of Periplaneta americana

3 討論

隨著基因組學(xué)的飛速發(fā)展，完成基因組測序的動物越來越多，組裝的質(zhì)量也越來越高。已經(jīng)報道的昆蟲基因組大小變化很大，有的只有幾百兆，東亞飛蝗Locustamigratoria的基因組達(dá)6.5 Gb(Wangetal.，2014)，而本研究的美洲大蠊基因組為3.26 Gb?；蚪M的復(fù)雜程度也各不相同。美洲大蠊的基因組重復(fù)序列含量高、雜合度高，屬于復(fù)雜基因組，給測序和組裝帶來極大困難。盡管大大提高了文庫數(shù)量和測序量，并輔以三代測序方法，但美洲大

表5 3種方法預(yù)測的美洲大蠊基因數(shù)Table 5 Predicted protein-coding genes of Periplaneta americana using 3 methods

蠊基因組的組裝質(zhì)量還是不能與脊椎動物及其他簡單基因組相比。但與近年來完成的幾種昆蟲基因組相比，美洲大蠊基因組的組裝質(zhì)量較高(表6)，能夠滿足進(jìn)一步分析的要求。

目前公布的昆蟲基因組中，蜚蠊目昆蟲只有3種，即德國小蠊和2種白蟻：內(nèi)華達(dá)古白蟻和Macrotermesnatalensis。美洲大蠊是第一個完成基因組測序的大蠊屬昆蟲，對于進(jìn)一步研究大蠊屬昆蟲的起源進(jìn)化及藥用資源開發(fā)利用具有重要意義。

表6 7種昆蟲的基因組測序和組裝結(jié)果比較Table 6 Comparison of 7 insect genome sequences

注Notes： 1. Consortiumetal.， 2012， 2. Keelingetal.， 2013， 3. Geoffreyetal.， 2014， 4. Terraponetal.， 2014， 5. Wangetal.， 2014， 6. Chenetal.， 2015

致謝：感謝藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供美洲大蠊樣品，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司提供經(jīng)費(fèi)贊助。

陳佳松， 陳峰， 彭銳， 等. 2017. 基于轉(zhuǎn)錄組測序分析美洲大蠊提取物促進(jìn)小鼠創(chuàng)面愈合的分子機(jī)制[J]. 四川動物， 36(4)： 398-403.

郭美仙， 劉曉波， 劉光明， 等. 2017. 美洲大蠊提取物對H22腹水瘤小鼠腫瘤微環(huán)境的影響[J]. 大理學(xué)院學(xué)報，2(10)： 5-9.

李嬌， 郭美仙， 張冰清， 等. 2017. 美洲大蠊提取物CⅡ-3對肝癌H22荷瘤小鼠作用研究[J]. 中華腫瘤防治雜志，24(11)： 739-744.

馬俊， 曾遠(yuǎn)生， 劉煒. 2015. 美洲大蠊提取物對力竭運(yùn)動大鼠心血管氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志， 31(5)： 404-406.

譚巧云， 滿紅霞， 那凱歌， 等. 2016. 美洲大蠊提取物對口腔潰瘍大鼠模型的作用[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 32(11)： 1014-1016.

夏超， 王佳佳， 李芳群， 等. 2016. 美洲大蠊水提取物對免疫性肝纖維化大鼠的保護(hù)作用[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 51(2)： 199-204.

肖小芹， 汪世平， 徐紹銳， 等. 2007. 美洲大蠊提取物抗炎， 鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國病原生物學(xué)雜志， 2(2)： 140-143.

張蕊， 袁發(fā)璐， 李婷， 等. 2017. 美洲大蠊提取物對人肝癌HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志， 27(12)： 1-8.

Ahmed A， Minha K， Namood-e-Sahar，etal. 2010.Insilicoidentification of potential American cockroach (Periplanetaamericana) allergens[J]. Iranian Journal of Public Health， 39(3)： 109-115.

Birney E， Clamp M， Durbin R. 2004. GeneWise and genomewise[J]. Genome Research， 14(5)： 988-995.

Chen XG， Jiang XT， Gu JB，etal. 2015. Genome sequence of the Asian tiger mosquito，Aedesalbopictus， reveals insights into its biology， genetics， and evolution[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 112(44)： E5907. DOI:10.1073/pnas.1516410112.

Consortium THG， Kanchon KD， James RW，etal. 2012. Butterfly genome reveals promiscuous exchange of mimicry adaptations among species[J]. Nature， 487(7405)： 94-98.

Geoffrey MA， Patrick PA， Joanna EA，etal. 2014. Genome sequence of the tsetse fly (Glossinamorsitans)： vector of African trypanosomiasis[J]. Science， 344(6182)： 380-386.

Haas BJ， Delcher AL， Mount SM，etal. 2003. Improving the arabidopsis genome annotation using maximal transcript a lignment assemblies[J]. Nucleic Acids Research， 31(19)： 5654-5666.

Haas BJ， Salzberg SL， Zhu W，etal. 2008. Automated eukaryotic gene structure annotation using EVidenceModeler and the program to assemble spliced alignments[J]. Genome Biolology， 9(1)： R7.

Hunter S， Apweiler R， Attwood TK，etal. 2008. InterPro： the integrative protein signature database[J]. Nucleic Acids Research， 37(suppl_1)： D211-D215.

Keeling CI， Yuen MM， Liao NY，etal. 2013. Draft genome of the mountain pine beetle，DendroctonusponderosaeHopkins， a major forest pest[J]. Genome Biology， 14(3)： R27.

Kim IW， Lee JH， Subramaniyam S，etal. 2016.Denovotranscriptome analysis and detection of antimicrobial peptides of the American cockroachPeriplanetaamericana(Linnaeus)[J]. PLoS ONE， 11(5)： e0155304. DOI:10.1371/journal.pone.0155304.

Korf I. 2004. Gene finding in novel genomes[J]. BMC Bioinformatics， 5(1)： 59.

Langmead B， Salzberg SL. 2012. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2[J]. Nature Methods， 9(4)： 357-359.

Lewis SE， Searle S， Harris N，etal. 2002. Apollo： a sequence annotation editor[J]. Genome Biolology， 3(12)： research0082.1-82.14.

Luo R， Liu B， Xie Y，etal. 2012. SOAPdenovo2： an empirically improved memory-efficient short-readdenovoassembler[J]. Giga Science， 1(1)： 18.

Mar?ais G， Kingsford C. 2011. A fast， lock-free approach for efficient parallel counting of occurrences of k-mers[J]. Bioinformatics， 27(6)： 764-770.

Sahlin K， Vezzi F， Nystedt B，etal. 2014. BESST-efficient scaffolding of large fragmented assemblies[J]. BMC Bioinformatics， 15(1)： 281.

Sim?o FA， Waterhouse RM， Ioannidis P，etal. 2015. BUSCO： assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs[J]. Bioinformatics， 31(19)： 3210-3212.

Stanke M， Diekhans M， Baertsch R，etal. 2008. Using native and syntenically mapped cDNA alignments to improvedenovogene finding[J]. Bioinformatics， 24(5)： 637-644.

Tahir HM， Mustafa R， Khan AA，etal. 2017. Toxicity and resistance of American cockroach，PeriplanetaamericanaL.(Blattodea： Blattidae) against malathion[J]. African Entomology， 25(2)： 361-366.

Terrapon N， Li C， Robertson HM，etal. 2014. Molecular traces of alternative social organization in a termite genome[J]. Nature Communications， 5(6183)： 3636.

Wang X， Fang X， Yang P，etal. 2014. The locust genome provides insight into swarm formation and long-distance flight[J]. Nature Communications， 5(5)： 2957.

Weisenfeld NI， Yin S， Sharpe T，etal. 2014. Comprehensive variation discovery in single human genomes[J]. Nature Genetic， 46(12)： 1350-1355.

Yun JE， Hwang JS， Lee DG. 2017. The antifungal activity of the peptide， periplanetasin-2， derived from American cockroachPeriplanetaamericana[J]. Biochemical Journal， 474(17)： 3027-3043.

Zhao Y， Yang A， Tu P，etal. 2017. Anti-tumor effects of the American cockroach，Periplanetaamericana[J]. Chinese Medicine， 12(1)： 26. DOI： 10.1186/s13020-017-0149-6.