潘 杰， 周經(jīng)國， 劉 雷， 李玟珂， 譚 俊， 余順慧

(三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級重點實驗室/重慶三峽學(xué)院，重慶萬州 404100)

鉛是生物生長的非必需元素，土壤中過量的鉛污染會對中藥材造成毒害，降低產(chǎn)量。延胡索(Corydalisyanhusuo)，別稱元胡、玄胡索、玄胡，為罌粟科紫堇屬一年生草本植物，是常用的大宗藥材，在我國安徽、江蘇、浙江等地區(qū)廣泛栽培，其地下塊莖入藥，有行氣、活血、止痛的作用[1]。延胡索容易受鉛毒害，其傷害癥狀表現(xiàn)為生長緩慢、植株矮小等，產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響，并通過食物鏈對人類的健康造成威脅[2]。鉀是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，施鉀肥可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，許多研究表明[1-3]，施鉀肥可以提高中藥材產(chǎn)量和藥用品質(zhì)。近年來，研究土壤中重金屬含量對中藥材富集重金屬元素的影響較多[3-6]，但增施鉀肥對減少中藥材重金屬含量的研究較少。本研究以延胡索幼苗為試驗材料，研究在鉛污染土壤上增施鉀肥對延胡索幼苗生長、藥用品質(zhì)和食用安全性的影響，旨在為科學(xué)施肥提供理論依據(jù)，為延胡索經(jīng)濟高效、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的栽培模式提供理論參考和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2014年10月由浙江省東陽市農(nóng)業(yè)局提供的延胡索塊莖，經(jīng)處理后儲存于重慶三峽學(xué)院百安壩校區(qū)科研基地。從塊莖中各選取塊莖大小基本一致的地下塊莖備用。

供試藥品：鉀肥為K2SO4，鉛為Pb(NO3)2，均為分析純，均購自成都市高新區(qū)石羊化學(xué)制劑廠。

1.2 試驗設(shè)計

鉛處理濃度分別為0、100、300、500、600、700、900 mg/kg，鉀肥施用濃度(以K2O計)為0、100、200、400、800 mg/kg，每個處理3次重復(fù)。試驗采用內(nèi)徑30 cm、深25 cm的花盆，土壤樣品過2 mm篩后，每盆裝9 kg拌有對應(yīng)重金屬及鉀肥的土壤，放置15 d后再次混勻。將已消毒的延胡索塊莖播種于上述對應(yīng)花盆中，每盆5塊，同時施加適量的基肥(尿素濃度為N 300 mg/kg，磷酸鈣濃度為P2O5120 mg/kg)。定期檢查延胡索的生長情況，進(jìn)行常規(guī)人工管理，避免其他干擾。持續(xù)處理5個月，試驗過程中各處理除鉛、鉀肥濃度不同外，其余環(huán)境條件保持一致。

1.3 測定方法

1.3.1 生理指標(biāo)測定 采用蒽酮法測定可溶性糖含量[7]；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量[8]；采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性。

1.3.2 微核率測定 切取長度為5 mm的根尖制片鏡檢。根尖用改良Carnoy固定液固定20～24 h，轉(zhuǎn)移至70%乙醇中于0～4 ℃保存。加入1 mol/L鹽酸在60 ℃水浴下離解8～10 min直至根尖軟化，在避光條件下用改性石炭酸品紅浸泡染色2～3 h。用乙醇和蒸餾水漂洗后制片鏡檢觀察微核，計算微核率[9]。

1.3.3 鉛含量的測定 精確稱取0.200 0 g各樣品粉碎的延胡索，先加2 mL 0.1 mol/L的鹽酸靜置25 min，后加入酸液(濃HNO3與濃H2SO4體積比為4 ∶1)，同時設(shè)空白對照組；用MARS240微波消解系統(tǒng)消解以上溶液后[10]，用AA-6300原子吸收分光光度計測定樣品中的鉛含量[10]。

1.3.4 生物堿測定 延胡索塊莖生物堿類含量的測定采用張靜等的方法[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和分析采用Sigmapiot 10.0軟件。采用單因素方差分析方法(One-way ANOVA)檢驗不同處理之間的差異顯著性，其中，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉀肥對鉛污染土壤延胡索幼苗生長的影響

由圖1-a可知，土壤中未添加鉛時，隨著鉀肥濃度的增加，延胡索幼苗的株高呈先增加后減小的趨勢。當(dāng)土壤中鉛濃度≥100 mg/kg時，在各濃度鉛處理下，隨著鉀肥濃度的增加，延胡索幼苗的株高也呈先增后減的趨勢。株高最大時表示鉀肥對延胡索受到鉛抑制的緩解作用最大，且不同處理在株高最大時鉀肥的濃度相同。表明鉀肥存在最佳緩解濃度，鉀肥的最佳緩解濃度為200 mg/kg，此時的緩解作用最強。

由圖1-b可知，土壤中未添加鉛時，不同鉀肥濃度均使幼苗生物量增大；當(dāng)鉀肥濃度為200 mg/kg時，幼苗生物量達(dá)最大值。當(dāng)土壤中鉛濃度≥100 mg/kg時，鉀肥可以緩解鉛脅迫對延胡索植株生物量積累的抑制作用，使植株生物量增加。且在各鉛濃度脅迫下，均是在添加200 mg/kg鉀肥時緩解作用最強。

總之，鉀肥對鉛脅迫下延胡索幼苗生長的緩解作用存在最適緩解濃度，即存在最佳的鉀肥濃度，在最佳的鉀肥濃度下，其株高和生物量最大。

2.2 鉀肥對鉛污染土壤延胡索幼苗抗氧化特性的影響

由圖2可知，在未施用鉀肥時，隨著鉛濃度的增加，延胡索葉片可溶性糖含量、SOD活性及CAT活性呈先增大后減小的趨勢，且當(dāng)鉛的濃度為300 mg/kg時達(dá)到峰值；MDA含量和POD活性呈上升趨勢。施用200 mg/kg鉀肥時，當(dāng)鉛的濃度為 500 mg/kg 時，鉀肥使葉片可溶性糖含量、CAT活性及SOD活性顯著增加(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。這表明，當(dāng)鉛的濃度為500 mg/kg時，鉀肥緩解延胡索受鉛脅迫造成膜脂質(zhì)過氧化傷害是通過提高SOD、CAT活性來實現(xiàn)的；在其他各濃度的鉛處理下，鉀肥對延胡索葉片內(nèi)可溶性糖含量、MDA含量、CAT活性及SOD活性均無顯著影響。在各濃度的鉛處理下施加鉀肥，POD活性均顯著降低(P<0.05)，且穩(wěn)定?？赡苁氢浄释ㄟ^維持POD活性的相對穩(wěn)定而使延胡索植珠抵抗鉛脅迫。同時提高可溶性糖含量，降低MDA含量，以延緩葉片衰老，延長葉片的功能期[13]。

2.3 鉀肥對鉛污染土壤延胡索幼苗根部微核率的影響

微核率可以反映染色體的受損程度[14]。由圖3可知，未施用鉀肥時，幼苗根部微核率隨鉛濃度的升高而增加；與未施用鉀肥時相比，加入適宜濃度的鉀肥時，根部微核率隨著鉛濃度的增加均顯著減少(P<0.05)。說明施用鉀肥可以緩解鉛脅迫對延胡索幼苗根部染色體的損傷。

2.4 鉀肥對鉛污染土壤延胡索幼苗中鉛積累的影響

由圖4可知，未施用鉀肥時，幼苗地上部、地下部鉛含量隨著鉛濃度的增加而明顯增加；與未施用鉀肥時相比，添加200 mg/kg鉀肥與 500 mg/kg 鉛后，幼苗地上部分鉛含量降低12%，而地下部分鉛含量增加93%。表明施用鉀肥有效保護了幼苗期延胡索地上部分免受鉛脅迫的影響。

2.5 鉀肥、鉛脅迫對延胡索藥用品質(zhì)的影響

反映延胡索藥用品質(zhì)的主要指標(biāo)是延胡索乙素的含量，兩者呈正相關(guān)。由表1可知，與對照相比，在500 mg/kg鉛脅迫下，可顯著降低延胡索乙素的含量(P<0.05)，即延胡索藥用品質(zhì)降低。施用200 mg/kg鉀肥可以影響延胡索的藥用品質(zhì)。與500 mg/kg鉛脅迫相比，在500 mg/kg鉛脅迫下施用200 mg/kg鉀肥可以顯著增加延胡索乙素的含量(P<0.05)。

3 討論

鉀作為植物生長所必需的營養(yǎng)元素，它可以參與植物體內(nèi)的各種生理生化反應(yīng)，來維持植物的正常生理活動，促進(jìn)生長，減輕鉛的毒害作用[15]。已有研究發(fā)現(xiàn)，鉛+鉀肥處理小麥，可以促進(jìn)小麥幼苗干質(zhì)量的增加，即促進(jìn)小麥幼苗生長[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，施用鉀肥可以緩解鉛對延胡索幼苗生長的抑制作用。在各濃度鉛脅迫下，隨著鉀肥濃度的增加，延胡索幼苗株高和生物量均呈現(xiàn)先增后降的趨勢，表明鉀肥緩解鉛脅迫存在最適濃度。各濃度鉛脅迫下，鉀肥的最適濃度均為 200 mg/kg。由圖1-b可知，在鉛脅迫下，施用200 mg/kg鉀肥后延胡索幼苗的生長狀況均顯著好于受到單一鉛脅迫的對照，而且也好于其他濃度鉀肥與相同濃度鉛組合。鉀肥濃度過高或過低都不利于緩解鉛對植株的傷害。可能過低濃度的鉀處理具有較弱的緩解作用，而過高濃度的鉀處理加重了傷害(可能增大了溶液濃度進(jìn)而引起離子毒害和滲透脅迫)。

CAT也具有防止生物膜脂質(zhì)過氧化造成傷害的作用，它可以與SOD共同作用將H2O2分解為O2和H2O。本研究發(fā)現(xiàn)，CAT活性與SOD活性相似，在500 mg/kg鉛脅迫下，延胡索幼苗通過鉀肥提高CAT活性以降低鉛脅迫引起的過氧化傷害。

MDA是膜脂質(zhì)過氧化標(biāo)志性產(chǎn)物，其含量與膜脂質(zhì)過氧化呈正相關(guān)。本研究中，延胡索幼苗在500 mg/kg鉛脅迫下添加鉀肥后，MDA含量與對照相比顯著下降(P<0.05)，膜脂質(zhì)過氧化得到緩解。而低濃度鉛脅迫下，經(jīng)鉀肥處理后延胡索幼苗的MDA含量卻增加， 不能緩解膜脂質(zhì)過氧化，可能是鉀肥使POD活性維持在一個較低而穩(wěn)定的水平。

表1 鉀肥、鉛脅迫對延胡索藥用品質(zhì)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

鉛脅迫誘導(dǎo)植物根尖細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)受損[18]。研究表明，鉛脅迫誘導(dǎo)馬尾松根尖細(xì)胞產(chǎn)生染色體端部斷裂，進(jìn)而形成“后期橋”和斷片，有的則產(chǎn)生落后染色體，這些染色體斷片和落后染色體最終形成微核[18]。本試驗結(jié)果表明，在各濃度鉛脅迫下，與對照相比，添加鉀肥的幼苗的微核率顯著降低，表明鉀肥對鉛脅迫引起的染色體結(jié)構(gòu)損傷起緩解作用。

目前，降低作物對鉛吸收和積累的主要手段是用化學(xué)方法來緩解鉛毒害。前人研究表明，鉀肥對土壤中重金屬的影響主要表現(xiàn)在鉀肥伴隨陰離子影響重金屬形態(tài)、吸附解吸過程及生物有效性等方面，從而減少植物對鉛的吸收；鉀參與了鉛脅迫下小麥對鉛的吸收與轉(zhuǎn)移，大部分鉛停留在根部，少量向地上部遷移，從而緩解了地上部分的鉛毒害[15]。本研究的結(jié)果與之一致，施加鉀肥后，延胡索幼苗地上部鉛含量降低而地下部鉛含量增加，地上部的鉛毒害被緩解。鉀一直被公認(rèn)為是植物生產(chǎn)中的品質(zhì)元素。研究表明，施鉀肥不僅可以顯著提高中藥材產(chǎn)量，還可以改善其藥用品質(zhì)，因為它是生物體內(nèi)多種酶的活化劑，參與植物體內(nèi)的許多代謝過程，缺鉀會導(dǎo)致葉片內(nèi)新陳代謝過程紊亂。

反映延胡索藥用品質(zhì)的主要指標(biāo)是延胡索乙素的含量。本試驗在延胡索收獲時測定延胡索塊莖中延胡索乙素的含量，結(jié)果表明，與500 mg/kg鉛脅迫相比，添加200 mg/kg鉀肥可以增加延胡索乙素的含量，改善其藥用品質(zhì)。說明在鉛脅迫下，添加適宜濃度的鉀肥有利于延胡索乙素的合成?？赡艿脑蚴氢浥c鉛結(jié)合形成復(fù)合物或拮抗鉛，減少植物對鉛的吸收；促進(jìn)了延胡索塊莖鉛向地上部分轉(zhuǎn)移，減少了塊莖中鉛的含量，從而緩解了塊莖中鉛脅迫對次生代謝產(chǎn)物——延胡索乙素合成的影響，延胡索乙素含量增加，藥用品質(zhì)得到改善。因此，在鉛脅迫下，添加200 mg/kg鉀肥可以使延胡索的藥用品質(zhì)得到改善。

4 結(jié)論

(1)鉀肥可以緩解鉛脅迫對延胡索幼苗的毒害效應(yīng)，且鉀肥處理存在最適濃度效應(yīng)。鉀對鉛脅迫下延胡索的生長均具有較好的促進(jìn)作用。

(2)適宜濃度的鉀肥影響鉛脅迫下延胡索幼苗的抗氧化特性。添加適宜濃度鉀肥與500 mg/kg鉛處理，可以提高延胡索幼苗葉片SOD、CAT的活性，穩(wěn)定POD的活性，使鉛造成的過氧化脅迫降低，膜脂質(zhì)過氧化傷害得到緩解。

(3)適宜濃度的鉀肥可以降低鉛脅迫造成的延胡索幼苗根部細(xì)胞的微核率，染色體損傷得到緩解。

(4)在500 mg/kg鉛脅迫下，適宜濃度的鉀肥可以使幼苗地上部鉛含量降低，地下部鉛含量增加，保護地上部分免受鉛毒害。

(5)施用適宜濃度的鉀肥可以顯著提高500 mg/kg鉛脅迫下收獲期延胡索的藥用品質(zhì)。在500 mg/kg鉛脅迫下，添加適宜濃度鉀肥可以顯著提高延胡索中延胡索乙素的含量(P<0.05)。

[1]余順慧，劉雙琳，方榮美，等. 銅污染對延胡索生長和銅積累的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(2)：133-136.

[2]陳 星，王小麗，吳潔寧，等. 鉛脅迫對狗牙根生理特性和鉛積累的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(1)：167-170.

[3]周守標(biāo)，李思亮. 重金屬污染下植物生理生態(tài)反應(yīng)及富集機制的研究進(jìn)展[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，30(3)：331-337.

[4]姚 慧，蔡慶生. 緩解植物重金屬脅迫傷害的途徑及其機理[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(1)：144-147.

[5]陳雪梅，姚 婧，王友保，等. 外源鉀對銅脅迫三葉草種子萌發(fā)與幼苗生長的影響[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，31(5)：464-468.

[6]李國軍，李 華，狄貞珍，等. 不同鉀水平對幼苗期玉米鉻的吸收和生理特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，28(11)：2246-2250.

[7]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[8]趙世杰，許長成，鄒 琦，等. 植物組織中丙二醛測定方法的改進(jìn)[J]. 植物生理學(xué)通訊，1994，30(3)：207-210.

[9]羅 劼，王偉浩，杜 智，等. 用根尖微核測定技術(shù)檢測重金屬鉻的毒性[J]. 科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2013(17)：70.

[10]余順慧，黃怡民，潘 杰，等. 銅脅迫對2種三峽庫區(qū)消落帶適生植物生長及銅積累的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27(3)：1196-1201.

[11]張 靜，周 濃，祁俊生，等. HPLC同時測定不同產(chǎn)地延胡索中的6種生物堿[J]. 華西藥學(xué)雜志，2016，31(4)：415-419.

[12]汪驄躍，王宇濤，曾琬淋，等. Ca2+和K+對擬南芥幼苗鎘毒害的緩解作用[J]. 植物學(xué)報，2014，49(3)：262-272.

[13]李向東，王曉云，張高英，等. 花生衰老進(jìn)程的研究[J]. 西北植物學(xué)報，2001，21(6)：1169-1175.

[14]閆志剛，王傳清，張愛寧，等. 用蠶豆根尖微核實驗分析水中鉻的遺傳毒性[J]. 山西化工，2011，31(2)：71-74.

[15]王小晶，陳 怡，唐 靜，等. 鉀肥對鉛污染土壤白菜生長及品質(zhì)的效應(yīng)[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2016，32(2)：315-319.

[16]陳 蘇，孫麗娜，孫鐵珩，等. 鉀肥對鉛的植物有效性的影響[J]. 遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2007，26(2)：285-288.

[17]趙士誠，孫靜文，馬有志，等. 鎘對玉米幼苗活性氧代謝、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性及其基因表達(dá)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(10)：3025-3032.

[18]吳若菁，莊 捷，陳清松，等. 鉛脅迫下馬尾松微核率與生理指標(biāo)變化的相關(guān)分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2010，46(8)：78-83.