梁文潔， 張 麗， 郭新勇， 王愛英， 向本春， 祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

全世界薄荷屬植物(MenthaL.)約有30種，140多個(gè)變種，其中有20多個(gè)變種在世界各地栽培[1-2]。我國(guó)約有12種，其中6種為野生品種，其余為引進(jìn)栽培品種[3]。薄荷屬植物常見的栽培種有薄荷(M.haplocalyxBriq.)、留蘭香(M.spicataL.)、椒樣薄荷(M.piperitaL.)、唇萼薄荷(M.pulegiumL.)、水薄荷(M.aquaticaL.)及檸檬留蘭香(M.citrataL.)等。結(jié)合本種形態(tài)特征和地理分化趨勢(shì)，可將薄荷劃分為兩大種群且作為2個(gè)種處理，即歐洲、西亞及北美地區(qū)的薄荷種群，用學(xué)名M.arvensisL.，東亞及熱帶亞洲的薄荷種群，用學(xué)名M.haplocalyxBriq.。

薄荷屬植物是一種用途廣泛的中藥材，也是世界上主要的香料植物之一[4-6]。薄荷屬植物種間雜交十分普遍，有性繁殖極易造成品種混雜，難以區(qū)分。一般都采用無性繁殖，但長(zhǎng)期采用無性繁殖，導(dǎo)致病毒病十分普遍，引起品種的退化和產(chǎn)量、質(zhì)量的下降。通過組織培養(yǎng)可以對(duì)植株進(jìn)行脫毒復(fù)壯，并且可以保持植物優(yōu)良性狀遺傳的穩(wěn)定性，防止品種過快退化[7]。組織培養(yǎng)技術(shù)還可以用來進(jìn)行薄荷的誘變育種和種質(zhì)保存，如方曉志等在組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行了薄荷化學(xué)試劑和射線輻射誘變育種技術(shù)的研究，獲得了多個(gè)薄荷株系[8]；Hirai等利用留蘭香組培苗的腋芽低溫貯藏，尋找到一種新的種質(zhì)資源保存方法[9]。組織培養(yǎng)技術(shù)在薄荷屬植物的生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛。雖然針對(duì)薄荷屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究在國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道[10-12]，但在某些技術(shù)環(huán)節(jié)方面還存在一些限制因素，如外植體的污染、褐變、組培苗玻璃化現(xiàn)象以及病毒檢測(cè)等。

本試驗(yàn)以薄荷莖段為外植體，建立高再生率的薄荷離體培養(yǎng)植株再生體系，確定草甘膦篩選的選擇壓，并將帶除草劑標(biāo)記的植物表達(dá)載體pBI121-Ubi-epsps通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化薄荷，用PCR和RT-PCR法對(duì)轉(zhuǎn)化薄荷進(jìn)行分子鑒定。獲得能夠耐受除草劑的轉(zhuǎn)基因薄荷，該試驗(yàn)對(duì)后期雜種優(yōu)勢(shì)的利用、種質(zhì)資源的保存以及植物新品種的培育奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論與實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

薄荷苗、pBI121-Ubi-epsps農(nóng)桿菌菌株均由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 分子生物學(xué)試驗(yàn)材料

TaqDNA Polymerase、DNAsecure Plant Kit及普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購(gòu)自于北京天根生化科技有限公司；引物合成、序列測(cè)定由北京華大基因科技股份有限公司完成；其他試劑均為分析純。

1.3 薄荷除草劑耐受性分析

設(shè)置不同濃度梯度的草甘膦濃度(0、5、10、15 mg/L)，并將薄荷莖段接種到不同濃度梯度(100 mL MS中含草甘膦0、50、100、150 μL)的分化篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d觀察篩選結(jié)果。

1.4 薄荷的遺傳轉(zhuǎn)化

剪取薄荷無菌苗的莖段，在預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pBI121-Ubi-epsps整合進(jìn)薄荷基因組中，莖段侵染后接種于鋪有濾紙的共培養(yǎng)基(MS+100 mg/L AS)上暗培養(yǎng)3 d，之后轉(zhuǎn)接到延遲篩選培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+300 mg/L Cb)中培養(yǎng)4～5 d。然后，在選擇培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+300 mg/L Cb+10 mg/L PPT)中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)抗性叢生芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，切取分別放入生根培養(yǎng)基(1/2MS+1.0 mg/L NAA+300 mg/L Cb+10 mg/L PPT)中誘導(dǎo)生根。待根系長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)移栽至花盆。

1.5 薄荷的分子檢測(cè)

采用CTAB法[13]提取薄荷葉片基因組總DNA，以pBI121-Ubi-epsps質(zhì)粒為陽性對(duì)照，野生型薄荷的DNA為陰性對(duì)照，PCR檢測(cè)目標(biāo)基因。用TRNzol法[13]提取陽性植株的總RNA，以pBI121-Ubi-epsps質(zhì)粒為陽性對(duì)照，相應(yīng)的野生型薄荷為陰性對(duì)照，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白薄荷抗除草劑耐受性分析結(jié)果

以0、5、10、15 mg/L的草甘膦濃度梯度對(duì)薄荷莖段進(jìn)行培養(yǎng)。由圖1可知，在草甘膦濃度為10 mg/L的情況下，薄荷莖段的生長(zhǎng)是最好的。所以草甘膦濃度為10 mg/L時(shí)最適宜。

2.2 薄荷的遺傳轉(zhuǎn)化

經(jīng)過鑒定為陽性pBI121-Ubi-epsps的載體通過莖段法轉(zhuǎn)化普通野生型薄荷。侵染后培養(yǎng)2 d，將其轉(zhuǎn)接到篩選分化培養(yǎng)基上進(jìn)行芽分化，10～15 d莖段兩端長(zhǎng)出黃綠色的愈傷組織(圖2-A)，延遲培養(yǎng)30～50 d，莖段兩端分化長(zhǎng)出不定芽(圖2-B)。待不定芽生長(zhǎng)到2～3 cm后剪下不定芽，將其插入到篩選生根培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)。其中一部分不定芽白化，繼續(xù)培養(yǎng)會(huì)死亡，這部分為逃逸芽；還有一部分出現(xiàn)白綠各半的現(xiàn)象，這部分為嵌合體；最后一部分在篩選培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，為轉(zhuǎn)化植株(圖2-C)。將篩選出的轉(zhuǎn)化植株移至生根培養(yǎng)基上，待正常轉(zhuǎn)化的植株生長(zhǎng)到株高8～10 cm、根長(zhǎng)2～4 cm時(shí)(圖2-D)，提取該轉(zhuǎn)化薄荷的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。將檢測(cè)為陽性的植株移栽至高20 cm、直徑18 cm的花盆中，在光照度10 000 lx、光照16 h、黑暗8 h、溫度26 ℃、相對(duì)濕度70%的培養(yǎng)室生長(zhǎng)，并挑選生長(zhǎng)相似的普通野生型薄荷種植在相同條件下培養(yǎng)觀察(圖2-E)，一直培養(yǎng)至開花(圖2-F)。

2.3 pBI121-Ubi-epsps對(duì)薄荷的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)

CTAB法提取薄荷基因組總DNA，在PCR過程中，要分別以植物表達(dá)載體為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作陽性對(duì)照，野生型植株基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系中均能擴(kuò)增出目的片段，野生型薄荷中未能擴(kuò)增出目的片段的條帶，說明目的基因完全插入薄荷基因組DNA(圖3、圖4)。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)薄荷抗除草劑耐受性的分析，結(jié)果表明草甘膦濃度為10 mg/L時(shí)是最適宜的。導(dǎo)入外源抗除草劑基因是培育抗除草劑植株新品種的有效途徑，本試驗(yàn)將抗除草劑基因應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)作物中，為改良作物的品種以及保持優(yōu)良品種的優(yōu)勢(shì)奠定基礎(chǔ)。

隨著植物分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展及其研究水平的不斷提高， 必將有助于我們了解植物雄性不育。對(duì)于植物雄性不育的研究，不要僅從單一的生理生化方面進(jìn)行研究，應(yīng)該和分子生物學(xué)等相結(jié)合，更加全面地研究其發(fā)生機(jī)理。相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，將進(jìn)一步深化植物雄性不育的研究，揭示其發(fā)生機(jī)理，選育出綜合性狀更加優(yōu)良的不育系，充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)。

草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型的優(yōu)秀除草劑，其殺草機(jī)理是抑制植物必需氨基酸合成途徑中5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成的活性，從而使雜草致死。但在其應(yīng)用過程中，對(duì)普通農(nóng)作物同樣具有非選擇性的毒殺作用，植物中epsps合成酶的過量表達(dá)或某些活性位點(diǎn)氨基酸的突變對(duì)高劑量的草甘膦有較強(qiáng)的耐受性。近年來，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用得到了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

本試驗(yàn)中將抗除草劑基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化薄荷，為改良作物的品種以及保持優(yōu)良品種的優(yōu)勢(shì)奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)是以具有商業(yè)價(jià)值的薄荷為材料，將構(gòu)建好的帶有除草劑標(biāo)記的植物表達(dá)載體pBI121-Ubi-epsps轉(zhuǎn)化薄荷，獲得轉(zhuǎn)基因薄荷植株，導(dǎo)入外源抗除草劑基因是培育抗除草劑植株新品種的最有效途徑，該方法大大節(jié)省了人力以及財(cái)力等，具有更強(qiáng)的實(shí)用性。期望通過本試驗(yàn)最終為創(chuàng)造具有商業(yè)推廣前景的作物提供一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。

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