孫 羽，何 燕，彭星辰(四川大學(xué)華西醫(yī)院頭頸部腫瘤科，四川 成都 610041)

Parkin基因是在帕金森病的研究中被鑒定出來，近期的研究顯示Parkin在多種腫瘤中發(fā)生缺失和突變[1，2]，如宮頸癌(5.6%)、結(jié)腸直腸癌(2.4%～5.6%)、胃癌(4.6%)、皮膚黑色素瘤(3.5%)、肺腺癌(2.7%～3.1%)和子宮內(nèi)膜樣癌(2.1%)[3，4]。Parkin的缺失和突變會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，提示Parkin為抑癌基因。目前多數(shù)關(guān)于Parkin與肺癌關(guān)系的研究是通過動物實驗來實現(xiàn)，使用人類組織標(biāo)本進(jìn)行的研究偏少[3～6]。在本研究中，我們通過檢測Parkin在肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平，分析其與肺鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，初步揭示Parkin在肺鱗狀細(xì)胞癌中的作用。

1 材料與方法

1.1材料收集2016年1月至2017年1月在我院行手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理確診為肺鱗狀細(xì)胞癌的60例患者的手術(shù)病理標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①為單純肺鱗狀細(xì)胞癌的患者，未合并其他的惡性腫瘤；②符合臨床診斷及病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男50例，女10例，年齡(57.5±12.5)歲，高、中、低分化的患者各20例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者31例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移13例。試劑及儀器:Parkin抗體(Santa Cruz sc-32282，Santa Cruz Biotechnology)；石蠟切片機(jī)(LEICA RM2255)；電熱恒溫干燥箱(GZX-DH.300BS-Ⅱ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；低溫生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，染色機(jī)(Leica.Autostainer XL 四川泰運(yùn)醫(yī)療器械有限公司)。

1.2方法將在病理科收集到的標(biāo)本的石蠟塊，進(jìn)行連續(xù)切片，片厚約3.5 μm，常規(guī)HE染色用自動染色機(jī)(Leica.Autostainer XL)染色。免疫組織化學(xué)染色(為二步法)：在70 ℃的烤箱中放置石蠟切片1 h；切片脫蠟：依次放入三瓶二甲苯中，每瓶浸泡10 min，再依次放入95%、95%、80%的乙醇中，每瓶浸泡2 min；依次用自來水和蒸餾水沖洗，每次20秒，用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min；用高溫高壓法修復(fù)組織：用高壓鍋加熱EDTA PH8修復(fù)液，將切片放入沸騰的修復(fù)液中，待高壓鍋閥門噴氣開始計時，修復(fù)時間持續(xù)3 min；用流水沖洗已停止噴氣的高壓鍋，為其降溫，再在室溫中靜置15 min；用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min；為清除內(nèi)源性過氧化物酶，將切片浸泡在3%過氧化氫水溶液中5 min；8)用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min；擦干切片組織周圍的液體，滴加一抗；放入4 ℃冰箱內(nèi)過夜；用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min，甩掉一抗；滴加聚合物增強(qiáng)劑(流程及要求同之前的一抗)，室溫下孵育15～20 min；用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3 min；進(jìn)行DAB顯色，顯色時間5 min左右；用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，持續(xù)時間為30秒；分化、返藍(lán)，并隨機(jī)抽取幾張切片鏡下觀察；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中心樹膠封片。

1.3免疫組化的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)在高倍光學(xué)顯微鏡下(×100倍)觀察切片組織染色情況，組織的染色強(qiáng)度為0～3(即不存在、輕度、中度和強(qiáng)烈)；被染色細(xì)胞的百分比也被得分為0～3分(即0分0%～5%；1分6%～25%；2分26%～50%；3分51%～100%)，Parkin蛋白染色分?jǐn)?shù)=組織的染色強(qiáng)度評分分?jǐn)?shù)×被染色細(xì)胞百分比的評分分?jǐn)?shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)分析。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計量資料，多組樣本比較采用非參數(shù)的方差分析，兩兩間的比較采用的非參數(shù)t檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同分化程度的癌組織的Parkin表達(dá)在高、中、低分化的肺鱗狀細(xì)胞癌的組織切片中Parkin蛋白的染色分?jǐn)?shù)分別為(6.100±1.410)、(2.800±1.642)及(1±1.076)，三組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.0001)，肺鱗癌的分化程度越低，Parkin蛋白的染色分?jǐn)?shù)越低。

圖1 肺鱗狀細(xì)胞癌組織的病理染色(×100)a：高分化組的Parkin染色；b：中分化組的Parkin染色；c：低分化組的Parkin染色；d：高分化組的HE染色e：中分化組的HE染色；f：低分化組的HE染色。

2.2在肺鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶中Parkin表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組及陰性組中，Parkin蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)分別(1.677±1.701)，(5.103±2.059)，t=7.046，df=58。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的Parkin蛋白在原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.0001)。

2.3在肺鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶中Parkin染色分?jǐn)?shù)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系在存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組及不存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中，Parkin蛋白在肺鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶中染色分?jǐn)?shù)分別為(0.462±0.776)，(4.170±2.190)，t=5.971，df=58。存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的Parkin蛋白在原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)明顯低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.0001)，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的Parkin蛋白在原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)明顯低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組。

圖2 在高倍光學(xué)顯微鏡下(*100倍)肺鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶中Parkin的免疫組化染色分?jǐn)?shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。a：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組；b：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組。

圖3 在高倍光學(xué)顯微鏡下(*100倍)肺鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶中Parkin的免疫組化染色分?jǐn)?shù)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系。a：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組；b：無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組。

3 討論

我國肺癌的發(fā)病率及死亡率久居惡性腫瘤的第一位[7]。近些年針對肺癌治療方面的研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織亞型中存在可治療的分子靶點，針對這些靶點已經(jīng)獲準(zhǔn)生產(chǎn)的藥物，在治療晚期肺癌上已取得令人矚目和興奮的進(jìn)展[8，9]。但遺憾的是目前針對肺鱗狀細(xì)胞癌或小細(xì)胞肺癌還沒有發(fā)現(xiàn)可治療的分子靶點[10]。而肺鱗狀細(xì)胞癌又是肺癌中最常見的一種類型。發(fā)掘可用于藥物研發(fā)的肺鱗狀細(xì)胞癌新型生物靶點，將具有非常重要的意義。

目前多數(shù)研究是通過動物實驗來闡明Parkin與肺癌的關(guān)系，使用人類組織標(biāo)本的研究偏少[3～6]。本課題通過免疫組化檢測Parkin在人肺鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平，分析其與肺鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，初步揭示Parkin在肺鱗狀細(xì)胞癌中的作用。本研究結(jié)果顯示肺鱗狀細(xì)胞癌的分化程度越低，Parkin蛋白的染色分?jǐn)?shù)越低；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的Parkin蛋白在原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組；存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的Parkin蛋白在原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)明顯低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組。

既往的研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中頻繁發(fā)生Parkin的缺失或突變[1，2]。如Poulogiannis等將敲除Parkin的3號外顯子的老鼠與APC/min的老鼠進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)腸道腺瘤的發(fā)病率升高及腺瘤發(fā)生時間提前[11]。Fujiwara等通過敲除Parkin的3號外顯子繁育出Parkin-/-的小鼠，與野生型小鼠相比，Parkin小鼠更容易發(fā)生原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)[12]。Sun等利用小分子的干擾RNA(siRNAs)來抑制了小鼠細(xì)胞內(nèi)的Parkin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Parkin表達(dá)的缺失刺激了胰腺癌細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散[13]。上述研究均表明Parkin具有抑制腫瘤的功能，支持本課題的觀點。

綜上所述，肺鱗狀細(xì)胞癌的分化程度越低，Parkin蛋白的染色分?jǐn)?shù)越低；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的Parkin蛋白在原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組；存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的Parkin蛋白在原發(fā)灶中的染色分?jǐn)?shù)明顯低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組。揭示了Parkin可能可以抑制肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展，為Parkin基因治療在肺鱗狀細(xì)胞癌中的使用提供了基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)。

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