陳 杰，張劍波，汪智英，鮑錦庫(kù)(.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 60065；.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 6007)

流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(flow cytometer technology，F(xiàn)CT)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。至二十世紀(jì)七十年代世界第一臺(tái)流式細(xì)胞儀問(wèn)世以來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展從未停息。隨著科技的發(fā)展和新技術(shù)新方法的不斷應(yīng)用，靈敏度、精密度更高、分析速度更快、自動(dòng)化程度更高的流式細(xì)胞儀不斷推出，流式細(xì)胞儀已成為臨床檢測(cè)和科學(xué)研究中不可或缺的檢驗(yàn)工具[1]。

近年來(lái)，國(guó)產(chǎn)流式細(xì)胞儀發(fā)展迅猛，不僅配置與進(jìn)口品牌主流機(jī)型相當(dāng)，而且智能化、自動(dòng)化程度均有所超越。國(guó)產(chǎn)流式細(xì)胞儀大多采用體積法進(jìn)行絕對(duì)值計(jì)數(shù)，相對(duì)于微球法成本更低。深圳邁瑞公司生產(chǎn)的BriCyte E6型流式細(xì)胞儀是國(guó)產(chǎn)流式細(xì)胞儀的一個(gè)代表，配置488 nm和638 nm雙固態(tài)激光器，六色熒光檢測(cè)通道，利用流量傳感器定量樣本體積進(jìn)行絕對(duì)值計(jì)數(shù)。Cytomics FC500型流式細(xì)胞儀是貝克曼庫(kù)爾特公司的主流機(jī)型之一，配置488 nm和638 nm雙氣態(tài)激光器，五色熒光檢測(cè)通道，利用Flow-Count熒光微球進(jìn)行絕對(duì)值計(jì)數(shù)。本研究以T淋巴細(xì)胞亞群分析為例，對(duì)E6和FC500兩臺(tái)流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)的相關(guān)性、一致性及精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2016年10月至2017年2月在四川省人民醫(yī)院做T細(xì)胞亞群分析的患者202例。其中男111例、女91例，年齡(39.2±26.5)歲。包括感染性疾病、自身免疫性疾病等患者及健康體檢者，空腹采集3 ml靜脈血于肝素鋰抗凝真空采血管中，室溫(18～25 ℃)保存，6 h以內(nèi)完成檢測(cè)。精密度實(shí)驗(yàn)使用Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Immuno-Trol cells質(zhì)控血，4 ℃保存。

1.2儀器與試劑BriCyte E6流式細(xì)胞儀為深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)，配套試劑邁瑞T淋巴亞群檢測(cè)四色試劑CD45-PerCP/CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE、Supra Rainbow Fluorescent Particl質(zhì)控微球、Mindray流式細(xì)胞儀用溶血?jiǎng)┖颓室?。Cytomics FC500流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司生產(chǎn)，配套試劑有T淋巴亞群檢測(cè)四色試劑CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-PE/CD3-PC5、Flow-Check 微球、Flow-Set微球、Flow-Count熒光微球、溶血素OptiLyse C和鞘液。

1.3方法

1.3.1樣本處理及上機(jī)檢測(cè) BriCyte E6：取20μLCD45-PerCP/CD3-FITC/CD4-APC/CD8-PE抗體加入流式上樣管中，再用反向加樣法加入50 μl血樣標(biāo)本，混勻后室溫避光孵育20 min；加溶血素450 μl，震蕩混勻后室溫避光溶血15 min，充分混勻后1 h內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。儀器開(kāi)機(jī)后，打開(kāi)MRFlow軟件，使用儀器配套的Supra Rainbow Fluorescent Particl質(zhì)控微球自動(dòng)完成儀器質(zhì)控和調(diào)定檢測(cè)方案的電壓、補(bǔ)償。以CD45通道設(shè)閾值，輸入樣本稀釋比，采集5000個(gè)淋巴細(xì)胞后，軟件自動(dòng)設(shè)門分析得到CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞、CD3+CD8+細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞的百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)值。Cytomics FC50：取10 μlCD45-FITC/CD4-RD1/CD8-PE/CD3-PC5抗體加入流式上樣管中，再用反向加樣法加入100 μl血樣標(biāo)本，混勻后室溫避光孵育20 min；加溶血素OptiLyse C 500 μl，震蕩混勻后室溫避光溶血10 min；再加鞘液500 μl，用反向加樣法加入Flow-Count 熒光微球100 μl，充分混勻后1 h內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。儀器開(kāi)機(jī)后，打開(kāi)CXP軟件，使用Flow-Check和Flow-Set完成儀器質(zhì)控和PMT電壓調(diào)節(jié)。以CD45通道設(shè)閾值，采集5000個(gè)淋巴細(xì)胞后，手動(dòng)設(shè)門分析得到的CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞、CD3+CD8+細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞的百分比，輸入Flow-Count熒光微球的濃度后軟件換算出各群細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)值。

1.3.2精密度實(shí)驗(yàn) 批內(nèi)CV測(cè)定：使用Immuno-Trol cells質(zhì)控血分別用兩臺(tái)儀器在同一時(shí)間段內(nèi)連續(xù)加樣檢測(cè)20次；日間CV測(cè)定：使用Immuno-Trol cells質(zhì)控血在每天10：00分別用兩臺(tái)儀器各加樣檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)20天。

1.3.3質(zhì)量控制 所有實(shí)驗(yàn)均由同一名具有流式操作資格的實(shí)驗(yàn)人員完成。兩臺(tái)儀器每日進(jìn)行常規(guī)保養(yǎng)和儀器質(zhì)控，使用Immuno-Trol cells質(zhì)控血進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，并均通過(guò)衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Excel 2003和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果采用中位數(shù)表示。相關(guān)性分析采用線性回歸和多配對(duì)標(biāo)本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Friedman檢驗(yàn))，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性評(píng)價(jià)采用Bland-Altman法，繪制Bland-Altman圖的橫坐標(biāo)(Average)為(E6+FC500)/2，縱坐標(biāo)(Bias)為(E6-FC500)/((E6+FC500)/2)。

2 結(jié)果

2.1BriCyteE6和CytomicsFC500流式細(xì)胞儀的相關(guān)性和一致性

2.1.1T淋巴細(xì)胞亞群的百分比結(jié)果 兩儀器測(cè)得的CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞和CD3+CD8+百分比結(jié)果的判定系數(shù)R2均大于0.98，斜率在0.9～1.1，截距在-0.023～0.720，相關(guān)性良好(P< 0.05)。Bland-Altman分析顯示，兩儀器CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞、CD3+CD8+細(xì)胞百分比的偏倚在0.50%～2.28%，一致性界限范圍較窄。見(jiàn)表1和圖1。

表1 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群百分比結(jié)果的相關(guān)性分析 (%)

圖1 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群百分比的Bland-Altman圖a：CD3+細(xì)胞百分比結(jié)果；b：CD3+CD4+細(xì)胞百分比結(jié)果；c：CD3+CD8+細(xì)胞百分比結(jié)果

2.1.2T淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)值 兩儀器測(cè)得的CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞和CD3+CD8+絕對(duì)計(jì)數(shù)值的判定系數(shù)R2均大于0.98，斜率在0.8～1.0，截距在-35.271～17.116，相關(guān)性尚可(P< 0.01)。Bland-Altman分析顯示，兩儀器CD3+細(xì)胞、CD3+CD4+細(xì)胞，CD3+CD8+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)值的偏倚在12.21%～16.09%，一致性界限較寬。見(jiàn)表2和圖2。

表2 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)值的相關(guān)性分析 (個(gè)/μl)

圖2 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)值的Bland-Altman圖a：CD3+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)值；b：CD3+CD4+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)值；c：CD3+CD8+細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)值

2.2BriCyteE6和CytomicsFC500流式細(xì)胞儀精密度結(jié)果兩臺(tái)儀器的批內(nèi)CV小于日間CV，百分比CV小于絕對(duì)計(jì)數(shù)值CV，E6的CV小于FC500的CV，特別是兩儀器絕對(duì)計(jì)數(shù)值的日間CV，差異最大。見(jiàn)表3。

表3 BriCyte E6和Cytomics FC500 流式細(xì)胞儀測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)值的精密度結(jié)果

3 討論

流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)還未實(shí)現(xiàn)全程自動(dòng)化，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，影響最終結(jié)果的因素較多[2]。除了人為操作因素外，不同的儀器對(duì)結(jié)果的影響也不容忽視。不同流式細(xì)胞儀的結(jié)果存在差異[3]，實(shí)驗(yàn)室選擇何種儀器，不同儀器間結(jié)果是否具有可比性，是目前實(shí)驗(yàn)室面臨的問(wèn)題[4]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，E6和FC500百分比結(jié)果的相關(guān)性和一致性均較好，但兩者結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)?？赡苁怯捎谑褂貌煌膬x器和不同的配套試劑所致。不過(guò)，兩臺(tái)儀器均使用四色T淋巴細(xì)胞亞群抗體，以CD45/SSC設(shè)門，只要注意樣本的充分混勻、適合的樣本抗體比例、適當(dāng)?shù)碾妷貉a(bǔ)償和正確的設(shè)門分析等細(xì)節(jié)因素，兩臺(tái)儀器間百分比結(jié)果的差異是可以控制在較小范圍內(nèi)的。兩臺(tái)儀器的絕對(duì)計(jì)數(shù)值結(jié)果相關(guān)性尚可，但一致性較差。E6絕對(duì)計(jì)數(shù)值明顯高于FC500，主要原因可能是兩臺(tái)儀器不同的計(jì)數(shù)方法。E6使用的是流速校準(zhǔn)(flow rate calibratio)計(jì)數(shù)法，它是體積法的一種，其原理是利用流量傳感器精確測(cè)定樣本體積，從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)計(jì)數(shù)功能。FC500使用的是熒光參比微球計(jì)數(shù)法，即在檢測(cè)樣本中加入已知濃度的熒光參比微球(Flow-Count)，通過(guò)記錄目的細(xì)胞與微球的數(shù)量，經(jīng)軟件換算得到絕對(duì)計(jì)數(shù)值。對(duì)于基于這兩種不同計(jì)數(shù)方法儀器的比較，王維維等[5]也得到了類似結(jié)果，并建議保持儀器使用的延續(xù)性，避免因方法學(xué)不同給結(jié)果帶來(lái)的差異。

在精密度實(shí)驗(yàn)中，Immuno-Trol cells質(zhì)控血因穩(wěn)定性好，保存時(shí)間長(zhǎng)，能更準(zhǔn)確地觀察兩臺(tái)儀器的日間精密度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，兩臺(tái)儀器百分比結(jié)果的精密度接近，而絕對(duì)計(jì)數(shù)值的精密度E6明顯優(yōu)于FC500，特別是絕對(duì)計(jì)數(shù)值的日間精密度差異最大，探尋其原因可能還是主要源自于不同的計(jì)數(shù)方法?；隗w積法的E6，其計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)源于樣本前處理中加樣的準(zhǔn)確性，而基于微球法的FC500，人工操作環(huán)節(jié)更多，還要受熒光微球濃度的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等因素的干擾[6]。越來(lái)越多的研究數(shù)據(jù)表明，體積法的儀器要比微球法的儀器重復(fù)性更好，而且操作簡(jiǎn)單，利于推廣[7]。

E6消除了微球法儀器微球需混勻、長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)沉底、濃度不均一、對(duì)采集數(shù)量有要求等缺點(diǎn)。不過(guò)，E6需對(duì)樣本前處理中的移液量進(jìn)行精確控制并設(shè)置正確的稀釋比，而且還需要定期使用BD Trucount管對(duì)儀器進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)和定期對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn)。兩臺(tái)儀器的絕對(duì)計(jì)數(shù)法各有優(yōu)缺點(diǎn)，無(wú)論選擇何種儀器，實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格做好室內(nèi)質(zhì)控和參加室間質(zhì)評(píng)，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

目前，我國(guó)T淋巴細(xì)胞亞群分析還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化方案，選擇干擾因素更少、精密度更好的流式細(xì)胞儀能為臨床和科研提供更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。隨著流式前處理系統(tǒng)和智能分析軟件的廣泛應(yīng)用，甚至是全自動(dòng)流式細(xì)胞儀的研發(fā)上市，都將極大提高流式檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度，屆時(shí)，我國(guó)建立流式質(zhì)量控制體系和流式項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)化方案將指日可待。

[1] 趙嬋娟，袁粒星，童煜.流式細(xì)胞儀及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2016，14(22)：160-162.

[2] 吳麗娟，劉霞，趙文利.流式單平臺(tái)和雙平臺(tái)計(jì)數(shù)定量檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群的實(shí)驗(yàn)研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(2)：143-145.

[3] 黃春梅，郭野陳，倩劉定，等.不同流式細(xì)胞分析系統(tǒng)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果的影響[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34(5)：403-408.

[4] Whitby L，Whitby A，F(xiàn)letcher M，et al.Current laboratory practices in flow cytometry for the enumeration of CD4(+) T-lymphocyte subsets[J].Cytometry B Clin Cytom，2015，88(5)：305-311.

[5] 王維維，奚迪，袁向亮，等.不同流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的比較研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，39(5)：361-364.

[6] 胡曉蕾，周靈玲，趙志鋼.單系統(tǒng)與雙系統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù) T 細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)的比較[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，31(7)：593-598.

[7] 李君華.流式細(xì)胞儀絕對(duì)計(jì)數(shù)方法及其臨床應(yīng)用[J].國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，2016，39(6)：544-548.