成爭(zhēng)艷，雷龍春，王洪波，陳 星(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)，.病理科，.胸外科，四川 成都 610101)

食管癌在我國(guó)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。中國(guó)食管癌世界標(biāo)準(zhǔn)化死亡率為23.40/10萬(wàn)，占各種癌癥死亡的23.53%，僅次于肺癌、胃癌，居第三位。我國(guó)食管癌的發(fā)病率和死亡率居世界第一[1]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)食管癌的發(fā)生與內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族(inhibit of apoptosis family of protens，IAPs)的功能失調(diào)有關(guān)。這個(gè)家族有較廣泛的功能，包括參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞分裂過(guò)程、新陳代謝以及幫助機(jī)體適應(yīng)惡化緩解環(huán)境[2]。而生存素(survivin)是一個(gè)細(xì)胞凋亡抑制器基因家族的最小成員，也是唯一一個(gè)細(xì)胞凋亡抑制因子。它可通過(guò)影響caspase-9活性或抑制caspase-3中斷各類(lèi)因素引起的下游細(xì)胞凋亡共同通路抑制凋亡[3～5]；Smac由Du等[6]發(fā)現(xiàn)，特異性結(jié)合IAP，解除IAP對(duì)多種capase的活性抑制從而促凋亡。本研究著重探討食管鱗狀細(xì)胞癌與survivin以及smac之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料選擇四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)病理科2013年1月至2015年12月食管鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)切除標(biāo)本40例。其中高分化鱗狀細(xì)胞癌20例，中分化鱗狀細(xì)胞癌13例，低分化鱗狀細(xì)胞癌7例。并且取相應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣1.0 cm處黏膜組織)及正常組織(距腫瘤邊緣5.0 cm處黏膜組織，經(jīng)鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，平均年齡61.2歲(45～76歲)。

1.2方法

1.2.1主要試劑 Tunel試劑盒(Roche)，Survivin抗體(bioworld)，Smac抗體(R&D)，免疫組化試劑盒(北京中杉)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 每例標(biāo)本均行HE染色，經(jīng)兩位病理醫(yī)師閱片核實(shí)診斷后，采用Tunel法及免疫組化法分別檢測(cè)各組內(nèi)細(xì)胞凋亡及Survivin與Smac表達(dá)情況。

1.2.3結(jié)果判定 Tunel陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核出現(xiàn)濃縮碎裂狀棕黃色顆粒，計(jì)算5個(gè)400倍視野下細(xì)胞陽(yáng)性百分比，即為凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)值。Survivin與Smac陽(yáng)性也呈棕黃色顆粒狀，主要見(jiàn)于胞漿，偶見(jiàn)于胞核，采集圖像后用Image Pro6.0圖像分析系統(tǒng)分析，測(cè)量平均光密度值(IOD)，各組進(jìn)行比較。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用軟件包SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；各組內(nèi)表達(dá)的差異應(yīng)用重復(fù)測(cè)量的方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Spearman相關(guān)分析相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1三組凋亡指數(shù)AI的比較食管癌組織AI(%)值為(21.2±13.3)與癌旁組AI(%)值為(24.7±4.8)均明顯小于正常組AI(%)值為(46.5±14.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；食管癌組織與癌旁組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。圖1。

圖1 三組細(xì)胞凋亡情況 a：癌組織；b：癌旁組織；c：正常組織(×400)

2.2Survivin及Smac的表達(dá)癌組織顯著高于癌旁組織及正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，癌旁組織高于正常組織，但差異統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義(P>0.05)。Smac表達(dá)總趨勢(shì)為癌組織<癌旁組織<正常組織均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖2、3。

表1 3組細(xì)胞Survivin與Smac的平均光密度值(IOD)

與正常組比較，★P<0.05；與癌旁組織比較，●P<0.05

圖2 3組細(xì)胞中Survivin的表達(dá)情況 a：癌組織；b：癌旁組織；c：正常組織(×400)

圖3 3組細(xì)胞中Smac的表達(dá)情況 a：癌組織；b：癌旁組織；c：正常組織(×400)

2.3Survivin及Smac相關(guān)性分析癌組織中Survivin及Smac的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.412，P= 0.024)；在癌旁組織(r=0.446，P= 0.217)與正常組織(r=0.137，P= 0.563)表達(dá)無(wú)相關(guān)性。

3 討論

凋亡是細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下，受基因嚴(yán)格調(diào)控，遵循自身程序發(fā)生的死亡，主要包括接受凋亡信號(hào)、凋亡調(diào)控、caspase激活和級(jí)聯(lián)反應(yīng)、死亡底物活化劑細(xì)胞凋亡5個(gè)階段，眾多凋亡相關(guān)因子參與其中，如Survivin與Smac。Survivin為凋亡抑制因子家族中功能最強(qiáng)的因子，其病理機(jī)制在于對(duì)凋亡信號(hào)下游caspase-7與caspase-3產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，從而使癌細(xì)胞無(wú)限增殖分裂。該基因在正常細(xì)胞中表達(dá)率很低，幾乎不表達(dá)，癌細(xì)胞中陽(yáng)性率很高[7]，這與本次研究結(jié)果一致。Smac是一種促凋亡蛋白，又稱(chēng)為DIABLO蛋白，主要分布在細(xì)胞線粒體中，是線粒體內(nèi)除細(xì)胞色素C外激活caspase的第二個(gè)因子[8]。

研究表明，Survivin蛋白在很多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，所以過(guò)表達(dá)的Survivin蛋白具有致癌潛能，因而對(duì)其的研究也成為抗腫瘤的熱點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Smac蛋白的定位信號(hào)肽被切除，從而導(dǎo)致Smac蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，使Smac與Survivin特異性結(jié)合，從而解除Survivin蛋白對(duì)caspase的抑制作用，間接的促進(jìn)了caspase凋亡途徑的產(chǎn)生[9]。

本實(shí)驗(yàn)中癌組織和癌旁組織凋亡指數(shù)均明顯低于對(duì)照組，Survivin在癌組織和癌旁組織表達(dá)均明顯高于對(duì)照組。低凋亡的事實(shí)與Survivin高表達(dá)表現(xiàn)出得抑凋亡作用增強(qiáng)效應(yīng)一致，這表明Survivin高表達(dá)有效地抑制癌細(xì)胞的凋亡。此外，Smac的表達(dá)表現(xiàn)出與凋亡指數(shù)相同的趨勢(shì)且各組均差異顯著，低凋亡的事實(shí)與Smac低表達(dá)表現(xiàn)出的促凋亡作用減弱效應(yīng)一致，提示癌細(xì)胞對(duì)凋亡易感性的敏感度可能因Smac的低表達(dá)而降低。同時(shí)，Survivin與Smac在癌組織中表達(dá)存在明顯負(fù)相關(guān)，我們推測(cè)低表達(dá)的Smac可能直接或間接引起Survivin的高表達(dá)來(lái)抑制凋亡，使正常鱗狀細(xì)胞處于相對(duì)高增殖狀態(tài)；高表達(dá)的Survivin也可能直接或間接反作用于Smac促凋亡作用相關(guān)環(huán)節(jié)，使其受阻或停止，甚至引起Smac進(jìn)一步低表達(dá)，促凋亡能力進(jìn)一步減弱，抗凋亡能力相對(duì)增強(qiáng)。二者分別從抑凋亡和促凋亡角度調(diào)控凋亡狀態(tài)，可能具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)或相互拮抗關(guān)系，當(dāng)這種關(guān)系失衡時(shí)就可能導(dǎo)致凋亡程序紊亂甚至停滯，使得癌細(xì)胞持續(xù)處于相對(duì)低凋亡與高增殖狀態(tài)，有利于其癌細(xì)胞浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)移。

目前食管癌主要治療方式為手術(shù)及化療，但效果均不理想。本實(shí)驗(yàn)提示食管癌的發(fā)生和Survivin與Sma的凋亡調(diào)節(jié)失衡關(guān)系密切。已有學(xué)者以Survivin為靶點(diǎn)，采用反義核苷酸和RNA干擾等技術(shù)減輕或逆轉(zhuǎn)其抗凋亡作用[10，11]。還有學(xué)者采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Smac基因重組質(zhì)粒至目標(biāo)組織實(shí)現(xiàn)了Smac的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)其促凋亡作用[12]。雖然目前尚處于初步的實(shí)驗(yàn)研究階段，有關(guān)各種治療策略的療效需進(jìn)一步深入研究，但是可以預(yù)見(jiàn)，針對(duì)Survivin與Smac的靶向治療與其他促凋亡治療相結(jié)合，將能最大限度地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，還可彌補(bǔ)某些治療上的不足，收到更好的療效。

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